Le clonage moléculaire et ADN recombinant - Cours 6 Flashcards
Que se passe-t-il dans les années 1950-1960 en biologie moléculaire?
Fondations de la biologie moléculaire
1953: James Watson et Francis Crick décrivent la structure en double hélice de l’ADN, jetant les bases de la compréhension moderne de la génétique. Prix Nobel de physiologie/médecine 1962 (avec Maurice Wilkins). Par contre, il ne faudrait pas oublier Rosalind Franklin …
Que se passe-t-il à la fin des années 1960 en biologie moléculaire ?
Les scientifiques commencent à étudier les enzymes de restriction,
des protéines qui peuvent couper l’ADN à des endroits spécifiques.
Que se passe-t-il dans les années 1970 en biologie moléculaire?
Naissance de la technologie de l’ADN recombinant
1972: Paul Berg crée la première molécule d’ADN recombinant en combinant l’ADN de deux organismes différents.
1973: Herbert Boyer et Stanley Cohen réussissent la première
expérience de clonage génétique.
1975: La conférence d’Asilomar
Que se passe-t-il en 1982 en biologie moléculaire?
La FDA approuve l’insuline humaine produite par des bactéries
génétiquement modifiées, le premier médicament produit grâce à la
technologie de l’ADN recombinant.
Que se passe-t-il en 1996 en biologie moléculaire?
Dolly est clonée !
Que se passe-t-il à la fin des années 1980 en biologie moléculaire?
Les techniques de clonage moléculaire sont de
plus en plus utilisées pour étudier l’expression génique et produire
des protéines d’intérêt.
Que se passe-t-il en 1990 en biologie moléculaire?
Début du Projet Génome Humain, une initiative internationale
visant à séquencer l’ensemble du génome humain.
Que se passe-t-il en 2003 en biologie moléculaire?
Achèvement du Projet Génome Humain
Que se passe-t-il de la fin des années 2000 à aujourd’hui en biologie moléculaire?
Développement de nouvelles
techniques de séquençage d’ADN et d’édition génomique, comme
CRISPR-Cas9.
Expliquez ce qu’est la transcription
Chaque séquence de 3 nucléotides code pour un acide aminé.
Suite à la transcription, l’ARN est épissé.
Chez l’humain: ~100 000 transcrits
Quelles sont les caractéristiques de l’ARNm?
- Ribose au lieu de 2-deoxyribose
- Simple brin
- Thymine (T) est remplacé par uracile (U)
Expliquez ce qu’est la traduction
Il y a un code précis pour la conversion des nucléotides en acides aminés.
* Chaque codon code pour un acide aminé spécifique.
* Chez l’humain: > 1 000 000 protéines.
* Les différents isoformes d’ARNm produisent des protéines différentes.
* Les modifications post-traductionnelles (phosphorylation,
ubiquitination, etc.) contribuent aussi à la diversification protéique.
Expliquez l’étape 1: Élaborer un test afin de mesurer le phénotype (dans le criblage classique)
- Simple
- Quantitatif
- Permettant de distinguer les animaux normaux de ceux qui ont
un phénotype anormal
Quelles sont les étapes d’un criblage classique?
Étape 1: Élaborer un test afin de mesurer le phénotype
Étape 2: Obtenir un mutant
Étape 3: Dépistage d’un phénotype anormal
Étape 4: Regroupement des mutants
Étape 5: Localiser le gène
Pourquoi effectuer un criblage classique?
Afin d’identifier des gènes causant un phénotype anormal.
Qu’est-ce que le criblage classique (ou foward)?
- Identifier les gènes importants pour un phénotype biologique
- Milliers de gènes à la fois
- Permet de générer des hypothèses
Qu,est-ce que le criblage inversé (ou reverse)?
- Sélectionner un gène et déterminer les phénotypes associés
- Un seul gène à la fois
- Permet d’évaluer une hypothèse
Comment peut-on faire l’étape 2: Obtenir un mutant (dans le criblage classique) ?
- Mutations naturelles
- Mutagenèse chimique, ex. Méthanesulfonate d’éthyle (EMS) et
N-nitroso-N-éthylurée (ENU) - Mutagenèse par irradiation (UV haute-intensité)
- Mutagenèse par insertion (transposon)
Que provoque les mutagenèses chimiques?
