Microscopie - Cours 9

Question 1

Quels sont les principes essentiels de la microscopie?

Answer 1

Grossissement
Résolution (ou pouvoir de résolution)

Question 2

Expliquez le grossissement

Answer 2

Le grossissement d’un microscope correspond à la capacité de l’instrument à agrandir l’image d’un échantillon par rapport à sa taille réelle. Il indique combien de fois l’image est agrandie, ce qui permet à l’observateur de voir des détails invisibles à l’œil nu.
Par exemple, un grossissement de 10x signifie que l’image de l’objet observé est agrandie dix fois sa taille réelle, tandis qu’un grossissement de 100x rend l’objet cent fois plus grand.

Question 2

Expliquez la résolution

Answer 2

La résolution est la capacité d’un microscope à distinguer deux points proches comme étant distincts. Elle définit la plus petite distance entre deux points que le microscope peut séparer clairement. En d’autres termes, la résolution détermine la netteté des détails dans l’image.
Par exemple, imaginons deux bactéries qui sont espacées de 0,2 µm l’une de l’autre. Si j’utilise un microscope avec une résolution de 0,2 µm, je pourrai les voir comme deux entités distinctes. Cependant, si la distance entre les bactéries est inférieure à 0,2 µm, elles apparaîtront floues et fusionnées en une seule forme.
Ainsi, une résolution plus élevée permet d’observer des détails plus fins et de distinguer des structures situées très près les unes des autres.

Question 3

Donnez un exemple de microscopie où le grossissement diminue la résolution

Answer 3

Microscopie confocale

Question 3

Donnez un exemple de microscopie où le grossissement augmente la résolution

Answer 3

Microscopie STED (super reolution)

Question 4

La résolution d’un objet agrandi dépend de 2 facteurs, lesquels?

Answer 4

• L’ouverture numérique (ON)
• La longueur d’onde de la lumière (λ)

Question 4

Sur quoi est basé la limite de résolution d’un système?

Answer 4

Sur la distance minimale a laquelle deux points peuvent être distingués individuellement.

Question 5

Que fait la longueur d’onde sur la résolution?

Answer 5

Un facteur important pour la résolution d’un objet est la longueur d’onde de la lumière (λ) utilisée pour illuminer l’échantillon.
Puisque la résolution r est directement proportionnel à λ, une diminution de la longueur d’onde entraîne une diminution de r, ce qui signifie que la résolution devient meilleure. Cela permet de distinguer des détails plus fins dans l’échantillon.

Le plus grand pouvoir de résolution nécessite des longueurs d’onde plus courtes (Par exemple les rayons ultraviolets dans le spectre visible, rayons d’électrons = microscopie électronique).

Question 6

Qu’est-ce que la longueur d’onde de la lumière?

Answer 6

Les ondes sont représentées par des courbes sinusoïdales.
La distance entre les deux lignes pointillées verticales correspond à une longueur d’onde λ. Cette mesure représente la répétition d’un cycle complet de l’onde.
La longueur d’onde (λ ) est donc la distance sur laquelle la forme de l’onde de lumière se répète.

Question 7

Qu’est-ce que le spectre visible?

Answer 7

Le spectre visible ou spectre optique, qui peut aussi être appelé spectre lumineux, est la partie du spectre électromagnétique qui est visible pour l’œil humain.

Question 8

Plus la longueur d’onde est courte…

Answer 8

plus l’énergie est élevée et donc meilleure est la résolution

Question 9

Qu’est ce que l’ouverture numérique?

Answer 9

L’ouverture numérique (ON) d’un système optique est une mesure de la capacité de collecter de la lumière.
Par exemple, l’objectif du microscope qui recueille la lumière provenant de l’échantillon.

Question 10

Comment l’ouverture numérique influence la résolution?

Answer 10

Plus l’ouverture numérique est élevée, meilleure est la résolution d’un microscope, puisque c’est inversement proportionnel (pour une bonne résolution, on veut un petit r).

Question 11

L’objectif numérique d’un objectif dépend de quels facteurs?

Answer 11

• L’indice de réfraction (n) du milieu dans lequel l’objectif fonctionne (eau, huile, air).
• L’angle (𝛼) auquel la lumière pénètre l’objectif du microscope.

Question 12

Quelle est la formule de l’ouverture numérique?

