Visualisation de la fonction du système nerveux - Cours 10

Question 1

Quelles sont les deux principales approches pour étudier la dynamique via des marqueurs statiques?

Answer 1

• Observer indirectement la présence d’activité en mesurant des produits qui s’accumulent durant ou après le processus.
• Incorporer un marqueur dans les cellules. Ce dernier indique la présence d’activité dans des futurs examens histologiques.

Question 2

Comment pouvons-nous évaluer l’activité neuronale dans les tissus fixés?

Answer 2

• L’activité neuronale induit rapidement la transcription transitoire d’un groupe de gènes connus comme les gènes précoces immédiats (immediate early genes: IEGs). Ces gènes sont activés rapidement, souvent en quelques minutes, en réponse à une activité neuronale. Cette transcription transitoire est un indicateur précoce et indirect de l’activité dans une région donnée du cerveau.
• Ces IEGs codent pour une diversité de protéines jouant des rôles clés dans la plasticité neuronale.
• Les IEGs ne donnent qu’un premier indice sur la fonction d’une région du cerveau. Ils indiquent qu’une activité a eu lieu, mais pas nécessairement pourquoi ou comment cette activité s’intègre dans le réseau neuronal. Pour aller au-delà, il faut combiner ces approches avec d’autres méthodes dynamiques ou fonctionnelles.

Question 3

Donnez des exemples de protéines jouant des rôles clés dans la plasticité neuronale codées par les IEGs

Answer 3

• Des facteurs de transcription, comme c-fos, c-myc et c-jun, qui régulent l’expression de nombreux autres gènes.
• Des protéines interactives avec le cytosquelette, comme Arc, qui participent à la réorganisation structurelle des synapses.
• Des facteurs de croissance, comme le BDNF (brain-derived neurotrophic factor), qui favorisent la survie et l’adaptabilité des neurones.

Question 4

Quelles sont les limitation de l’évaluation de l’activité neuronale dans les tissus fixés?

Answer 4

• Le tissu est fixé, donc ça ne reflète pas la véritable dynamique de l’activité neuronale en temps réel (arrêt sur image ou snapshot)
• L’analyse à un moment précis ne capture pas la continuité ou l’évolution des changements neuronaux. Ce que nous voyons à un instant peut ne pas refléter l’ensemble du processus ou la nature transitoire des signaux neuronaux (et ce, même si on utilise plusieurs timepoints de tissus fixés)
• Les données obtenues à partir de tissus fixés doivent être interprétées avec prudence. Il est souvent nécessaire de compléter ces résultats par d’autres types d’études, notamment des méthodes dynamiques ou fonctionnelles, pour s’assurer que les changements observés sont pertinents et bien reliés à la fonction neuronale.

Question 5

Nommez des méthodes histologique pour détecter les IEGs

Answer 5

L’hybridation in situ
L’immunihistochimie

Question 6

Comment fait-on l’hybridation in situ pour détecter les IEGs?

Answer 6

• Il faut connaître la séquence génétique de l’ARNm !
• Utilisation d’une sonde d’acide nucléique simple brin complémentaire à la séquence de de l’ARNm d’intérêt (antisens)
• La sonde doit être marquée pour pouvoir la voir (nucléotides radioactifs, etc).
• Incuber la sonde avec le tissu: la sonde ira s’hybrider avec notre ARNm d’intérêt

Utilisation du Allen Brain Atlas

Question 7

Comment fait-on l’immunohistochimie pour détecter les IEGs?

Answer 7

L’immunohistochimie (IHC) est une technique essentielle pour détecter les gènes précoces immédiats (IEGs) dans les tissus fixés. Cette méthode repose sur l’utilisation d’anticorps pour localiser et visualiser des protéines spécifiques associées à l’activité neuronale.

