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Méthodes expérimentales en neurosciences > Visualisation de la structure du système nerveux > Flashcards

Visualisation de la structure du système nerveux Flashcards

1
Q

Pourquoi étudier la structure du système nerveux?

A
  • Générer des hypothèses concernant la fonction des différents neurones.
  • Savoir comment ils influencent les circuits neuronaux et comportementaux.
  • Détecter des anomalies cellulaires, des lésions ou des altérations structurelles qui peuvent être liées à des troubles neurologiques ou neurodégénératifs.
  • Comprendre le développement des neurones, y compris leur migration, leur différenciation et leur maturation au fil du temps.
  • Explorer des mécanismes cellulaires et moléculaires complexes à l’intérieur des cellules nerveuses.
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Q

Quelles sont les 4 grandes étapes de la préparation des tissus?

A

Fixation
Dissection
Enveloppement des tissus
Coupe des sections

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Q

Qu’est-ce que la fixation?

A

Utilisation des produits chimiques pour préserver, stabiliser, et renforcer l’échantillon pour en faire des analyses microscopiques.
* Préservation de la structure et de la localisation des antigènes
* Inactivation des enzymes pouvant dégrader les protéines
* Stabilisation des interactions antigène-anticorps
* Préservation de la morphologie cellulaire
* Amélioration de la durabilité des échantillons

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4
Q

Quels sont les 2 différents types d’agents pour fixer les tissus?

A

1- Des agents de cross-linking (ou agent de réticulation ou de pontage)
2-Des agents déshydratants

Le choix dépend des analyses à faire et des cibles choisies

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5
Q

Que sont les agents de cross-linking (ou agent de réticulation ou de pontage)?

A

Formation des liaisons covalentes
Les aldéhydes: formaldéhyde, paraformaldéhyde (PFA), glutaraldéhyde
Usage: microscopie photonique

Osmium tétroxyde (oxydation)
Usage: microscopie électronique

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6
Q

Que sont les agents déshydratants?

A

Perturbation des lipides, réduction de la solubilité des protéines
Exemples: Méthanol, acétone

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7
Q

Quels sont les modes de fixation?

A

Immersion: le tissu est immergé dans la solution de fixation
Le temps requis dépend de la taille/épaisseur du tissu

Perfusion transcardiaque: on utilise le système sanguin de l’animal pour fixer les tissus

Anesthésie (important +++)
Un accès est établi au système circulatoire, généralement par pénétration du ventricule gauche
Évacuation du sang : Une solution de « nettoyage », comme du PBS, est utilisée pour chasser complètement le sang du système circulatoire.
Perfusion de l’agent fixateur (même façon que le PBS)
Le fixateur pénètre dans les tissus et les fixe en préservant leur structure et leur morphologie.

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8
Q

Comment se fait la dissection?

A

Retirer le cerveau du crâne ou la moelle épinière.
Plus ou moins difficile si tissus frais ou fixé .
Tissus frais = très mou
Possibilité de microdisséquer les régions d’intérêt, si nécessaire.
La décision est basée sur le type d’analyses qui suivent.

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9
Q

Comment se fait la cryopréservation?

A

Le tissu est submergé dans une solution de 30% sucrose pour 48-72hr (minimum)
Attention, pas trop longtemps non plus !
Le sucrose remplace l’eau et le tissu coule dans le fond de la solution

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10
Q

Pourquoi l’étape de cryopréservation est importante?

A

L’eau peut endommager les tissus à la congélation

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11
Q

Quels sont les 4 types d’enveloppement?

A

Plastique
Paraffine
Optimal cutting temperature compound (OCT)
Gélatine

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12
Q

Quels sont les 2 principaux buts de l’étape d’enveloppement?