Answer 12

ON = n x sin(a)

Question 12

Qu’est-ce que l’indice de réfraction du milieu?

Answer 12

L’indice de réfraction est une mesure de la capacité d’un matériau à ralentir la vitesse de la lumière qui le traverse. Il est défini comme le rapport entre la vitesse de la lumière dans le vide et sa vitesse dans le matériau. Plus l’indice de réfraction est élevé, plus la lumière ralentit en traversant ce matériau.
n=1.0 (air), n=1.33 (eau), n=1.55 (huile)

Question 13

Qu’est-ce que “a” dans la formule de l’ouverture numérique?

Answer 13

𝛼: angle auquel la lumière rentre dans l’objectif
L’objectif du microscope capte la lumière émise ou réfléchie par l’échantillon.

Question 14

Que permet un objectif avec une ouverture numérique plus grande?

Answer 14

Permet de recueillir plus de rayons lumineux, conduisant à une meilleure résolution

Question 14

Par quoi est limité la résolution du microscope optique?

Answer 14

Par la diffraction de la lumière :
-La longueur d’onde (dans le spectre visuel, la plus courte = environ 400nm)
-La ON moyenne des objectifs (environ 1)
Donc, la résolution maximale est d’environ 0.2 um

Question 15

Que faut-il faire pour augmenter la résolution?

Answer 15

• Utiliser des longueurs d’ondes hors le spectrum de lumière visible (microscope électronique: faisceau de particules d’électrons)
• Modifier le patron de diffraction de la lumière (ex. nouveaux microscopes de super résolution STED, etc.)

Question 16

Quelle est la différence entre un microscope simple et un microscope composé?

Answer 16

Microscope simple :
Une lentille
Grossissement limité
Réfraction de la lumière dans un plan focal
Magnification limitée

Microscope composé :
2 lentilles minimum : ramassent la lumière et grossie l’image
L’utilisation d’une combinaison de lentilles permet un grossissement beaucoup plus élevé

Question 16

Avec quoi se fait la formation de l’image au microscope simple?

Answer 16

Lentille convexe qui réfracte la lumière pour faire apparaitre l’objet plus grand

Question 17

Avec quoi se fait la formation de l’image au microscope composé?

Answer 17

Le terme «composé» se réfère à l’utilisation de deux ou plusieurs lentilles à l’unisson pour agrandir un objet.
La plupart des microscopes optiques utilisent au moins deux lentilles :
* Lentille de l’objectif (proche de l’échantillon)
* Lentille oculaire (proche de l’œil)

Question 17

Quelles sont les composantes du microscope composé?

Answer 17

• La lentille oculaire (ocular lens) ramasse la lumière de l’échantillon et magnifie l’image (la plus fréquente magnification: 10X)
• La lentille de l’objectif (objective lens) est placée près de l’échantillon. La magnification peut être choisie dépendant de l’objectif (4X, 10X, 20X, 40X, 60X ou 100X)
• Le condenseur (condenser) focalise la lumière de la source sur l’échantillon
• Amplification total: 40X (lentille de l’objective) multiplier par 10X (lentille oculaire) = 400X

Question 18

Qu’est-ce qu’un microscope optique?

Answer 18

Un microscope optique est tout microscope qui utilise la lumière visible pour illuminer et créer une image de l’échantillon.

Question 19

Quelles sont les modalités de microscope optique?

Answer 19

• Microscopie en champ clair (brighfield microscopy)
• Microscopie à contraste de phase (phase-contrast microscopy)
• Microscopie en champ sombre (darkfield microscopy)
• Microscope à contraste interférentiel ou Nomarski (differential interference contrast, Nomarski)

Question 19

Expliquez la microscopie en champ clair

Answer 19

La microscopie la plus simple et la plus ancienne des techniques de microscopie.
L’illumination se fait par transmission de lumière blanche.
La lumière traverse directement ou est réfléchie par l’échantillon.

Question 20

Quels sont les avantages de la microscopie en champ clair?

Answer 20

• Simple et pas cher
• Marqueurs de couleur peuvent être utilisés
• Utilisation: échantillons fixés

Question 21

Quels sont les limitations de la microscopie en champ clair?

