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Méthodes expérimentales en neurosciences > Manipulation des gènes endogènes - Cours 11 > Flashcards

Manipulation des gènes endogènes - Cours 11 Flashcards

1
Q

Pourquoi utiliser la modélisation animale?

A

Le système nerveux est complexe, composé de types cellulaires diversifiés et de réseaux neuronaux finement connectés et régulés.
La modélisation animale et les approches génétiques aident à:
* Libeller sélectivement des sous-populations données pour en étudier le développement et la fonction au sein des circuits.
* Étudier l’effet de la perte ou du gain d’un gène donné sur les circuits neuronaux.
* Préciser l’impact de nouvelles mutations sur les circuits.
* Mieux comprendre les voies moléculaires impliquées dans les fonctions normales et les pathologies du SNC.

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2
Q

Que permet le marquage génétique de populations neuronales ciblées?

A

Permet de caractériser les propriétés physiologiques, la connectivité et les propriétés biochimiques et génétiques d’une sous-population de neurones au sein de circuits complexes.

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3
Q

Quelles questions se poser avant un projet de marquage génétique de populations neuronales ciblées?

A
  • Est-ce que les neurones que je veux marquer, c’est pour une série de courtes expériences ou tout le monde dans le labo utiliserait ce nouvel outil?
  • Est-ce qu’on veut créer une nouvelle lignée de souris?
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4
Q

Que utiliser pour un marquer une population neuronale ciblé à long terme? À quoi cela peut-il servir?

A

Transgènes, knock-in
Modéliser une maladie humaine, rescue, etc.

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5
Q

Qu’est-ce que la méthode transgène?

A

Un transgène consiste à introduire un fragment d’ADN exogène dans le génome d’un organisme.
Ici, l’ensemble du promoteur et de la région codante est inséré. Cela signifie que le promoteur utilisé pour réguler l’expression est souvent artificiel ou choisi spécifiquement pour répondre à vos besoins.

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6
Q

Quelles sont les caractéristiques principales d’un transgène?

A
  • Le promoteur est contenu dans le construit d’ADN.
  • L’intégration est aléatoire dans le génome. Par conséquent, l’expression du gène inséré peut être influencée par l’environnement chromatinien local, ce qui peut entraîner des niveaux d’expression variables.
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7
Q

Comment créé-t-on un transgène?

A

Choix du promoteur: Séquence d’ADN permettant la liaison de la polymérase initiant la transcription d’un gène.
Pour la création d’un transgène, on choisit un promoteur d’un gène exprimé de façon ubiquitaire (partout) ou sélectivement dans une population cellulaire d’intérêt.

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8
Q

Nommez des promoteurs ubiquitaires

A

CMV, CAG, EF1a (humain), TRE: promoteur inductible

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9
Q

Nommez des promoteurs ciblés

A

Chat (neurones cholinergiques), CAMK2 (cellules pyramidales), Gad67 (interneurones GABAergiques)

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10
Q

Comment se fait le clonage moléculaire? (Étapes)

A

1- Préparation du vecteur
* On ouvre le vecteur avec des enzymes de restrictions.

2- Préparation de l’insert
* Amplifié par PCR préalablement.
* Digestion avec enzymes de restrictions.

3- Ligation
* L’insert et le vecteur se lient.

4- Transformation
* Le vecteur/insert est introduit dans bactéries.
* Les bactéries sont électro ou chimiquement compétentes.

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11
Q

Comment faire un clonage d’un transgène? (Étapes)

A

1- Sélectionner un plasmide exprimant le promoteur voulu (A).
2- Sélectionner un 2e plasmide contenant une cassette d’expression désirée (ex: EGFP, Cre) (B).
3- Insérer le promoteur du plasmide (A) en avant de la cassette d’expression du 2e plasmide (B).