A

Stabiliser la structure du tissu
Faciliter les coupes

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13
Q

Comment peut-on faire la coupe de section? (3 manière)

A

Microtome
Cryostat
Vibratome

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14
Q

Expliquez la technique de coupe de section : Microtome

A
  • Congelé ou non-congelé
  • OCT, paraffine, plastique
  • Section moyenne: 25-100 µm
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15
Q

Expliquez la technique de coupe de section : Cryostat

A
  • Congelé
  • -20C à -30C
  • Section mince: 10-50 µm
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16
Q

Expliquez la technique de coupe de section : Vibratome

A
  • Lame vibrante
  • Non-congelé
  • Possibilité d’utiliser avec des tissus vivants – pour culture organotypique
  • Section épaisse: 100-400 µm
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17
Q

Quels sont les colorants du soma?

A

Colorants basophiles
* pH>8 (basique)
* Marque des molécules acides (ADN, ARN)
* Noyaux et ribosomes

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18
Q

Donnez des exemples non-fluorescents de colorants du soma

A
  • Cresyl violet (Nissl)
  • Hematoxyline (bleu/violet, souvent utilisé avec l’éosine)
  • Thionine
  • Bleu de méthylène

Les teintures Nissl préfèrent l’ARN (RER, ribosomes) qui est plus abondant dans les neurones

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19
Q

Que permet les colorants du soma?

A
  • L’examen de l’architecture cellulaire
  • La visualisation des aspects macroscopiques des régions distinctes du cerveau
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20
Q

Donnez es exemples de colorants du soma fluorescents

A

Marqueurs des noyaux par l’intercalation entre les spirales hélicoïdales de l’ADN
* DAPI
* Hoechst (bisbenzamide)
* Propidium iodide (PI)
* TO-PRO-3
Attention aux longueurs d’ondes d’émission !!

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21
Q

Comment se fait la coloration des fibres (myéline)?

A

Marque la myéline de la matière blanche
Souvent utilisé en combinaison avec des colorants basophiles sur des sections adjacentes
Attention: impossible d’identifier des fibres individuelles

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22
Q

Donnez des exemples de coloration des fibres

A

Coloration de Weil
Luxol Fast Blue (LFB)

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23
Q

Donnez un exemple de coloration des fibres fluorescent

A

FluoroMyelin

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24
Q

Qu’est-ce que la coloration de Golgi?

A

Marque complètement des neurones individuels et leurs processus
Les neurones sont marqués complètement (soma, axones*, dendrites)
C’est idéal pour visualiser les champs dendritiques
Seulement de 5 à 10% des cellules totales sont colorées
On ne peut pas contrôler quels neurones seront marqués
Utile dans les études de neurodégénérescence
*La coloration de Golgi ne marque pas toute l’axone. Il n’y a pas de marquage dans les axones myélinisés mais les axones terminaux et non-myélinisés peuvent être marqués.

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25
Q

Expliquez ce qu’est le marquage intracellulaire et juxta-cellulaire

A
  • Il est aussi possible de colorer les neurones in vivo et de faire les analyses histologiques après.
  • Ces marquages permettent d’étudier la localisation ou la distribution de certaines substances/molécules dans ou autour des neurones.
  • Permet aussi de faire le lien entre les structures et les zones du cerveau avec l’activité ou la fonction du neurone dans le cerveau
  • Le marquage intracellulaire consiste à introduire une substance ou une molécule spécifique à l’intérieur de la cellule nerveuse cible
  • Le marquage juxta-cellulaire consiste à appliquer une substance ou un marqueur autour des cellules nerveuses, généralement à proximité de leurs membranes cellulaires.
    Ex : Neurobiotine
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26
Q

Qu’est-ce que le marquage fluorescent?

A

Possibilité de modifier la génétique afin d’exprimer des protéines fluorescentes (GFP et variantes)
Fluorophores: Alexa488, Rhodamine, Cy5 , etc.
Possibilité de faire une amplification (i.e. Il n’y pas de relation 1:1)

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27
Q

Que sont les quantum dots?