Answer 21

• La plupart des cellules sont transparentes donc nécessité d’utiliser des marquages (toxicité potentielle)
• Faible contraste
• Faible résolution

Question 22

Expliquez la microscopie à contraste de phase

Answer 22

Technique qui met en valeur les différences d’indices de réfraction et de contraste.
Développée par physicien hollandais Frederik Zernike (prix Nobel en 1953).
Peut être utilisé pour visualiser des cellules vivantes sans marquage (non-toxique).

Question 23

Quels sont les avantages de la microscopie à contraste de phase?

Answer 23

• Peut être utilisée pour visualiser les cellules vivantes
• Pas besoin d’utiliser des produits chimiques ou préparation du tissu
• Utilisation: cellules en culture

Question 23

Quels sont les limitations de la microscopie à contraste de phase?

Answer 23

• Beaucoup de signaux hors focus

Question 24

Expliquez la microscopie en champs sombre

Answer 24

Permet d’améliorer le contraste d’échantillons transparents mais non teintés.
Le contraste provient de la lumière diffusée par l’échantillon.

Question 25

Quels sont les avantages de la microscopie en champ sombre?

Answer 25

• Peut être utilisée pour visualiser les cellules vivantes.
• Bon rapport signal/bruit
• Utilisation: échantillons pour hybridation in situ (sondes radioactives).

Question 26

Quels sont les limitations de la microscopie en champ sombre?

Answer 26

• Limitée aux échantillons qui dispersent bien la lumière.

Question 26

Expliquez la microscopie à contraste interférentiel (Nomarski)

Answer 26

Utilise des modifications optiques pour amplifier les variations dans les propriétés de diffusion de la lumière des structures cellulaires.

Question 26

Quels sont les avantages de la microscopie à contraste interférentiel (Nomarski)?

Answer 26

• Peut être utilisée dans des cellules vivantes
• Bon rapport signal/bruit
• Surligne les bords et les ombres de l’échantillon pour créer une apparence en trois dimensions (3D)
• Utilisation: cellules en culture et tissus.

Question 27

Quels sont les limitations de la microscopie à contraste interférentiel (Nomarski)?

Answer 27

• Limitée à l’imagerie d’un seul plan focal (mince) à la fois.

Question 28

Qu’est-ce que le microscope à fluorescence ?

Answer 28

Technique utilisant un microscope optique composé équipé d’un émetteur à laser qui permet la sélection d’une longueur d’onde précise.
Les échantillons sont illuminés par une source de haute énergie (laser) et émettent de la lumière grâce à la présence de fluorophores. C’est le phénomène de fluorescence.
Il s’agit d’un type de microscopie très utilisée en neurosciences.

Question 28

Quels sont les types de microscopie à fluorescence?

Answer 28

• Microscopie à fluorescence standard (épifluorescence)
• Microscopie à fluorescence confocale
• Microscopie à deux-photons (multiphotonique)
• Microscopie STED (déplétion par émission stimulée)

Question 29

Que sont les fluorophores?

Answer 29

Un fluorophore est une substance chimique capable d’émettre de la fluorescence après excitation
par la lumière.
Les fluorophores peuvent être couplés aux protéines, anticorps ou d’autres sondes pour visualiser des molécules et structures dans une cellule.
On excite un fluorophore à une longueur d’onde donnée, mais il en émet une différente
Perte d’énergie suite à l’excitation
La longueur d’onde de l’excitation est donc toujours plus courte que l’émission

Question 30

Que faut-il faire pour combiner des fluorophores?

Answer 30

Il faut choisir des molécules avec des spectres d’excitation et émission différents

Question 31

Expliquez l’épifluorescence

Answer 31

La lumière passe a travers le filtre d’excitation qui permet le passage de lumière dans un rang spécifique de longueurs d’onde (dépendant du filtre).
Cette lumière est absorbée par les fluorophores dans l’échantillon causant leur excitation ce qui produit l’émission d’une lumière de longueur d’onde plus large.
La lumière émise est capturée par l’objective et dirigée vers le filtre d’émission vers les éléments de détection (œil, caméra).

La lampe de mercure émet une lumière blanche -> Passe par le filtre d’excitation pour ne laisser passer qu’une lumière -> Redirection de la lumière sur l’échantillon par un miroir dichronique -> L’échantillon absorbe la lumière et émet une longueur d’onde plus large par les fluorophores -> Passe par le filtre d’émission qui réduit le bruit et laisse passer uniquement la lumière qui nous intéresse -> Détection par le détecteur

Question 31

Quels sont les avantages des toutes les formes de microsocopie à la fluorescence?