Provoque des mutations ponctuelles (un seul nucléotide)
Que peuvent être les mutations?
- Non-sens (remplacement d’un codon codant un acide aminé par un codon-stop)
- Faux-sens (remplacement d’un codon codant un acide aminé par un autre)
- Dans la séquence non-codante (influence l’épissage et les éléments régulateurs)
Quelles peuvent être les conséquences d’une mutation?
Changement de l’acide aminé
Création d’un codon stop
Création ou délétion d’un site d’épissage
Que provoque les mutagenèse par irradiation?
Provoque des ruptures dans l’ADN double brin
Génère des grandes délétions ou réarrangements chromosomique
Que sont les mutagenèse par insertion (transposon)?
Contient un gène marqueur
* Possibilité d’insertion dans la région codante (perturbe la séquence d’acides aminés)
* Possibilité d’insertion dans les régions non-codante adjacentes (perturbe l’épissage ou l’expression du gène)
Expliquez comment l’on fait l’étape 3 : Dépistage d’un phénotype anormal (dans le criblage classique)
- La première génération est « instable » et mosaïque.
- Après plusieurs générations, la/les mutations sont fixées.
- Les lignées sont évaluées (on produit entre 100 et 1000 lignées) (test étape 1).
- Les lignées avec phénotype sont maintenues (possibilité de outcross).
Expliquez comment l’on fait l’étape 4: Regroupement des mutants (dans le criblage classique)
- Complémentation: fait la distinction entre mutation dans le même gène ou gènes différents.
- Test allélique: Est-ce que 2 mutants ensemble peuvent restaurer le phénotype normal?
Qu’est-ce que la complémentation génétique?
La complémentation génétique est une méthode qui permet d’identifier si deux mutations récessives affectent le même gène ou des gènes différents.
Cette technique est utilisée dans les études génétiques pour identifier des groupes de gènes fonctionnels impliqués dans un même processus biologique.
Les deux mutant sont complémentaires, le phénotype normal est restauré.
Mutations sur des gènes différents
Que se passe-t-il en absence de complémetation?
Les deux mutant ne sont pas
complémentaires, le phénotype normal n’est pas restauré.
Mutations sur le même gène
Expliquez comment l’on fait l’étape 5: Localiser le gène (dans le criblage classique)
Utilisation de techniques permettant de cartographier le gène responsable d’une mutation ou d’un phénotype.
* Séquence du transposon (mutagénèse par insertion)
* Analyse de liaison (mutagénèse chimique et irradiation)
* À chaque croisement il y a recombinaison
* Des marqueurs (SNPs ou mutations) permettent de suivre les recombinaisons
* La détermination de l’empreinte génétique permet l’identification du locus/gène
Pourquoi effectuer un criblage inversé?
Afin d’étudier un gène d’intérêt et son influence sur divers phénotypes.
On identifie donc un gène d’intérêt et on « perturbe » ce gène pour déterminer son rôle suivant la variation des phénotypes (knockout, édition du génome, etc.).
Quelles sont les fonctions de siARN et shARN?
Les siARN et shARN ont pour fonction principale de réduire ou arrêter l’expression d’un gène spécifique. Cela se fait en ciblant l’ARNm correspondant au gène pour provoquer sa dégradation, un processus appelé silencing génique.
Qu’est ce que siARN et shARN?
siARN: Petits ARN interférents
shARN: ARN courte épingle à cheveux
Quelles sont les étapes de l’utilisation de siARN et shARN?
- shARN est délivré par plasmide ou virus, tandis que le siARN est directement injecté.
- Transcription du shARN
- Brisure de la forme « épingle à cheveux » du shARN
- Le complexe RISC vient défaire l’ARN double brin
- Reconnaissance de la séquence cible
- Arrêt/diminution de l’expression
Par quoi peut se faire l’édition du génome ?
Le triumvirat :
CRISPR/Cas9 (la méthode la plus utilisée)
TALEN = transcription-activator-like effector nuclease
Zinc Finger
Qu’est-ce que le ZNF?