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12
Q

Comment fait-on la génération de souris transgénique? (étapes)

A
  1. Construction du transgène
    * Sélection d’un promoteur spécifique
    * Clonage du cDNA choisi (EGFP, LacZ, etc)
    * Purification de l’ADN
  2. Superovulation de femelles adultes FVB/N
    * Pronucleus plus gros et proéminent, plus facile pour la microinjection
    * Donnent des grosses portées
  3. Croisement avec mâle WT
  4. Extraction des zygotes
  5. Microinjection de l’ADN au pronucleus
  6. Conservation: 37°C, 5% CO2 jusqu’au transfert
  7. Transfert des embryons: femelles pseudo-gestantes
  8. Identification des bébés porteurs (fondateurs)
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13
Q

Comment se fait la collecte de zygotes?

A

1- Les organes reproducteurs, y compris l’oviducte, sont prélevés chez les souris donneuses.
2- L’ampoule (partie élargie de l’oviducte) est localisée et ouverte à l’aide de pinces sous le microscope.
3- Les zygotes sont lentement séparés des cellules du cumulus environnantes.

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14
Q

Avec quelle méthodes fait-on l’identification des porteurs?

A

Southern blot

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15
Q

Expliquez pourquoi il faut faire le Southern Blot pour identifier des proteurs

A

Lorsqu’on fait un animal transgénique, on ne contrôle pas:
* Où le transgène va s’insérer
* Le nombre de copies
C’est donc très important de caractériser le transgène.
Il faut identifier un animal fondateur puis le croiser pour commencer notre lignée.
Il est possible d’utiliser d’autres techniques pour valider la présence de notre transgène (PCR, séquençage, etc.) mais le Southern va nous donner beaucoup plus d’informations.

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16
Q

Qu’est-ce que l’effet positionnel?

A

Expression qui ne concorde pas toujours avec celle attendue pour le promoteur choisi

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17
Q

À quoi ça sert concrètement de produire une souris transgénique?

A

Les souris transgéniques sont des outils puissants pour explorer des questions biologiques complexes, comme le rôle des gènes dans le développement et le fonctionnement des circuits neuronaux.
Un exemple: comprendre la diversité des interneurones GABAergiques, essentiels à l’équilibre excitation/inhibition dans le cerveau.
Il existe plusieurs sous-types d’INs GABAergiques, ayant une provenant différente et exprimant des marqueurs biochimiques différents.

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18
Q

Comment aborder la diversité des interneurones GABAergiques?

A

Cette diversité trouve ses origines dans le développement embryonnaire. Les interneurones GABAergiques proviennent principalement de deux régions de l’éminence ganglionnaire :
* MGE (Medial Ganglionic Eminence)
* CGE (Caudal Ganglionic Eminence)
Les marqueurs biochimiques permettent de distinguer ces sous-types
Une fois adultes, ces interneurones se distinguent également par leur morphologie, leur physiologie et leurs cibles synaptiques.

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19
Q

Donnez des exemples de marqueurs biochimique permettant de distinguer les sous-types d’interneurones GABAergiques

A
  • PV et SST sont associés aux interneurones dérivés de MGE.
  • VIP est associé aux interneurones dérivés de CGE.
  • Certains marqueurs, comme la Reelin, peuvent être partagés par plusieurs populations.
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20
Q

Donnez des exemples de distinctions d’interneurones une fois adulte

A
  • Les cellules chandelier (PV+) établissent des connexions spécifiques avec les segments initiaux des axones pyramidaux.
  • Les cellules Martinotti (SST+) projettent vers les couches superficielles du cortex.
  • Les cellules en bouquet (VIP+) se connectent à d’autres interneurones, influençant indirectement l’excitation.
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21
Q

Quels sont les avantages du marquage sélectif grâce aux animaux transgénique?

A

1- Visualiser les cellules pour étudier leurs propriétés fonctionnelles.
Électrophysiologie

2- Visualiser leur distribution et leurs propriétés biochimiques.
Co-marquage en immunofluorescence, décomptes cellulaires
3- Extraire sélectivement des populations données (FACS) pour effectuer des études de profilage.
Génomique, ARN, protéique

4- Visualiser des structures anatomiques cellulaires in vivo.
Remodelage des épines dendritiques, synapses, etc…

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22
Q

Comment peut-on caractériser différents sous-types d’INs SST+?