Answer 31

• Peut être utilisée pour détecter de molécules marquée à la fluorescence
• Plusieurs fluorophores peuvent être utilisée en même temps
• Très bon rapport signal/bruit
• Très sensible, permet la détection de molécules en faible quantité

Question 32

Quels sont les avantages de la fluorescence standard spécifiquement?

Answer 32

• Fluorescence standard: acquisition des images relativement simple (par rapport a la microscopie confocale ou multi-photonique).

Question 33

Quels sont les limitations de la fluorescence standard spécifiquement?

Answer 33

• La lumière émise par le fluorophore diminue avec le temps (photoblanchiment)
• Pendant l’illumination des cellules vivantes, la lumière peut causer de la mort cellulaire (phototoxicité)
• Le bruit de fond peut être élevé dans certains régions à cause de la fluorescence non spécifique ou l’autofluorescence.

En microscopie à la fluorescence standard, pour qu’une image soit nette, il faut que l’objet soit dans le plan focal du système optique.
Mais il y a un problème: quand l’objet est épais (>15-30 µm), la lumière émise par le plan focal, donc nette, est perdue dans la fluorescence émise par les plans adjacents au plan focal, qui par définition sont flous.

Question 34

Expliquez la microscopie confocale

Answer 34

Le microscope confocale peut produire des images très claires des structures provenant d’un échantillon plus épais (>15-30 µm)
Utilise une illumination focalisée sur un point dans une profondeur spécifique de l’échantillon (plan focal) à différents niveaux de profondeur .
Il est possible de réaliser des séries d’images à partir desquelles on peut obtenir une représentation tridimensionnelle de l’objet (z-stacks).
L’objet n’est donc pas directement observé par l’utilisateur; celui-ci voit une image recomposée par l’ordinateur.

-Plusieurs plans focaux pour faire une reconstruction 3D
-Z-stack tous mis dans une même photo, ce qui donne l’effet 3D et profondeur

Question 35

Quels sont les avantages de la microscopie confocale spécifiquement?

Answer 35

• Permet l’acquisition des images extrêmement nettes.
• Seules les images dans le plan focal sont acquises.
• Permet l’imagerie des échantillons plus épais.

Question 36

Quels sont les limitations de la microscopie confocale spécifiquement?

Answer 36

• Le balayage requière une illumination des échantillons à long terme ce qui augmente le phénomène de photoblanchiment.
• La prise des images est un processus lent ce qui rend difficile la visualisation des évènements rapides.

Question 36

Expliquez la microscopie laser à 2-photons

Answer 36

• Le microscope à 2-photons est une variation plus sophistiquée de la microscopie à fluorescence
• En microscopie à fluorescence standard ou confocale, seulement un photon d’un certain longueur d’onde excite le fluorophore pour produire un signal. Dans la microscopie à 2-photons, un fluorophore peut être excité en absorbant deux photons simultanément.
• La longueur d’onde de chaque photon est le double de la longueur d’onde nécessaire pour stimuler le fluorophore.
• Quand les 2 photons frappent le fluorophore, chacun contribue à la moitié de l’énergie nécessaire pour exciter le fluorophore.
• Etant donné que l’arrivée de 2 photons simultanément est un évènement relativement rare, la fluorescence est localisée sur un plan focal très étroit dans l’échantillon ce qui donne des images plus claires (il n’y a pas assez d’énergie pour exciter d’autres plans alors le bruit de fond est très bas).

Question 37

Quels sont les avantages de la microscopie laser à 2-photons spécifiquement ?

Answer 37

• Le microscope à 2 photons permet la visualisation des structures plus profondes car la lumière excitatrice dans l’infra-rouge rentrant plus facilement dans le tissu (500 um- 1mm)
• Permet l’observation des cellules chez les animaux vivants sans causer du dommage cellulaire (i.e. basse phototoxicité)
• L’excitation est limitée au point focal ce qui réduit le photoblanchiment

Question 38

Quels sont les limitations de la microscopie laser à 2-photons spécifiquement ?

Answer 38

• La nécessité d’équipements spécialisés et couteux (ex. microscopes multiphotoniques >1M$).

Question 39

Quel type d’expérience n’a pu être observée que grâce à la microscopie 2-photons?