ZFN = endonucléases qui combinent un domaine de liaison à l’ADN, appelé “doigt de zinc”, avec une enzyme de coupure de l’ADN, en l’occurrence Fok1.
Quelle est la structure du Zinc finger ?
Chaque doigt de zinc reconnaît et se lie à une séquence spécifique d’ADN (environ 9 nucléotides). Pour chaque séquence cible, il faut deux domaines de liaison à l’ADN (un à gauche et un à droite) séparés par un espaceur de 5 à 7 nucléotides.
Quel est le domaine de clivage du Zinc Finger?
Le domaine de clivage est constitué de l’enzyme Fok1, une endonucléase qui doit former un dimère pour couper l’ADN.
Comment se fait la coupure de l’ADN par le Zinc Finger?
Une fois les deux ZFN liés aux séquences cibles, Fok1 clive l’ADN au niveau de l’espaceur, ce qui génère une cassure double-brin. La réparation de cette cassure par la cellule peut entraîner des mutations (indel sur le graphique) qui perturbent le gène cible.
Qu’est-ce que le TALEN?
Nucléases qui utilisent des domaines d’effecteurs TAL pour reconnaître des séquences spécifiques d’ADN, couplées à l’enzyme Fok1 pour cliver l’ADN.
Quelle est la structure du TALEN?
Chaque domaine TAL reconnaît une séquence spécifique de nucléotides (16 -17 nucléotides par site cible). Comme avec ZFN, les domaines TAL sont utilisés par paires pour cibler des séquences spécifiques des deux côtés d’une région d’ADN à couper, séparées par un espaceur de 16-19 nucléotides.
Quel est le but de CRISPR/Cas9?
Inactiver l’ADN viral exogène en induisant une cassure double brin
Quel est le domaine de clivage et comment se fait la coupure de l’ADN pour TALEN?
Comme avec ZFN, Fok1 doit être dimérisé pour fonctionner. Lorsque les deux TALEN se lient à leurs séquences cibles respectives, Fok1 coupe l’ADN au niveau de l’espaceur, provoquant une cassure double-brin. Une fois l’ADN coupé, la cellule tente de réparer cette cassure, générant des mutations qui peuvent désactiver un gène.
Quelles sont les 2 composantes essentielles de CRISPR/Cas9?
- La protéine associée au CRISPR (Cas 9)
- Un ARN guide (ARNg)
Qu’est-ce que Cas9?
Endonucléase clivant l’ADN et encodé dans l’opéron Cas du chromosome bactérien
Qu’est-ce que le locus CRISPR?
Instructions essentielles à la synthèse de différents ARNg
Quels sont les 2 segments de l’ARNg?
- ARN CRISPR (ARNcr). Sert au criblage de l’ADN viral par appariement de bases
- ARN CRISPR trans-activant (ARNtracr). Séquence palindromique qui adopte une structure 3D servant d’échafaudage moléculaire pour l’ancrage de l’ ARNg
Qu’est-ce que la séquence PAM?
Mécanisme de sécurité. Motif de 3-5 nucléotides présent uniquement de l’ADN cible du coté 3’
Quel est le principe du CRISPR/Cas9 (étapes générales)?
- Créer un ARNg synthétique en modifiant la portion ARNcr pour cibler une séquence cible.
- Un complexe Cas 9/ARNg est créer et s’hybride a la séquence cible.
- La séquence PAM peut varier selon l’origine de la Cas 9.
- Deux voies de réparation:
1. Jonctions d’extrémités non homologues (NHEJ)
2. Réparation par recombinaison homologue (HDR) - L’addition d’un brin d’ADN sœur contenant une séquence précise peut être utilisé comme matrice pour incorporer une mutation précise
Quelles sont les étapes de CRISPR/Cas9?
- Sélection de la cible (gène à inactiver)
- Conception des ARN guides (gRNA)
- Préparation du système CRISPR/Cas9
- Introduction des mutations (KO)
- Validation du Knock-Out
- Contrôle des effets hors-cibles
Comment se fait l’étape 1 : Sélection de la cible (gène à inactiver) (pour CRISPR/Cas9)?