A

Marqueurs biochimiques
Analyse électrophysiologie par patch-clamp

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23
Q

Expliquez comment on peut caractériser différents sous-types d’INs SST+ par marqueurs biochimiques

A

Expression de marqueurs spécifiques dans trois lignées transgéniques (X94, X98 et GIN) :
* Les cellules SST+ (somatostatine) sont co-marquées avec d’autres marqueurs biochimiques comme PV (parvalbumine), CB (calbindine) ou NPY (neuropeptide Y).
* Ces profils biochimiques montrent que chaque lignée cible des sous-populations légèrement différentes d’interneurones SST+.

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24
Q

Expliquez comment on peut caractériser différents sous-types d’INs SST+ par analyse électrophysiologie par patch-clamp

A

Les tracés de patch-clamp montrent les propriétés physiologiques distinctes des interneurones dans chaque lignée :
* X94 : Décharges de potentiels d’action caractérisées par un mode particulier d’excitabilité.
* X98 : Activité électrophysiologique différente, suggérant un rôle fonctionnel distinct.
* GIN : Propriétés encore divergentes, soulignant la diversité au sein même des interneurones SST+.

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25
Q

Comment peut-on faire un profilage génétique G42?

A
  • À l’aide du FACS les cellules EGFP+ sont isolées sélectivement du tissu neuronal.
  • Cette approche permet d’étudier spécifiquement les interneurones marqués dans cette lignée.
  • Possibilité de faire du profilage génétique au cours de la maturation des cellules.
  • Dans cet exemple, différents temps sont utilisés (P7, P10, P15, P25, P40)
26
Q

Comment peut-on faire la visualisation des épines dendritiques in vivo?

A
  • Le transgène THY1-EGFP permet de marquer les neurones de manière intense et ciblée, comme on le voit dans cette image d’un neurone cortical avec des dendrites et épines bien visualisées.
  • Lors d’une tâche d’apprentissage moteur, comme l’utilisation d’un rotarod, de nouvelles épines dendritiques se forment dans les neurones corticaux.
  • L’expérience démontre que la formation des épines est corrélée à la performance comportementale et qu’elle est plus importante chez les jeunes animaux comparés aux adultes
27
Q

Qu’est-ce que la méthode knock-in?

A

Si on le compare à la technique des transgènes, un knock-in est une méthode beaucoup plus précise.
Il s’agit de modifier un gène endogène à l’aide de la recombinaison homologue.

28
Q

Quelles sont les caractéristiques principales du knock-in?

A
  • Le promoteur reste celui du gène endogène, ce qui permet de préserver la régulation naturelle de l’expression.
  • L’intégration se fait à un emplacement précis dans le génome grâce à la recombinaison dirigée. Cela permet d’obtenir des résultats plus reproductibles.
29
Q

Quel est le principe de production d’un knock-in?

A

Insertion d’une cassette permettant d’exprimer une protéine d’intérêt après le codon d’initiation sous le contrôle du promoteur endogène (remplacement d’un gène endogène)

30
Q

Quel est la différence entre cassette de sélection positive et négative?

A

Cassette de sélection positive: Neo (Résistance néomycine) – la cassette est présente dans le construit final
Cassette de sélection négative: TK (avec gancyclovir) ou DTA – la cassette est absente dans le construit final

31
Q

Quelle est la différence entre knock-in et knock-out?

A

Knock-in: insertion d’un nouveau gène au site d’un autre gène
Knock-out: ablation d’exons d’un gène cible pour le rendre inactif

32
Q

Quelles sont les étapes de production d’un knock-in?

A
  1. Production de l’allèle recombinante (création du vecteur)
  2. Microinjection dans des cellules souches WT
    Sélection des cellules ayant incorporé le KI (néomycine: sélection +, gangyclovir: sélection -)
  3. Insertion des cellules souches dans un blastocyste
  4. Transfert du blastocyste à une mère porteuse
  5. Croisements successifs des bébés jusqu’à l’obtention d’une lignée knock-in uniforme.
33
Q

Comment fait-on la vérification du génotype?