Answer 39

La souris est génétiquement modifiée pour exprimer CFP dans les mitochondries. Le marqueur Thy1 permet une expression ciblée dans les neurones.
Cette étude démontre que l’hypertension oculaire, un facteur de risque majeur dans le glaucome, perturbe le transport axonal antérograde des mitochondries, entraînant une baisse d’énergie dans les neurones vulnérables.

Question 40

Qu’est-ce qui est uniquement possible grâce à la microscopie à 2-photons?

Answer 40

Observations de structures profondes chez un animal vivant (in vivo)

Question 41

Expliquez la microscopie de l’épuisement d’émission stimulée (STED)

Answer 41

• La STED emploie une installation similaire à la microscopie confocale.
• Excitation et déplétion contrôlée : Dans la microscopie STED, un laser d’excitation est d’abord utilisé pour exciter les fluorophores, les rendant fluorescents. Ensuite, un deuxième laser de déplétion (STED) est appliqué en forme d’anneau autour du point d’excitation.
• Réduction de la zone d’émission : Le laser STED force les fluorophores situés en périphérie du point d’excitation à retourner à leur état fondamental sans émettre de fluorescence (par émission stimulée), ce qui réduit la zone d’émission lumineuse à une zone beaucoup plus petite que le point de diffraction.
  Produit des images à super résolution par la désactivation sélective des fluorophores
• Amélioration de la résolution : En réduisant cette zone d’émission à un point plus fin, la microscopie STED permet de distinguer des structures plus petites, offrant une résolution supérieure aux méthodes de microscopie conventionnelles.

Question 42

Expliquez l’excitation et déplétion de la microscopie de l’épuisement d’émission stimulée (STED)

Answer 42

• À gauche, l’image montre le processus d’excitation initiale, où un faisceau laser (en vert) excite les fluorophores dans une zone circulaire, comme dans la microscopie classique.
• À droite, l’image de déplétion montre l’application d’un deuxième laser (en rouge), configuré en forme d’anneau autour de la zone d’excitation. Ce laser « épuise » la fluorescence en forçant les fluorophores à retourner à leur état fondamental par émission stimulée, sauf dans une petite zone centrale non affectée par le faisceau.

Question 43

Expliquez la réduction de la zone d’émission de la microscopie de l’épuisement d’émission stimulée (STED)

Answer 43

En réduisant la zone d’émission lumineuse à une taille beaucoup plus petite que la limite de diffraction, STED permet d’obtenir une résolution bien plus élevée que la microscopie traditionnelle. La fluorescence n’est émise que par la petite zone centrale où le laser de déplétion ne peut pas agir.

Question 44

Expliquez la microscopie électronique

Answer 44

Contrairement aux microscopes optiques qui utilisent des photons (lumière), les microscopes électroniques utilisent des électrons pour «illuminer» l’échantillon. Étant donné que les électrons ont une longueur d’onde beaucoup plus courte que celle des photons visibles, ils permettent d’obtenir des images avec une résolution bien supérieure.
Les microscopes électroniques offrent des grossissements extrêmement élevés, allant jusqu’à 5 millions de fois, comparativement à environ 2000 fois pour les microscopes optiques classiques. Cette haute résolution permet de voir des détails au niveau nanométrique, essentiels pour l’étude des structures subcellulaires, des virus, des matériaux, etc.

Question 45

Quels sont les applications de la microscopie électronique?

Answer 45

La microscopie électronique est indispensable dans plusieurs domaines, notamment la biologie cellulaire, la virologie, et les sciences des matériaux. Elle permet d’observer des détails ultrastructuraux des cellules, comme les membranes, les ribosomes, ou les protéines.

Question 46

Quelle technique doit absolument être faite par microscopie électronique?

Answer 46

La longueur d’un électron est plus petite (plus d’énergie) que celle d’un photon.
Technique essentiel pour examiner les plus petites structures du système nerveux (ex. synapses, vésicules synaptiques, canaux ioniques)

Question 47

Quelles sont les limitations de la microscopie électronique?

Answer 47

-Les échantillons sont fixés, déshydratés et traités avec des agents chimiques (peu de chance de visualiser des cellules vivantes.
-Présence des artefacts visuels causé par le traitement du tissu.
-Très technique, demande des années d’expérience