A

Plus récent, c’est un autre type de fluorophore
Nanocristaux semi-conducteurs qui possèdent des propriétés optiques et électroniques uniques, dues à leur petite taille. Ils mesurent généralement entre 2 et 10 nanomètres (nm) de diamètre, ce qui leur confère des comportements différents de ceux des matériaux en vrac (macroscopiques) en raison des effets de confinement quantique.

28
Q

Comment fonctionnent les quantum dots?

A
  • Les quantum dots émettent de la lumière (fluorescence) lorsqu’ils sont excités par une source d’énergie.
  • La couleur de la lumière émise dépend directement de la taille des quantum dots.
  • Les plus petits dots émettent de la lumière bleue, tandis que les plus grands émettent de la lumière rouge.
  • Cette relation entre la taille et la couleur de l’émission de lumière est due au fait que l’énergie de la lumière émise dépend de la taille de la “boîte” dans laquelle les électrons sont confinés.
  • Contrairement à de nombreux colorants organiques ou fluorophores classiques, les quantum dots sont très résistants au photoblanchiment (perte de fluorescence avec le temps), ce qui les rend idéaux pour des applications nécessitant des signaux lumineux stables et durables (imagerie in vivo, par exemple).
29
Q

Comment se font les méthodes de marquage avec des sondes?

A

Une sonde (ex. anticorps ou brin antisens) n’est pas visible en elle-même.
-Doit être conjugué à un marquage qui peut être visible par lui-même
OU
-Peut être réactif avec d’autres produits chimiques pour rendre un produit visible

30
Q

Expliquez la méthode de marquage avec des sondes : Marquage chromogénique

A

Le marquage chromogénique est une technique utilisée pour visualiser la présence de biomolécules spécifiques (protéines, acides nucléiques). Cette méthode repose sur l’utilisation d’une enzyme, généralement liée à un anticorps ou une sonde, qui catalyse une réaction chimique pour produire un précipité coloré visible au microscope.

31
Q

Donnez des exemples de marquages chromogénique

A
  • Horseradish peroxidase (HRP) et 3,3’-Diaminobenzidine (DAB)
    Précipité brun/noir
  • Phosphatase alcaline et NBT/BCIP
    Précipité bleu foncé (autres couleurs possibles)
  • B-galactosidase et X-Gal
    Précipité bleu
32
Q

Quels sont les avantages du marquage chromogénique?

A
  • Facilité d’utilisation (pas d’équipements avancés requis, observation au microscope optique standard)
  • Durabilité des échantillons (stable dans le temps, possibilité de réimager plus tard)
  • Peu coûteux
  • Couramment utilisé (immunohistochimie et l’hybridation in situ)
33
Q

Quels sont les désavantages du marquage chromogénique ?

A
  • Sensibilité limitée (Moins sensible que d’autres méthodes, pas approprié pour les cibles présentes en faibles quantités)
  • Résolution limitée (le précipité peut masquer des structures, difficile de marquer plusieurs cibles en même temps
  • Diffusion (réduit la précision du marquage)
34
Q

Expliquez les propriétés de la méthode de marquage avec des sondes : La biotine

A
  • Soluble
  • Non-toxique
  • Iontophorèse facile de la biotine
    Livraison par un courant électrique comme on stimulerait un neurone
  • Reste dans la cellule
  • Possibilité de visualiser avec des marqueurs conjugués avec avidine (ou streptavidine), en microscopie photonique, fluorescente et électronique.
35
Q

Quels sont les avantages de la biotine?

A
  • Amplification du signal: En raison de la forte affinité entre la biotine et l’avidine/streptavidine, il est possible d’amplifier le signal en liant plusieurs molécules de rapporteur (ex. enzymes, fluorophores, etc.) à la cible.
    Sensibilité accrue
  • Polyvalence (système biotine avidine est très flexible, utilisation de plusieurs marqueurs)
36
Q

Quels sont les inconvénients de la biotine?