A

Southern ou PCR :

Une fois l’intégration adéquate de la cassette confirmée par Southern blot, il faut vérifier l’expression de la cassette insérée (ex: par immunohistochimie: visualiser l’expression de l’EGFP dans les cellules attendues).
Habituellement, l’expression du KI est plus fiable que celle du transgène (i.e. pas d’effet positionnel), mais expression est parfois de niveau plus faible.
Attention perte d’une copie du gène endogène

34
Q

Donnez quelques exemples de marquage sélectif knock-in

A
  • LacZ: coloration stable à la lumière
  • EGFP: marquage en immunofluorescence
  • Cre: à jumeler avec une allèle reportrice
    RCEEGFP
    Z/EGEGFP
    AI9tdTomato

Autres usages:
Générer un knockout constitutif ou conditionnel
Insérer une mutation ponctuelle

35
Q

Quel est le principe et ampliations de la technique Cre/Lox?

A
  • La recombinase Cre reconnaît des sites LoxP .
  • Lignée Cre : Exprime Cre sous contrôle d’un promoteur (spécifique tissu ou inductible).
  • Lignée floxée : Contient des sites LoxP autour d’un gène ou d’une cassette STOP.
  • Avantage : Contrôle spatial et temporel, idéal pour la recherche génétique et en biologie du développement.
36
Q

Que permet de faire l’approche Cre/LoxP?

A

Fate-Mapping : Marquage sélectif pour suivre l’évolution d’un type cellulaire
Il y a des lignées pour presque tous les types cellulaires connus.
Dans cet exemple, Lhx6 marque une population d’interneurones.
Chaque lignée seule est « normale ». Il faut donc croiser les 2 lignées de souris afin de produire notre souche d’intérêt
Lors du croisement, l’enzyme Cre va reconnaitre les sites loxP et va enlever la cassette stop.
Très utile pour voir les niveaux d’expression dans le temps, toutes les cellules exprimant la Cre vont être EGFP.

37
Q

Que sont les allèles rapportrices?

A
  • Les allèles rapportrices marquent spécifiquement les cellules où la Cre a excisé une cassette STOP.
  • Cela permet de cartographier les cellules ciblées dans différents tissus ou régions cérébrales.
  • L’intensité de la fluorescence peut varier selon la lignée utilisée.
  • Ce phénomène reflète des différences dans l’activité de Cre ou l’expression du gène rapporteur.
  • Il est possible de combiner un marquage Cre-LoxP (ex. Ai9) avec un marquage indépendant de Cre, comme un transgène EGFP.
  • Cela permet d’étudier la connectivité entre deux populations cellulaires distinctes, marquées par différentes couleurs.
38
Q

Qu’est-ce que la précision temporelle avec Cre-ER?

A

La technologie Cre-ER permet de contrôler la recombinaison Cre de manière temporelle, en activant spécifiquement la recombinase à un moment précis.
* La recombinase Cre est fusionnée à un domaine de liaison au récepteur des œstrogènes (ER, Estrogen Receptor).
* En l’absence de tamoxifène (un modulateur des récepteurs aux œstrogènes), Cre-ER reste inactive dans le cytoplasme.
* Après administration de tamoxifène, Cre-ER est transloquée dans le noyau, où elle excise les séquences entre les sites LoxP .
* Permet de marquer des sous-types neuronaux ou cellulaires à des moments spécifiques du développement ou après un événement particulier.

39
Q

Qu’est-ce que le fate-mapping temporel des interneurones?

A
  • Le fate-mapping temporel permet de suivre les cellules en fonction de leur date de naissance et de comprendre leur devenir dans les circuits neuronaux.
  • Les interneurones issus du MGE naissent majoritairement plus tôt (vers E12.5), et leurs descendants se retrouvent dans les couches profondes (IV-VI).
  • Ceux issus du CGE naissent plus tard (vers E15.5) et se localisent davantage dans les couches superficielles (II-III).
  • Cette approche permet d’identifier comment les différents sous-types d’interneurones sont distribués selon leur origine et leur moment de naissance.
40
Q

Comment fait-on le marquage sélectif des cellules en chandelier?

