Culture cellulaire - Cours 8 Flashcards
Pourquoi vouloir introduire un gène dans une cellule?
-Produire une souris transgénique afin d’étudier la fonction d’un gène
-Étudier les conséquences d’une mutation d’un gène sur le fonctionnement d’une cellule
-Examiner comment un gène contrôle l’expression d’autres gènes
Quelles sont les 3 types de stratégies utilisées pour introduire l’ADN d’un gène dans une cellule?
1- Force physique (ex. billes d’or)
2- Produits chimiques (ex. liposomes)
3- Vecteurs viraux
Les stratégies d’introduction d’ADN se distinguent par quoi?
-Le nombre de cellules qui prendront l’ADN (efficacité de la transfection/transduction)
-Le niveau d’expression du gène (Une copie/plusieurs copies)
-L’expression dans le temps (Quelques heures ou quelques jours)
Quelle est la différence entre transfection et transduction?
Transfection : Méthode non-virale pour introduire de l’ADN dans une cellule
Transduction : L’ADN est introduit par un vecteur viral. Les virus s’attachent à la cellule pour injecter l’ADN
Quels sont les facteurs qui déterminent comment choisir la stratégie pour introduire de l’ADN dans une cellule?
-L’environnement cellulaire - Cellules en cultures ou dans le cerveau
-Type cellulaire - Fibroblastes, neurones, astrocytes, mais aussi lignée immortalisées, cultures primaires, …
-Le but de l’expérience - Expression transitoire ou à long terme
Quelles sont les trois méthodes utilisées en laboratoire pour introduire l’ADN par une méthode physique?
-Microinjection
-Électroporation
-Biolistique
La microinjection est rarement utilisée pour introduire de l’ADN dans les neurones à cause de leur petite taille et de leur fragilité, sauf un cas particulier. Lequel?
L’injection d’ADN dans les neurones de grande taille de la lamproie
Expliquez le fonctionnement de l’électroporation
Il s’agit d’utiliser une impulsion électrique
L’application d’un champ électrique aux cellules induit la formation de pores au niveau de la membrane cellulaire. Ces pores permettent à l’ADN de rentrer dans la cellule
L’ADN qui est chargé négativement va être repoussé de la cathode(-) vers l’anode(+) dans le champ électrique
Quand le champ électrique est enlève, les pores se ferment et donc l’ADN demeure à l’intérieur de la cellule
Cette méthode peut être utilisée pour introduire de l’ADN in vitro, in vivo et in utero.
Neurones dissociés, des tranches de cerveau ou embryons
Possibilité de diriger les électrodes pour sélectionner une région spécifique
À quoi est utilise l’électroporation est qu’est-ce qui peut être controlé ?
L’électroporation est utile pour introduire de l’ADN dans les neurones situés dans des régions qui sont adjacentes aux ventricules. La solution qui contient l’ADN est injectée dans les ventricules (Ex. La moelle épinière du poulet et le cortex cérébral des rongeurs)
La localisation de l’introduction de l’ADN peut être contrôlée par la position des électrodes
La période de l’introduction de l’ADN peut également être controlée
Quels sont les avantages de l’électroporation?
-On peut transfecter plusieurs types cellulaires in vivo, in utero et in vitro
-Possible de varier le niveau d’expression du gène en variant la force et le pattern du champ électrique
Expliquez ce qu’est la biolistique
Transfert d’un gène par particules en utilisant un fusil à gènes (gene gun)
Mélange de particules de métaux lourds (tungstène ou or) et d’ADN
Les particules de métaux lourds se lient à l’ADN qui est chargé négativement. Les particules/ADN sont chargées sur une balle en plastique
Un gaz sous pression, tel que l’hélium, est utilisé pour générer la force nécessaire pour propulser la balle dans le canon. Lorsque la pression du gaz atteint un niveau suffisant, elle rompt le disque de sécurité, libérant ainsi la pression qui propulse la balle le long du canon du fusil à gène
La balle en plastique est retenue à l’intérieur du conduit par un filtre alors que les particules qui sont liées à l’ADN sont éjectées à travers le filtre
Les billes d’or pénètrent la membrane cellulaire et ainsi elles introduisent l’ADN dans la cellule
Quels sont les avantages de la biolistique?
