Électrophysiologie - Cours 4 Flashcards
Quel est l’historique de l’électrophysiologie au 18e siècle?
Premières observations
Luigi Galvani : Ce médecin italien a observé que les muscles des grenouilles se contractaient lorsqu’ils étaient exposés à une source électrique. Il a introduit le concept d’“électricité animale”, suggérant que les animaux produisent leur propre électricité
Qu’est-ce que l’électrophysiologie?
Domaine des neurosciences qui explore l’activité électrique des neurones vivants et étudie les processus moléculaires et cellulaires qui régissent leur signalisation
Quel est l’historique de l’électrophysiologie au 19e siècle?
Émergence des concepts fondamentaux
Emil du Bois-Reymond : Physiologiste allemand qui a développé des techniques pour mesurer l’activité électrique des nerfs et des muscles, établissant l’électrophysiologie comme une discipline scientifique distincte
Julius Bernstein : Il a proposé l’hypothèse selon laquelle une différence de potentiel existe à travers la membrane cellulaire, conduisant au concept de “potentiel de membrane”
Quel est l’historique de l’électrophysiologie au 20e siècle?
Avancées majeures
Alan Lloyd Hodgkin et Andrew Fielding Huxley : Ce duo britannique a décrit en détail le mécanisme du potentiel d’action dans les neurones, pour lequel ils ont reçu le prix Nobel de physiologie ou médecine en 1963
Erwin Neher et Bert Sakmann : Ils ont développé la technique du patch-clamp. Pour cette avancée, ils ont été récompensés par le prix Nobel de physiologie ou médecine en 1991
Quelle est la concentration dans le cytoplasme (mM), dans le fluide extracellulaire et le potentiel d’équilibre (mV) de Na+?
Cytoplasme : 50
Fluide extracellulaire : 440
Potentiel d’équilibre : +55
Quel est le potentiel de repos d’un neurone?
Environ -70mV
Quelle est la concentration dans le cytoplasme (mM), dans le fluide extracellulaire et le potentiel d’équilibre (mV) de K+?
Cytoplasme : 400
Fluide extracellulaire : 20
Potentiel d’équilibre : -75
Lors du potentiel de repos, quelles pressions y a t-il?
Pression vers l’extérieur des ions K+
Pression vers l’intérieur des ions Na+ et Cl-
Quelle est la concentration dans le cytoplasme (mM), dans le fluide extracellulaire et le potentiel d’équilibre (mV) de Cl-?
Cytoplasme : 52
Fluide extracellulaire : 560
Potentiel d’équilibre : -60
Quelle est la concentration dans le cytoplasme (mM), dans le fluide extracellulaire et le potentiel d’équilibre (mV) de A- (anions organiques)?
Cytoplasme : 385
Fluide extracellulaire : -
Potentiel d’équilibre : -
Expliquez la génération d’un PPSE
Une impulsion arrivant dans la terminaison présynaptique provoque la libération d’un neurotransmetteur
Les molécules se lient aux canaux ioniques déclenchés par l’émetteur dans la membrane post synaptique. Si Na+ pénètre dans la cellule postsynaptique par les canaux ouverts, la membrane se dépolarise
Le changement résultant du potentiel de membrane (Vm) est le PPSE
Expliquez la génération d’un PPSI
Une impulsion arrivant dans la terminaison présynaptique provoque la libération d’un neurotransmetteur
Les molécules se lient aux canaux ioniques déclenchés par l’émetteur dans la membrane postsynaptique. Si Cl- pénètre dans la cellule postsynaptique par les canaux ouverts, la membrane s’hyperpolarise
Le changement résultant du potentiel de membrane (Vm) est le PPSI
Comment se “crée” en étape le potentiel d’action
Les canaux Na+ s’ouvrent faisant monter le PA
Les canaux K+ s’ouvrent faisant monter le PA
Les canaux Na+ ferme lorsque le PA est au maximum, le fait baisser
Les canaux K+ ferment
Donnez des synonymes de potentiel d’action
Action potential
Spike
Expliquez la microélectrode (électrode d’enregistrement)
Les électrodes de verre sont remplies avec la solution isotonique d’électrolytes :
- 2-3M KCl ou K-acétate pour le type de “Sharp” électrodes (pour les enregistrements intracellulaire)
- NaCl ou ACSF pour les électrodes extracellulaires (enregistrements extracellulaires)
- Solution “intracellulaire” pour les électrodes de “patch-clamp” (enregistrement de façon cellule entière)
Expliquez la perfusion
Perfusion de la chambre d’enregistrement avec une solution isotonique d’électrolytes, par exemple avec l’ACSF
Artificial CerebroSpinal Fluid = solution cérébrospinale artificielle
Qu’est-ce que le préamplificateur (headstage)?