A
  • Les cellules en chandelier sont un sous-type d’INs produit sélectivement à E17.
  • En combinant une lignée Nkx2.1-Cre-ER (marquant les interneurones dérivés de la MGE) avec un rapporteur Ai9, l’administration de tamoxifène à E17 active l’expression du marqueur fluorescent (RFP).
  • Cela permet de cibler uniquement les cellules en chandelier générées à ce moment précis.
  • C’est la 1ère fois que les INs en chandelier ont été marqué différentiellement
41
Q

Quelles sont les façons d’induire des pertes de fonction dans les gènes?

A
  • Délétion de gènes endogènes
  • Mutations ciblées
  • Répression de l’expression (ARN)
42
Q

Qu’est-ce qu’un knock-out?

A

Production d’un knock-in qui permet de remplacer un gène d’intérêt (souvent les premiers exons) par une cassette de sélection (ex: néo)
On pourrait dire que le knock-out est un type de knock-in dont le résultat final est l’ablation du gène d’intérêt.

43
Q

Que peut-faire un knock-out sur un gène essentiel ?

A

Létal
* Shh est un gène essentiel pour le développement du télencéphale et d’autres structures embryonnaires.
* En cas de knock-out constitutif (perte de SHH dans tout l’organisme et à tout moment), les embryons présentent des malformations sévères et ne sont pas viables.

Défauts structurels majeurs :
* Microcéphalie
* Hypoplasie du cervelet
* Déformations axiales du squelette

Anomalies fonctionnelles :
* Cyclopie (fusion des yeux)
* Absence de follicules pileux
* Hypoplasie pulmonaire et rénale

44
Q

Qu’est-ce que la délétion conditionnelle?

A
  • La délétion conditionnelle via le système Cre-LoxP est une approche puissante pour éviter les problèmes liés à la suppression constitutive d’un gène, comme la mortalité précoce.
  • En activant la recombinaison Cre dans des cellules, tissus, ou à des moments spécifiques, on contourne les effets délétères d’une délétion constitutive.
  • Cre est exprimée sous le contrôle d’un promoteur spécifique, permettant de cibler des populations cellulaires précises.
  • Si l’allèle Cre est inséré au locus d’un gène d’intérêt, une copie de ce gène est perdue, ce qui peut affecter le phénotype.
    Exemple : PVCre knock-in : entraîne une diminution de l’expression de la parvalbumine (PV) et une susceptibilité accrue aux convulsions.
45
Q

Qu’est-ce que fait la délétion sélective de Sox6?

A

Importance pour la migration et la maturation des INs du MGE
* Sox6 est fortement exprimé dans les interneurones issus de la MGE, mais aussi dans d’autres populations, comme les progéniteurs corticaux (cellules pyramidales).
* Cette double expression rend le knock-out constitutif de Sox6 létal et non spécifique aux INs.
* Utilisation de Lhx6-Cre pour cibler spécifiquement les interneurones et évaluer l’effet de la délétion de Sox6 dans ces cellules. Les images montrent la localisation de Sox6 (rouge) et des INs marqués par EGFP.

46
Q

Comment se fait l’ablation sélective de Sox??

A

Allèle conditionnel de Sox6
* Sox6 est flanqué de sites LoxP (allèle floxé).
* La recombinaison Cre excise le gène Sox6 uniquement dans les cellules où Cre est exprimée.

Driver line (Lhx6-Cre)
* Lhx6 est un promoteur spécifique des interneurones provenant de la MGE.
* Cre est exprimée uniquement dans ces cellules, permettant une délétion ciblée de Sox6 dans cette population.

EGFP reporter
* Une lignée reporter (loxP-STOP-loxP-EGFP) est utilisée pour confirmer l’expression de Cre dans les cellules ciblées.
* Après recombinaison, les cellules Cre+ expriment EGFP, facilitant leur visualisation.

L’ablation sélective de Sox6 nous permet d’évaluer l’impact au niveau cellulaire

47
Q

Quelles sont les conséquences d’une mutation de Sox6 dans les INs?