-Les cellules transfectées sont souvent dispersées. Ceci peut être un avantage lorsque nous voulons examiner la morphologie d’un neurone isolé suite à traitement
-Cette approche peut permettre d’introduire de l’ADN dans une structure ayant une certaine épaisseur comme une tranche de cerveau
Quels sont les inconvénients de la biolistique?
-Cette technique ne permet pas de transfecter des cellules in vivo. Exception foie et cellules de la peau
-Majeur : Peut causer des dommages importants aux cellules - Optimisation requise
À quoi consiste l’introduction de l’ADN par une méthode chimique?
-Utilisation d’un produit chimique pour faire rentrer l’ADN dans les cellules
-L’ADN chargé négativement peut former un macro-complexe avec un produit chimique chargé positivement
-Ces macro-complexes se fixent à la surface des cellules ce qui va promouvoir leur endocytose ou fusion avec la membrane
-Ces méthodes sont les plus couramment utilisées dans les laboratoire de recherche : très efficaces (haut pourcentage de cellules transfectées) et très simples à utiliser
-Inefficaces in vivo et donc elles sont principalement utilisées en culture cellulaire
-L’expression du gène est transitoire (peut durer quelques jours). Ceci dépend du type cellulaire (pas en culture donc)
Quels sont les produits chimiques les plus utilisés pour l’introduction ADN par une méthode chimique?
Phosphate de calcium
Lipides de transfection
Expliquez ce qu’est la transfection par phosphate de calcium
-La méthode la plus simple et la moins dispendieuse
-Elle requiert deux solutions : chlorure de calcium (source d’ions calcium) et le tampon salin d’HEPES (source d’ions phosphates)
-Mélange des deux solutions et de l’ADN mène à la formation d’un précipité, qu’on ajoute aux cellules
-Les cellules vont prendre le précipité et ainsi l’ADN par un processus qui n’a pas encore été élucidé (endocytose?)
-Cette méthode fonctionne très bien sur les cellules en monocouche
-Utile pour une expression transitoire
Quel est l’inconvénient majeur de la transfection par phosphate de calcium?
Son efficacité est faible pour transfecter des neurones (1-3%)
Que signifie lipofection?
Transfection en utilisant des complexes de lipides pour introduire l’ADN dans les cellules
Comment fonctionne la lipofection?
-Les membranes des cellules sont composées d’une couche bilipidique avec une surface hydropique du côté cytoplasmique et hydrophilique du côté extracellulaire
-La lipofection utilise des structures vésiculaires nommées liposomes qui ont la même composition que la membrane cellulaire
-Un liposome se forme autour de l’ADN, qui peut être endocyté (dépendaient du type de liposome et du type cellulaire) ou directement se fusionner avec la membrane cellulaire pour libérer l’ADN dans la cellule
Quel est l’avantage de la lipofection?
Cette technique fonctionne avec un très grand nombre de cellules incluant les neurones
Expliquez en quoi consiste l’introduction ADN en utilisant un vecteur viral
-Cette méthode est basée sur l’utilisation de vecteurs viraux pour introduire l’ADN dans les cellules in vitro et in vivo (cellules en cultures, tranches de cerveau, des explants de tissu et dans le cerveau in vivo)
-Un virus s’attache à une cellule dans le but d’y injecter son matériel génétique
-Ce matériel code pour des protéines nécessaires à la production du virus, les cellules infectées deviennent des usines à produire des virus
-Les virus utilisés en laboratoire ont été modifiés et donc ils ne peuvent plus se multiplier tout seul dans la cellule. Une région codante du virus est remplacées par la gène d’intérêt
Quels sont les caractéristiques de la lipofection?
-Des réactifs sont vendus par plusieurs compagnies - transfection se fait en moins de 30 minutes et l’expression de gène débute quelques heures après la transfection
-Comme la méthode de calcium, la lipofection est exclusivement utilisée en culutre
Quels sont les avantages des vecteurs viraux?