Détection :
* IHC directe: l’anticorps primaire est conjugué avec un fluorophore/enzyme chromogénique
* IHC indirecte: utilisation d’un anticorps secondaire conjugué avec un fluorophore/enzyme chromogénique

Amplification de signal: c’est quand plus d’un anticorps secondaire peut reconnaitre l’anticorps primaire

• Molécules rapportrices: fluorophores, phosphatase alcaline, peroxydase, etc.

Question 8

Quel est un marquer de l’activité dans le cortex visuel?

Answer 8

L’immunoréactivité de c-Fos

Question 9

Comment peut-on évaluer la prolifération cellulaire ?

Answer 9

Incorporation d’un marqueur dans les cellules
Utilisation des analogues de la thymidine

Question 10

Expliquez comment se fait l’évaluation de la prolifération cellulaire avec des analogues de la thymidine

Answer 10

• Le Bromodésoxyuridine (BrdU), ou 5-bromo-2’-désoxyuridine, est un nucléoside analogue synthétique de la thymidine. C’est un outil largement utilisé pour détecter la prolifération cellulaire dans les tissus vivants.
• Lorsque les cellules se divisent, elles répliquent leur ADN. Pendant ce processus, le BrdU peut être intégré dans l’ADN à la place de la thymidine. Cela signifie que les cellules qui incorporent le BrdU sont en phase de synthèse (phase S) du cycle cellulaire, ce qui indique une prolifération active.
• Cette technique est particulièrement précieuse en neurosciences pour étudier des phénomènes comme la neurogenèse, où de nouvelles cellules sont produites dans des régions spécifiques du cerveau. Après l’incorporation du BrdU, on peut utiliser des méthodes comme l’immunohistochimie pour détecter sa présence et localiser précisément les cellules en division.
• En comparant la structure chimique de la thymidine naturelle et du BrdU, on remarque que la seule différence est le remplacement d’un groupe méthyle par un atome de brome, ce qui rend le BrdU détectable sans perturber significativement la réplication de l’ADN.

Question 11

Quelles sont les étapes principales pour détecter la prolifération cellulaire en utilisant le BrdU?

Answer 11

1. Incorporation du BrdU : Le BrdU est incorporé dans l’ADN en cours de réplication à la place de la thymidine naturelle.
2. Fixation et dénaturation : Après l’incorporation, les cellules ou tissus sont fixés pour préserver leur structure. L’ADN est ensuite dénaturé (par exemple, avec de la chaleur ou des agents chimiques) pour exposer le BrdU incorporé.
3. Liaison des anticorps : Un anticorps spécifique dirigé contre le BrdU est appliqué. Si on utilise un anticorps primaire non conjugué, un anticorps secondaire marqué (par un fluorophore ou une enzyme) est ensuite ajouté.
4. Détection colorimétrique ou fluorescence : Le signal est visualisé soit par fluorescence (comme montré ici en vert avec l’anti-BrdU) soit par une réaction enzymatique produisant un changement coloré détectable (IHC, Elisa)

Question 12

Comment le BrdU peut-il est administré?

Answer 12

Le BrdU peut être administré de plusieurs façons: par injection (IP, IV, dans les ventricules du cerveau, etc.), administration orale (eau, nourriture).

Question 13

Avec quoi compare-t-on les cellules BrdU positives ?

Answer 13

Les cellules BrdU positives peuvent être comparées avec celles marquées avec un anticorps contre Ki67, un indicateur de prolifération cellulaire.

Question 14

Pourquoi le marquage BrdU est différent?

Answer 14

• Le marquage BrdU identifie les cellules qui étaient en division active à un moment spécifique (Phase S), correspondant à la période d’exposition au BrdU.
• Ki67 est une protéine nucléaire exprimée dans toutes les phases actives du cycle cellulaire (G1, S, G2 et M) mais absente en phase G0 (repos). Le marquage reflète donc toutes les cellules en prolifération active, pas uniquement celles en phase S.

Question 15

Donnez une alternative à l’utilisation de BrdU

Answer 15

Le 3H-thymidine (radioactive tritiated thymidine) peut être utilisé pour marquer le nouvel ADN.