A

Mutants (Sox6 KO dans les INs) montrent une mauvaise distribution des cellules PV dans les couches corticales.
Sox6 est crucial pour la migration correcte des interneurones PV+
Les mutants montrent une activité électrique altérée, preuve de dysfonctionnement des interneurones.
Défaut de synchronisation et d’excitabilité dans les circuits corticaux chez les mutants.

48
Q

Quelles sont les conséquences d’une ablation sélective de Sox6 au niveau du fonctionnement global?

A

EEG anormaux avec présence de crises épileptiques
(A) Chez les mutants, on observe une augmentation des décharges irrégulières, suggérant une hyperexcitabilité.
(B) Pendant le sommeil, l’EEG révèle une activité épileptique interictale caractéristique (pointes et ondes).
(C) Des myoclonies (contractions musculaires involontaires) sont observées, associées à des décharges épileptiques dans l’EEG et l’EMG (électromyogramme).
(D) Activité EEG pendant une crise généralisée (seizure), montrant des décharges synchronisées dans les deux hémisphères (M1 et CA1).

49
Q

Comment fait on l’édition du génome?

A

Par nucléées : CRISPR/Cas9
Méthode plus rapide puisqu’on fait une modification génétique directement dans l’embryon Expression d’un ARN guide et de la Cas9
Cette approche permet de générer des KO ou des KI selon le type de mécanisme de réparation de l’ADN utilisé par la cellule.

  • Génération de knock-out (délétion, frameshift) de façon rapide et efficace.
  • Génération des knock-in porteurs de mutations ciblées (humanisées)
    Besoin d’investiguer plusieurs fondateurs car l’efficacité du knock-in est faible en raison du biais vers une réparation de l’ADN sans introduction du fragment homologue
  • Corrections de défauts génétiques (ex: résection d’une duplication génique…)
    Ex: sur cellules souche pour transplantation
50
Q

Que fait le knock-down?

A

Répréssion ciblée
Dégradation de l’ARN avant la production d’une protéine.
On peut:
* Utiliser directement des siRNA (culture, effet rapide, expression transitoire)
* Créer un transgène exprimant un shRNA sous le contrôle d’un promoteur spécifique (expression durable)

51
Q

Qu’est-ce que le siARN et shARN?

A

siARN: Petits ARN interférents
shARN: ARN courte épingle à cheveux
Les siARN et shARN ont pour fonction principale de réduire ou arrêter l’expression d’un gène spécifique. Cela se fait en ciblant l’ARNm correspondant au gène pour provoquer sa dégradation, un processus appelé silencing génique

52
Q

Comment fonctionne le shARN?

A
  • shARN est délivré par plasmide ou virus, tandis que le siARN est directement injecté.
  • Transcription du shARN
  • Brisure de la forme « épingle à cheveux » du shARN
  • Le complexe RISC vient défaire l’ARN double brin
  • Reconnaissance de la séquence cible
  • Arrêt/diminution de l’expression
53
Q

Expliquez l’application du shARN

A
  • Choisir une séquence spécifique au gène d’intérêt (BLAST dans NCBI)
  • Une séquence non spécifique (sans homologie avec le génome de la souris) est utilisée pour vérifier que les effets observés ne sont pas dus à des interférences hors cible.
  • Important de tester plusieurs shRNA : Les efficacités peuvent varier selon la cible, il est donc important de valider plusieurs constructions.
  • Vérifier la spécificité de l’effet avec un « rescue » shRNA-résistant: Introduire une version résistante du gène cible (mutée dans la région reconnue par le shARN) pour vérifier que l’effet est bien dû au knockdown spécifique.
54
Q

Que fait la répression des gènes durant le développement des INs?

A

Plus rapide qu’un knockout mais moins spécifique
Possibilité de tester plusieurs gènes rapidement pour identifier des candidats potentiels pour des nouveaux modèles
Ex. gènes impliqués dans des maladies rares
Dans l’exemple, le knock-down du gène entraine une dysmorphie des INs.

55
Q

Pourquoi il pourrait être intéressant de surexprimer un gène dans un modèle animal ?