A
  • Non spécificité de l’avidine/streptavidine (Par exemple, l’avidine/streptavidine peut se lier non spécifiquement à des structures cellulaires comme les glycoprotéines endogènes, créant du bruit dans le signal)
  • Conjugaison en plusieurs étapes: Le processus est plus long et complexe que les marquages directs.
  • Problèmes de diffusion et d’accessibilité (La biotine est petite et peut parfois diffuser dans des structures cellulaires, l’avidine peut avoir du mal à accéder à certaines cibles)
37
Q

Expliquez la méthode de marquage par radioactivité

A

Implique l’utilisation d’isotopes radioactifs (comme le tritium, le soufre-35 ou le phosphore-32) pour détecter des molécules spécifiques dans les cellules, les tissus ou les échantillons biologiques.
* Réaction directe: marquage de 1:1
* Utile pour la localisation des récepteurs, la prolifération et le trafic des protéines
* Surtout utilisé pour le ISH

38
Q

Quels sont les avantages du marquage par radioactivité?

A
  • Très grande sensibilité (permet la détection de quantités extrêmement faibles de biomolécules)
  • Quantification précise: Le signal peut être quantifié de manière très précise à l’aide de compteurs à scintillation ou de films radiographiques.
  • Pas de photoblanchiment
39
Q

Quels sont les inconvénients du marquage par radioactivité?

A
  • Réglementation stricte et gestion des déchets et dangers pour la santé
  • Temps d’exposition long pour le développement des images
40
Q

Comment se fait le marquage par l’or colloïdal?

A
  • Matériel dense aux électrons
  • Possibilité de conjuguer avec un anticorps
  • Microscopie électronique
41
Q

Quels sont les avantages du marquage par l’or colloïdal?

A
  • Grande résolution (microscopie électronique = détection précise et localisée des molécules)
  • L’or est chimiquement stable et ne réagit pas avec les échantillons, ce qui permet d’obtenir des marquages très spécifiques.
  • Visualisation directe
42
Q

Quels sont les inconvénients du marquage par l’or colloïdal?

A
  • Coût élevé
  • Signal limité (pas d’amplification du signal possible)
  • Besoin de microscopie avancée
43
Q

Comment peut se faire la visualisation des gènes?

A

Hybridation in situ (sur place) aussi appelé ISH (ou FISH/GISH/…)
Méthode pour visualiser les acides nucléiques
Donc ADN et ARN sont possibles
Déterminer où un gène spécifique est exprimé
ATTENTION ! Il est impossible de savoir où la protéine fonctionnelle est exprimée dans la cellule.

44
Q

Comment se fait la détection de l’expression d’un gène par ISH-ARNm?

A
  • Il faut connaître la séquence génétique de l’ARNm !
  • Utilisation d’une sonde d’acide nucléique simple brin complémentaire à la séquence de de l’ARNm d’intérêt (antisens)
  • La sonde doit être marquée pour pouvoir la voir (nucléotides radioactifs, etc).
  • Incuber la sonde avec le tissu: la sonde ira s’hybrider avec notre ARNm d’intérêt
45
Q

Quels sont les étapes ISH?

A

1 - Probe DNA labeling –> Direct ou indirect labeling
2- Dénaturation
OU
3 - Blocking DNA fragmentation
4- Dénaturation

5- Addition de la mixture d’hibridization
6- Dénaturation de l’ADN chromosomique
7- Hybridation in situ
8- Blocking l’attachement ADN -> Unlabeled DNA detection
OU
8 - Labeled DNA attachment -> Probe detection

9- Microscopic view

46
Q

Qu’est-ce que le labeling direct vs indirect?

A

Le marquage direct utilise un fluorophore directement attaché à la sonde, tandis que le marquage indirect utilise des molécules qui nécessitent un détecteur secondaire
(comme un anticorps).

47
Q

Qu’est-ce que le blocking DNA?