Question 16

Donnez des exemples expliquant que la taille du cerveau des oiseaux varie en fonction des saisons

Answer 16

• Au mois de mars, après un long hiver pendant lequel les oiseaux sont peu actifs et chantent moins, leurs cerveaux étaient plus petits, et il y avait une moindre survie neuronale.
• À la fin de l’été, lorsque les oiseaux sont beaucoup plus actifs et chantent intensément, la taille de leur cerveau augmentait considérablement.

Question 17

En quoi le centre vocal élevé (HVC) est essentielle pour les oiseaux chanteurs?

Answer 17

• L’apprentissage des chansons.
• La modulation de leur structure.
• La plasticité neuronale nécessaire pour produire ces chansons complexes.

Question 18

Quelle a été l’hypothèse de Dr. Nottebohm?

Answer 18

Le changement de taille observé pourrait être dû à une prolifération neuronale chez les oiseaux adultes.

Question 19

Quels ont été les résultats de l’expérience de Dr. Nottenohm dans le HVC?

Answer 19

• Le nombre de neurones marqués par BrdU était significativement plus élevé dans le groupe chanteur par rapport au groupe non chanteur (p < 0,005).
• Cela montre que le chant favorise la prolifération neuronale dans cette région liée à la production et à l’apprentissage des chansons.

Question 20

Quels ont été les résultats de l’expérience de Dr. Nottenohm dans le l’hippocampe (contrôle)?

Answer 20

• Aucune différence significative dans le marquage BrdU n’a été observée entre les deux groupes.
• Cela indique que la prolifération neuronale observée est spécifique au HVC et liée à l’activité de chant.

Question 21

Sur quoi repose la visualisation de l’activité neuronale ?

Answer 21

Sur la mesure des signaux électriques ou chimiques associés à cette activité

Question 22

Quels sont les deux aspects clés souvent explorés lors de la visualisation de l’activité neuronale?

Answer 22

Les changement de voltage et les changements de calcium, qui reflètent des processus critiques dans les neurones

Question 23

Qu’utilisons-nous pour visualiser les changements de voltage?

Answer 23

Marqueurs sensibles au voltage

Question 24

Qu’utilisons-nous pour visualiser les changements de calcium?

Answer 24

Marqueurs ratiométriques
Marqueurs non-ratiométriques
Senseurs de calcium génétiquement encodés

Question 25

Expliquez comment on peut visualiser l’activité neuronale avec l’électrophysiologie et ses limitations

Answer 25

Le patch-clamp est la technique de référence pour la mesure des signaux neuronaux.
Avec cette technique, on peut enregistrer à partir d’un neurone ou d’un petit circuit comprenant peut-être deux ou trois neurones.
Il est presque impossible d’étendre cette méthode à un réseau neuronal plus vaste pour capturer l’activité d’un grand nombre de cellules en temps réel.
En pratique, si nous plaçons une pipette pour enregistrer l’activité d’un neurone, il devient rapidement difficile d’ajouter davantage de pipettes pour couvrir un circuit entier.

Question 26

Quel est le principe des marqueurs sensibles au voltage?

Answer 26

• Utilisation de fluorophores qui changent leur capacité d’absorption ou d’émission de fluorescence en réponse aux variations du potentiel membranaire d’un neurone.
• Ces changements sont associés à l’ouverture et la fermeture des canaux ioniques.
• Cette technique offre une résolution temporelle fine, permettant d’observer les fluctuations rapides du potentiel membranaire, comme les potentiels d’action ou les courants sub-seuil.

Question 27

Quelles sont les application des marqueurs sensibles au voltage?

Answer 27

• Les MSV permettent de cartographier l’activité neuronale à un niveau précis et de comprendre comment les changements de voltage sont associés à des processus comme l’ouverture et la fermeture des canaux ioniques.
• Ces outils sont particulièrement utiles pour étudier la dynamique de réseaux neuronaux complexes.