Le préamplificateur est le premier niveau de détection de signal. Il transmet le signal vers l’amplificateur
Quelles sont les deux électrodes nécessaires pour tout enregistrement électrophysiologique?
L’électrode d’enregistrement
L’électrode de référence (Bath electrode, ground electrode) placée à l’extérieur de la cellule d’intéret
Pourquoi utiliser une électrode de stimulation?
Utilisée pour appliquer un courant électrique à un tissu ou des cellules
Expliquez le support de pipette
La pipette de verre (microélectrode) est remplie de la solution isotonique
Le fil d’électrode (en argent) baigne dans la solution
Le fil d’enregistrement passe par le joint et touche au contact électrique, qui est lié au pré-amplificateur
Un continuum du courant électrique est créé et c’est ce qui nous permet d’enregistrer
Pourquoi l’électrode de référence est nécessaire?
Car une mesure électrophysiologique est une comparaison
Par exemple, on compare la différence de potentiel à travers la membrane d’une neurone
Important également pour la précision et l’amélioration du signal
À quoi sert le microdrive?
Pour position l’électrode dans le neurone (ou le tissu). Il est contrôlé par un micromanipulateur pour éliminer les vibrations
Expliquez l’amplificateur et l’interfaçe analogue-digitale
L’amplificateur amplifie le signal du préamplificateur. En plus, il exécute les changements imposés par l’expérimentateur
Interface analogue-digitale : le signal analogique de l’amplificateur est digitalisé pour l’ordinateur
Qu’est-ce que le micromanipulateur?
Le micromanipulateur contrôle le microdrive. Il permet un positionnement précis de la microélectrode. Des mouvements fins sur les axes X, Y et Z (par exemple des mouvements fins de 0.1 micromètre)
Que fait l’oscilloscope?
Affiche le signal provenant de l’amplificateur. Cependant, de nos jours ce n’est plus fait par l’oscilloscope, mais par l’ordinateur dans la plupart des cas!
Qu’est-ce qu’est le stimulation isolation unit?
Dans le but d’améliorer le bruit électrique, l’amplificateur va stimuler l’électrode de stimulation via une unité électriquement isolée, le stimulation isolation unit
Le pulse électrique généré par le stimulation isolation unit est possible grâce à la décharge d’une batterie
Que fait le microscope?
Le microscope est nécessaire pour déplacer l’électrode de stimulation et la microélectrode. Faible grossissement pour les enregistrements extracellulaires et fort grossissement pour les enregistrements intracellulaires et patch-clamp
Que fait la cage de faraday?
La cage isole le poste d’électrophysiologiste contre le bruit électrique de l’extérieur (par exemple des pompes électriques à proximité, téléphones cellulaires, etc.)
Que fait l’ordinateur ?
Les ordinateurs permettent d’écrire des programmes de stimulation, d’enregistrer les réponses des neurones et d’analyser les données acquises
Que fait la table anti-vibrations (air table)?
La table anti-vibrations permet le placement des électrodes sans interférences avec les vibrations (la table est lourde et repose sur de l’air sous pression)
Quelles sont les trois différentes préparation in vitro?
Système d’expression hétérologue
Cellules primaires isolées
Tranches de cerveau
Comment se font les enregistrements in vitro?
Les préparations de culture in vitro offrent un accès physique et visuel inégalé à des cellules individuelles, permettant des études détaillées sur les molécules et les protéines qui affectent la physiologie neuronale
On contrôle les médias d’incubation ou la solution de bain (par exemple, on peut tester les effets de substances pharmacologiques dans le bain)
Donnez des exemples de systèmes d’expression hétérologues
Les ovocytes de Xenopus laevis, les cellules ovariennes de hamster chinois (CHO) et les cellules rénales embryonnaires humaines (HEK 293T)
Pour quelles raisons faire un enregistrement in vitro de systèmes d’expression hétérologue?
-Cellules faciles à transfecter pour faire exprimer la protéine d’intérêt (par exemple un canal ionique)
-La protéine d’intérêt n’est normalement pas exprimé de manière endogène
-La machinerie cellulaire pour le transport membranaire, l’assemblage des protéines et les modifications post-transcriptionnelles pourraient être absents
Expliquez l’enregistrement in vitro : cellules primaires isolées
Les cultures de neurones dissociés à partir d’une région d’intérêt (par exemple, le cortex, l’hippocampe, la moelle épinière, etc.)