A
  • Présence de sites non spécifiques dans l’échantillon où les sondes pourraient se lier, ce qui entraînerait un signal de fond indésirable.
  • Pour réduire cette liaison non spécifique, on ajoute du blocking DNA, une séquence d’ADN simple brin non complémentaire à la séquence cible. Le blocking DNA est en excès par rapport aux sondes spécifiques et occupe ainsi les sites non spécifiques potentiels dans l’échantillon.
  • Le blocking DNA ne garantit pas toujours une élimination complète du bruit de fond, et il peut être nécessaire d’optimiser sa concentration pour chaque type d’échantillon.
  • Si on fait un ISH avec ARN, on parle de blocking RNA.
48
Q

Expliquez les contrôles importants de ISH

A

Permet de s’assurer que tout signal observé est réellement dû à l’hybridation spécifique de la sonde et non à un bruit de fond ou à une liaison non spécifique.

Une sonde « sens », non complémentaire, (panel h sur l’image)
* Dans le gène d’intérêt (donc différent du blocking)
* Pas de signal attendu

Autres sondes faites pour des régions différentes du même gène/transcrit
* Permet d’avoir confiance dans ce qu’on voit
* Permet de visualiser les off target effect

Si on fait du FISH avec des anticorps, autres contrôles possibles.

49
Q

À quoi sert Allen Brain Atlas?

A

Cartographie du cerveau humain et de souris
Base de données d’expression génique
Modèles 3D interactifs
Outils de visualisation et d’analyse
Projet de connectivité cérébrale

50
Q

Par quoi peut se faire la détection des protéines?

A

Immunohistochimie (IHC)
Permet de détecter et visualiser la présence et la localisation de protéines spécifiques et autres biomolécules (ex. Oligosaccharides)

Avantage par rapport à d’autres méthodes: visualisation des protéines dans les structures subcellulaires (donc meilleure résolution spatiale)

Immunohistochimie: tissus
Immunocytochimie: cellules
Immunofluorescence: avec la détection fluorescente

Effectuée grâce à des anticorps (primaires et secondaires)

51
Q

Quelles sont les méthodes pour réaliser une IHC?

A

Protocole plus ou moins similaire si sur tissus ou cellules fixées
Tissus = agencement plus complexe

Préparation de l’échantillon (tel que vu au début du cours)
et étapes additionnelles, telles que la perméabilisation, le blocage, etc.

Anticorps primaire: spécifique pour la protéine ciblée
Toujours regarder les fiches d’anticorps!

Détection
* IHC directe: l’anticorps primaire est conjugué avec un fluorophore/enzyme chromogénique
* IHC indirecte: utilisation d’un anticorps secondaire conjugué avec un fluorophore/enzyme chromogénique
Amplification de signal: c’est quand plus d’un anticorps secondaire peut reconnaitre l’anticorps primaire

52
Q

Comment vérifier la spécificité de son anticorps?

A

Il ne faut pas faire systématiquement confiance à ce que disent les compagnies!
Très souvent demandé lors de la révision des articles scientifiques.

Contrôle positif: Un spécimen qui contient l’antigène connu

Contrôles négatifs:
* Un spécimen qui ne contient pas l’antigène connu (ex. souris KO)
* Préincubation de l’anticorps avec un antigène avant mise en présence du spécimen
S’il y a déplétion d’anticorps, c’est que l’anticorps est totalement associé à sa cible (donc spécifique)
* IHC indirecte: un spécimen incubé sans l’anticorps primaire mais seulement avec l’anticorps secondaire
Vérification qu’il n’y a pas d’association non-spécifique

53
Q

Par quels facteurs le signal du protocole d’IHC peut-il être affecté?

A
  • Qualité de l’échantillon
  • Méthode de fixation (et le temps)
  • Concentration d’anticorps (primaire et secondaire)
  • Nature des anticorps
  • Durée de temps d’incubation de l’anticorps avec le spécimen
  • Température: Les molécules bougent plus quand c’est chaud donc RT pas le même temps que pour une incubation à 4°C
  • Accessibilité de l’antigène – umasking ou récupération antigénique
54
Q

Expliquez l’histochimie enzymatique

A
  • Enzyme: protéine qui peut catalyser une réaction biologique
  • Utilisation de l’activité enzymatique endogène
  • Obtention de sous-produits coloré après incubation avec des chromogènes
55
Q

Que sont les gènes rapporteurs?