Identification du gène d’intérêt: Par exemple, dans une étude sur la maladie de Parkinson, on pourrait choisir de cibler le gène SNCA qui code pour l’alpha-synucléine.
Détermination de la région cible: En général, on vise une région exonique importante du gène (souvent les premiers exons) pour garantir que la mutation entraîne une perte complète de la fonction de la protéine. On peut choisir un exon essentiel à la fonction de la protéine ou qui, lorsqu’il est muté, entraîne un décalage du cadre de lecture (frameshift).
Comment se fait l’étape 2 : Conception des ARN guides (gRNA) (pour CRISPR/Cas9)?
Le CRISPR/Cas9 repose sur des ARN guides (gRNA) pour cibler la séquence d’ADN spécifique.
* Choix de la séquence cible: Le gRNA doit être conçu pour cibler une séquence proche du site de coupure souhaité. Cette séquence doit être adjacente à un site PAM (Protospacer Adjacent Motif), qui est essentiel pour l’activité de Cas9 (généralement la séquence “NGG”).
- Conception des gRNA efficaces: Des algorithmes en ligne, comme ceux proposés par des outils tels que CRISPOR, CHOPCHOP ou Benchling, aident à identifier les séquences d’ARN guide optimales. Ces outils tiennent compte de critères comme :
- La spécificité (éviter les sites hors-cibles).
- L’efficacité (probabilité de coupure réussie).
- La proximité des sites exoniques essentiels du gène.
Comment se fait l’étape 3 : Préparation du système CRISPR/Cas9 (pour CRISPR/Cas9)?
Une fois les gRNA conçus, il faut préparer le système d’édition CRISPR. Deux principales méthodes sont utilisées pour introduire le complexe CRISPR/Cas9 :
* Vectorisation via plasmides: Les gènes codant pour l’enzyme Cas9 et le gRNA sont introduits dans les cellules à l’aide de plasmides. Ce système permet une expression durable du complexe CRISPR/Cas9.
* Électroporation de ribonucléoprotéines (RNPs): Le complexe protéique Cas9 et le gRNA peuvent être directement introduits dans les cellules via électroporation ou transfection, ce qui permet une action plus rapide et réduit les risques de mutations hors-cibles.
Comment se fait l’étape 4 : Introduction des mutations (KO)(pour CRISPR/Cas9)?
Lorsque Cas9 est exprimée dans la cellule, elle va couper l’ADN double brin au site cible, induisant un mécanisme de réparation par non homologous end joining (NHEJ). Ce processus est souvent sujet à des erreurs, ce qui conduit à …
Indels (insertions/délétions): Ces petites mutations provoquent souvent un décalage du cadre de lecture (frameshift), entraînant la production d’une protéine tronquée non fonctionnelle, aboutissant au knock-out du gène.
Comment se fait l’étape 5 : Validation du Knock-Out (pour CRISPR/Cas9)?
Après avoir introduit les mutations, il est essentiel de valider que le gène ciblé est bien inactivé :
* Séquençage du locus cible: On utilise le séquençage pour vérifier que les mutations attendues (indels) sont bien présentes dans notre gène (SCNA dans ce cas)
* Analyse de l’expression génique/protéique: Une analyse par qPCR et Western blot/immunohistochimie permet de vérifier si les ARNm et la protéine codée par le gène KO est effectivement absente ou réduite.
Tests fonctionnels: électrophysiologie, tests comportementaux chez les animaux KO, etc, pour vérifier que la fonction neuronale ou le comportement est altéré en conséquence de l’inactivation du gène.
Comment se fait l’étape 6 : Contrôle des effets hors-cibles (pour CRISPR/Cas9)?
Il est important de vérifier que le système CRISPR/Cas9 n’a pas introduit de mutations indésirables dans d’autres parties du génome.
Séquençage des sites hors-cibles potentiels: Les algorithmes utilisés pour concevoir les gRNA génèrent également des listes de sites génomiques similaires (potentiels hors-cibles). Ces sites peuvent être séquencés pour vérifier l’absence de mutations.
Pourquoi effectuer un criblage génétique chez l’humain?
Afin d’identifier un locus d’intérêt associé avec un phénotype.