-Les infections virales sont robustes, très efficaces et peuvent conduire à une expression à long terme
-Outil de choix pour l’expression de gènes dans le cerveau d’animaux
Quels sont les inconvénients et limites des vecteurs viraux?
-Les cellules infectées peuvent commencer à exprimer le gènes plusieurs jours (7 à 14) après l’injection (pas d’expression immédiate du gène)
-La taille du vecteur viral limite la taille de l’ADN qui peut y être inséré
-Problème de biosécurité - l’expérimentateur doit faire attention pour ne pas s’infecter
Il existe plusieurs types de vecteurs viraux. En fonction de quoi varient-ils?
Efficacité à infecter les cellules
Niveau d’expression
Période d’expression
Le temps où comment l’expression
La toxicité cellulaire
La préférence de la cellule hôte
Comment se fait la production d’un virus?
La technologie de recombinaison homologue est utilisée pour construire un virus qui va contenir le gène d’intérêt
Insérer le gène d’intérêt dans un vecteur (vecteur navette) qui contient les séquences nécessaires pour son incorporation dans une particule virale
Co-transfection du vecteur navette avec le vecteur viral qui contient les séquences d’ADN qui codent pour les protéines virales : produit un virus qui ne peut pas se multiplier mais qui est fonctionnel et infectieux
La co-transfection est effectuée dans les cellules HEK 293T qui prolifèrent rapidement, se transfectent facilement et peuvent produire une grande quantité de virus
Quelques jours après la transfection, les cellules produisent plusieurs particules virales et les libèrent dans le milieu extracellulaire
La dernière étape de production de virus est de prélever le milieu et le centrifuger pour sédimenter les particules virales
Le culot est resuspendu dans un tampon pour usage immédiat ou congelé pour usage ultérieur
C’est ces virus qui seront utilisés pour la transduction
Quels sont les vecteurs viraux utilisés pour introduire de l’ADN?
Adénovirus
Virus Adéno-associé (AAV)
Lentivirus
Herpes Simplex virus (HSV)
Que font les AAV?
-AAV est un virus qui est naturellement déficient pour se multiplier
-Il a besoin d’un virus auxiliaire (helper) pour se multiplier. Il est donc plus sécuritaire que les autres virus
-Il peut infecter les cellules en division et les cellules post-mitotiques comme les neurones
-Contrairement à l’adénovirus, il peut s’intégrèrent dans le génome ce qui permet une expression à long terme
-Il est moins toxique pour les neurones que le virus adénovirus
-Sa production est très laborieuse
-Il peut contenir des ADN d’environ 5 kb
Que font les adénovirus?
Peut infecter les cellules en division et les cellules post-mitotiques comme les neurones
Peut contenir un ADN de 7.5 à 30 kb
L’ADN n’est pas intégré au génome, il s’agit donc d’une expression transitoire qui peut durer des semaines ou des mois
Peut causer une réponse inflammatoire et la mort cellulaire
Que font les lentivirus?
-Ce virus apparient à la famille de virus qui se nomment rétrovirus et qui possèdent un génome d’ARN plutôt que d’ADN
-Afin de générer des produits de gènes fonctionnels, le virus possède l’enzyme transcriptase inverse qui produit l’ADN complémentaire (ADNc) d’un ARN
-Quand une cellule endocytose un lentivirus, l’ARN est libéré et la transcriptase inverse produit l’ADNc
-L’ADNc migre au noyau où il. est intégré dans le génome de l’hôte, il y a donc expression à long terme
-La plupart des rétrovirus infectent seulement les cellules en division, ils sont donc utiles pour étudier le développement du système nerveux et le destin des cellules (cell faith)
-Cependant, le lentiirus est capable d’infecter les cellules mitotiques et post-mitotiques, c’est donc un virus très utilisé en neurosciences
-Lentivirus peut contenir un ADN de 8 kb
Comment est produit le lentivirus?
Plasmid mix
Co-transfect HEK 293T Lenti-X cell line
Collect lentiviral particules
Trasduce expression cell line