A

Un gène non-endogène qui est exprimé et contrôlé par un promoteur
Le gène rapporteur peut être exprimé par son propre promoteur ou par un promoteur endogène

56
Q

Pourquoi utiliser les gènes rapporteurs à la place des anticorps?

A

Possibilité d’examiner l’expression spatiale et temporale d’un gène en mesurant le rapporteur

57
Q

Expliquez ce qu’est la photo activation des protéines

A

Rapporteur qui devient fluorescent après excitation avec un laser
Les protéines sont photoactivées dans une zone restreinte (sélection spatiale)
Utilise pour étudier la dynamique et la localisation de protéines dans des cellules vivantes (suivi en temps réel
des processus biologiques, de la signalisation cellulaire, de la migration cellulaire, de la division cellulaire, etc.)

58
Q

Comment se fait la photo conversion des protéines?

A
  • Rapporteur qui peut changer son émission après conversion avec un laser (par exemple vert –> rouge)
  • Utile pour étudier la mobilité, les
    interactions, la localisation subcellulaire et la dynamique intracellulaire des protéines dans
    les cellules vivantes
59
Q

Que sont les traceurs antérogrades et rétrogrades?

A

Sonde chimique qui marque les voies axonales permettant de visualiser la connectivité dans le système nerveux.
Décrit par la direction qu’elle traverse le neurone.
Quelques traceurs circulent dans les deux directions
D’autres circulent seulement en direction antérograde ou rétrograde
Peuvent être fluorescents ou chromogéniques

60
Q

Donnez des exemples de traceurs antérogrades et rétrogrades

A
  • Biotinylated dextran amine
  • Diamidino yellow ou diamidino-2-phenylindole
  • FluoroGold
  • Fast blue
  • Lectine de Phaseolus vulgaris (PHA-L)
  • Toxine sous-unité B du choléra (CTB)
61
Q

Comment doit-on injecter les traceurs?

A

Le traceur doit être injecté dans un animal vivant.
Il faut attendre (1 à 7 jours) avant fixation et préparation pour les analyses.

Pour les traceurs antérogrades:
Devraient être dans le soma et les terminaisons pré-synaptiques des neurones injectés
Indiquent les zones vers lesquelles ces neurones projettent

Pour les traceurs rétrogrades:
Devraient être dans le soma des neurones qui projettent à partir de site d’injection
Indiquent les neurones qui ont des projections au site d’injection

62
Q

Donnez des exemples de traceurs antérogrades transsynaptiques

A
  • Acides aminés radioactifs (3H-proline, 3H-leucine) mis dans l’environnement local du neurone primaire.
  • Quelques acides aminés sont absorbés par des transporteurs
  • Dans la cellule, ces acides aminés sont incorporés dans des protéines
  • Certaines protéines traversent l’axone et sont secrétées à la
    terminaison synaptique et reçues par le neurone de deuxième-ordre
  • Peut être répété pour marquer un neurone de troisième-ordre
  • Détection par autoradiographie
63
Q

Qu’utilise-t-on pour faire des traceurs rétrogrades transsynpatiques?

A

Des vecteurs viraux
Auto-amplification via une infection virale
Marquage progressif des neurones dans un circuit quand ils deviennent infectés
Ex : Pseudorabies virus, Herpes simplex virus

64
Q

Quels sont les avantages des traceurs viraux transsynaptique?

A

Leur principal avantage est l’auto-amplification.
Il est aussi possible d’utiliser une combinaison de virus.

65
Q

Quels sont les désavantages des traceurs viraux transsynaptiques?

A
  • Peut tuer les neurones
  • Infection généralisée chez les animaux
  • Plus la durée d’infection est longue, plus le marquage est beau, mais les neurones primaires/secondaires peuvent mourir
  • Biosécurité

Méthodes expérimentales en neurosciences (8 decks)

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