A

Corriger une perte de fonction :
* Permet de compenser une mutation ou une délétion d’un gène en réintroduisant son expression.
* Cela peut ouvrir des pistes thérapeutiques ou fournir une meilleure compréhension des mécanismes biologiques.

Étudier l’effet d’un gène à différentes étapes du développement :
* La surexpression peut aider à identifier les rôles spécifiques d’un gène dans le développement embryonnaire, postnatal ou adulte.

Modifier l’activité d’un circuit neuronal :
* En augmentant l’expression d’un gène, il est possible d’étudier comment un circuit neuronal réagit à des changements d’activité dans des contextes spécifiques ou à différents moments (par ex., apprentissage ou pathologie).

56
Q

Quel est l’effet de la surpression de ARX chez les mutants Dlx1/2 -/-?

A

Diminution d’ARX dans les mutants Dlx1/2⁻/⁻
Les panels de gauche montrent une réduction notable d’ARX (en bleu) dans les régions telles que le ganglion basal (mge, lge) et le cortex (cx) chez les embryons Dlx1/2⁻/⁻.

Effet de la surexpression d’ARX
Les images GFP montrent une restauration de la migration des interneurones (INs) depuis la région mge vers le cortex.
La comparaison des conditions montre qu’après 48h (carré rouge), les cellules surexprimant ARX atteignent les régions corticales, même dans les mutants.
La surexpression de ARX corrige donc la migration des INs chez les mutants Dlx1/2-/-.

57
Q

Expliquez le système Tet-off

A

En absence de doxycycline (Dox), la protéine tTA (transactivateur) se lie à l’élément TRE (tetracycline- responsive element), activant l’expression du transgène.
En présence de doxycycline, tTA est inhibée et l’expression du transgène est stoppée.

58
Q

Expliquez le système Tet-on

A

En absence de doxycycline, rtTA (version modifiée de tTA) ne se lie pas au TRE, donc le transgène n’est pas exprimé.
En présence de doxycycline, rtTA devient actif, se lie au TRE, et active l’expression du transgène.

59
Q

Comment pouvons-nous utiliser l’approche TetO pour affecter la fonction du neurone?

A

Ici, le système TetO a été utilisé pour altérer la fonction des neurones à travers l’expression de Kir2.1.
Kir2.1 est un canal potassium qui induit une hyperpolarisation neuronale, rendant les neurones moins excitables.
Cette manipulation affecte le développement des interneurones (INs), en particulier :
* La morphologie : réduction de la longueur axonale et du nombre de ramifications.
* La migration : altération des capacités des INs à migrer vers leurs cibles appropriées.
Les graphiques (b) montrent les différences significatives entre les groupes contrôles et ceux exprimant Kir2.1, notamment une diminution de la longueur axonale et des points de ramification pour les interneurones marqués par VIP et calrétinine.

60
Q

Comment y’a-t-il activation du transgène Tet-O Kir2.1 à différents moments?

A

TetOff à P0 :
* Lorsque l’expression du transgène est arrêtée juste après la naissance (P0), la migration des INs est normale.
* Cela montre que l’expression de Kir2.1 n’altère pas la migration lorsqu’elle est contrôlée précocement.

TetOff à P3 :
* Si l’expression de Kir2.1 est maintenue jusqu’à P3, les INs montrent une migration anormale.
* Cela suggère que la régulation de la migration des INs dépend d’une fenêtre temporelle critique.
* Les interneurones exprimant Kir2.1 présentent une réduction de la longueur axonale et du nombre de ramifications, particulièrement notable lorsque l’arrêt est retardé (P3).

61
Q

Nommez les ressources pour la manipulation des gènes endogènes

A

Le Allen Brain Atlas
GENSAT (NIH/Rockfeller) : Production de souris EGFP/LacZ ou Cre
The Jackson Laboratory : Source de souris génétiquement modifiées
Mouse Genome Informatics
International Mouse Strain Ressource (IMSR)
ALZFORUM

Méthodes expérimentales en neurosciences (12 decks)

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