On peut étudier la protéines exprimée de manière endogène (par exemple un des canaux ioniques)
Très bonne visibilité de la cellule pour patch-clamp, etc.
Attention! Ces cellules forment des connexions synaptiques en culture. Cela ne représente pas des connexions neurones normales dans un circuit
Expliquez l’enregistrement in vitro : tranches de cerveau
On fait des cultures de coupes de tissus entiers. Ces cultures peuvent être conservés de plusieurs heures à plusieurs semaines
-Les enregistrements intracellulaires sont plus faciles que in vivo (le tissu ne bouge pas)
-Le rôle des neurones dans un circuit peut être étudié
-Les cultures à long terme permettent l’expression de protéines ectopiques (via virus, canons à gènes, etc.)
Attention!
-Visibilité moins bonne qu’avec des cultures isolées primaires
-Les substances pharmacologiques ajoutées au bain doivent pénétrer dans le tissu
-La connectivité synaptique pourrait changer dans les cultures à long terme
Quels sont les trois types de techniques d’électrophysiologie?
Enregistrement extracellulaire
Enregistrement intracellulaire
Patch-clamp
Expliquez les principes d’enregistrement etracellulaire
Les enregistrements extracellulaires mesurent les différences de potentiel sur la surface extérieure d’un neurone actif (la différence de potentiel entre le bout de la microélectrode et l’électrode de référence)
Le principal avantage est que c’est relativement facile à faire
Par contre, il est impossible de mesurer des évènements sous le seuil (sub-threshold) d’une seule cellule
Mais, la réponse synaptique de nombreux neurones produit des potentiels de champ local mesurables
Les potentiels de champ locaux = la somme de l’activité synaptique de nombreux neurones
Quel sont les types d’électrodes utilisés lors d’enregistrement extracellulaire?
Seulement une microélectrode extracellulaire ou plusieurs groupements d’électrodes (les tétrodes et les matrices d’électrodes multiples)
Quelle est la forme du potentiel d’action lors d’enregistrement extracellulaire?
La courbe enregistrée du potentiel d’action est différente de la courbe “classique”
Montre une hyperpolarisaiton, puis une dépolarisation
Quels sont les avantages de l’enregistrement intracellulaire (sharp electrode)?
Échange minimale de la solution de la pipette avec le cytoplsame
Expliquez le potentiel de champs locaux pour l’enregistrement extracellulaire
Ouverture des canaux ioniques présynaptiques : petite hyperpolarisation
Ouverture des canaux ioniques en post-synaptique : grande hyperpolarisation après la dépolarisation
Le temps entre les deux pics est le temps que prend le neurotransmetteur pour se rendre au niveau post-synaptique
Quels sont les inconvénients de l’enregistrement intracellulaire (sharp electrode)?
-Difficile à réaliser avec les petits neurones
-Enregistrement en voltage imposé impossible (on a besoin de deux électrodes)
Que détectent les enregistrement intracellulaires?
Les petits changements du potentiel de membrane local causé par des évènements synaptiques
La microélectrode empale le neurone!
Expliquez Whole-cell
Il y a un continuum entre la solution de la pipette et celle dans le neurone
Si on est en whole-cell mode, il est aussi possible de retirer la pipette pour passer en mode outside-out
Expliquez l’enregistrement en patch-clamp
La micropipette est approchée de la membrane plasmique du neurone
Une légère succion exercée à l’intérieure de la pipette entraîne la formation d’un contact très étroit entre la membrane et la pipette (giga-ohm-seal)
Cette technique permet une isolation électrique du morceau de membrane sous la pointe de la pipette
Quels sont les différentes configurations d’enregistrement patch-clamp?
Pipette attachée à la cellule (cell attached configuration)
Extérieur-extérieur (outside-out configuration)
Cellule entière (whole-cell configuration)
Intérieur-extérieur (inside-out configuration)
Le patch perforé
Expliquez l’enregistrement en patch-clamp “pipette attachée à la cellule”
La pipette est vraiment attachée à la cellule, via la succion Possibilité d’enregistrer des courants du canal ionique dans la pipette
La succion est tellement forte que si je tire sur la pipette, on enlève un bout de la membrane. Ce qui amène deux possibilités : Inside-out et Whole-cell
Expliquez Inside-Out
La partie du canal qui était dans la cellule est maintenant à l’extérieur, dans le bain
Expliquez le outside-out
La succion est tellement forte qui si je tire sur la pipette, on enlève des bouts de membrane
Parce que la membrane est hydrophobe (ou lipophile), les deux bouts de membrane vont s’attacher ensemble
Outside-out : ce qui était à l’extérieur reste à l’extérieur
Qu’est-ce que la CONFIGURATION de extérieur-extérieur (outside-out)?
Le milieu “intracellulaire” est le milieu à l’intérieur de la pipette et le milieu extracellulaire est le milieu du bain. Donc, on peut changer rapidement le milieu extracellulaire avec un système de fast-step perfusion
Expliquez ce qu’est le patch perforé
La solution de la pipette contient un produit chimique qui provoque de petites perforations dans la membrane Cela permet une petite conductance ionique mais pas de fuite du cytoplasme
Qu’est-ce que la CONFIGURATION intérieur-extérieur (inside-out)?
Le milieu “intracellulaire” est le milieu du bain et le milieu extracellulaire est le milieu à l’intérieur de la pipette. Donc, on peut changer rapidement le milieu “intracellulaire” avec un système de fast-step perfusion
Quels sont les avantages de la configuration pipette attachée à la cellule (cell-attached)?
Facile
Le milieu intracellulaire reste intact
Possibilité d’enregistrer un seul canal ionique
Quels sont les désavantages de la configuration cellule entière (whole-cell)?
Échange entre le cytoplasme et la solution de la pipette : la perte de constituants intracellulaires (wash-out)
Les neurones de la régions CA3 projettent leurs axones vers les dendrites des neurones de la région CA1. Il est donc possible de stimuler les neurones en CA3 et d’enregistrer la réponse synaptique des neurones de la région CA1. Comment on fait ça?
1- Tirez une pipette (3-5 MOhm de résistance) et remplissez-la avec la solution “intracellulaire”
2- Début de la perfusion de la chambre d’enregistrement avec de l’ACSF (température constante de l’ACSF est nécessaire!)
3- Mettez la tranche dans la chambre d’enregistrement
4- Placez vos électrodes de stimulation
5- Placez la pipette d’enregistrement dans le ACSF dans la chambre d’enregistrement
6- Appliquer une pression positive (pour s’assurer que rien ne rentre dans la pipette)
7- Vérifier si des bulles d’air obstruent la pointe de la pipette
8- Mise du potentiel à 0 mV (Pas de différence de potentiel entre l’électrode de référence et l’électrode d’enregistrement)
9- Le système impose une impulsion voltage rectangulaire pour calculer la résistance de l’électrode d’enregistrement
10- Approcher le tissu (pression positive)
11- Positionner l’électrode à côté du neurone
12- Approcher la membrane avec soin et regarder pour la formation d’une fossette (puisque la pression est positive, la membrane est “poussée” par la pipette)
13- Relâcher la pression et appliquer un peu de succion (la membrane s’attache à la pipette)
14- Vérifier le joint giga-Ohm (La membrane bloque le courant)
15- Si l’on fait un whole-cell patch-clamp, il y a rupture de la membrane
16- On vérifie que tous les paramètres sont bons (Rm et Ra)
Quels sont les désavantages de la configuration pipette attachée à la cellule (cell-attached)?
On ne contrôle pas le milieu intracellulaire
La valeur du potentiel à la membrane n’est pas connue
Quels sont les avantages de la configuration cellule entière (whole-cell)?
Enregistrement du voltage imposé (le contrôle du potentiel de membrane est excellente en raison de la “grande” ouverture de la pipette)
Échange entre le cytoplasme et la solution de la pipette : certain contrôle de la composition du milieu intracellulaire
Quelle est la “règle” lorsque l’on fait du whole-cell?
En voltage imposé, un courant positif entrant dans le neurone est toujours tracé vers le bas. Alors…
-À -60mV, les ions sodiques vont entrer dans la cellule, donc courbe vers le bas
-À +40mV, les ions potassiques vont sortir de la cellule, donc courbe vers le haut
Quels sont les 2 paramètres importants de l’enregistrement en patch-clamp?
Rm = Résistance de la membrane = résistance de toute la cellule
Ra = résistance de l’axe = résistance à la pipette
Comment savons-nous qu’on a un bon accès au milieu intracellulaire avec notre pipette?
En observant le ratio de Rm/Ra.
Plus le ratio se rapproche de 10, plus on a un bon accès au milieu intracellulaire avec notre pipette
Si des fragments membranaires bloquent la pipette…
Le Ra augmente
Expliquez comment on peut vous des évènements miniatures spontanés
On bloque les canaux sodiques avec du TTX dans le bain. En bloquant les canaux sodiques, on bloque les potentiels d’action
Malgré cela, il est possible d’enregistrer les évènements miniatures spontanés (petites relâches de neurotransmetteurs)
Les changements de fréquences sont indicatifs de changements présynaptiques
Les changements d’amplitudes sont indicatifs de changements post-synaptiques