Question 28

Quelle est la variété de marqueurs possibles sensibles au voltage?

Answer 28

Il existe de nombreux marqueurs sensibles au voltage, chacun ayant des propriétés spécifiques, comme:
* La durée du signal: certains sont adaptés à des changements rapides, d’autres à des processus plus lents.
* Le bruit de fond: un signal clair est essentiel pour éviter des interprétations erronées.
* La toxicité : les marqueurs les plus efficaces sont ceux qui ont un impact minimal sur la viabilité des cellules.

Question 29

Quels sont les avantages des MSV?

Answer 29

• Ils offrent une approche non invasive et plus globale que les pipettes électrophysiologiques.
• Bien que similaires aux techniques électrophysiologiques classiques dans leur précision, ils permettent une analyse simultanée de plusieurs neurones, ce qui est crucial pour comprendre les interactions dans des réseaux neuronaux

Question 30

Nommez un marqueur très sensible et fiable pour détecter les fluctuations de voltage.

Answer 30

La mérocyanine

Question 31

Quels sont les trois zones spécifiques pour examiner l’activité du neurone

Answer 31

1. La dendrite distale qui est éloignée du corps cellulaire.
2. La dendrite basale, plus proche du soma.
3. L’axone

Question 32

Quelles sont les limitations des marqueurs sensibles au voltage?

Answer 32

• Bruit de fond élevé (faible rapport signal/bruit)
• Absence de spécificité pour les différents types de neurones
• Difficulté pour les expériences d’imagerie a long-terme (plusieurs jours ou semaines)– faible durée d’action.

Ces problèmes ont incité la création de marqueurs codifiés de façon génétique

Question 33

En quoi le calcium est essentiel dans les neurones?

Answer 33

• Il agit comme messager intracellulaire dans la libération de neurotransmetteurs.
• Il participe à l’activation des voies de signalisation intracellulaire.
• Son rôle est central dans la régulation de la santé et de la survie des neurones, notamment dans des conditions pathologiques.

Question 34

Donnez des exemples d’indicateurs à calcium fluorescents

Answer 34

• Marqueurs organiques dont la fluorescence augmente en se liant au calcium (ex. Fura-2, Fluo-4)
• GCaMP (senseurs génétiquement encodés)

Question 35

Que permet la technique d’imagerie calcique avec marqueurs de la famille Fluo?

Answer 35

Permet de mesurer les changements d’intensité de la fluorescence au cours du temps (F) par rapport au niveau basal (F0)

Question 36

Quel est la différence entre les indicateurs de calcium et les marqueurs de voltage?

Answer 36

Les indicateurs de calcium produisent des signaux plus larges et robustes que les marqueurs de voltage mais avec une résolution temporelle plus basse (millisecondes en lieu de microsecondes).

Question 37

Quelles sont les 2 catégories principales d’indicateurs de calcium? Donnez des exemples

Answer 37

1- Marqueurs ratiométriques (Exemple : Fura-2, Indo-1)
2- Marqueurs non-ratiométriques (Exemples : Fluo-4, GCaMP6)

Question 38

Que sont les marqueurs ratiométriques?

Answer 38

Ces marqueurs permettent une mesure quantitative et précise des changements de calcium intracellulaire grâce à un ratio entre deux longueurs d’onde. Cela les rend indépendants des variations de l’intensité lumineuse ou des conditions expérimentales.

Question 39

Que sont les marqueurs non-ratiométriques?

Answer 39

Ces marqueurs, plus simples à utiliser, détectent les variations de calcium par des changements d’intensité de fluorescence. Ils sont particulièrement adaptés pour des expériences où une grande sensibilité est nécessaire, mais ils peuvent être influencés par les conditions de l’échantillon.

Question 40

Comment fait-on l’imagerie calcique avec les marqueurs ratiométriques?

Answer 40

• Les méthodes ratiométriques sont basés sur l’utilisation d’un rapport (ratio) entre deux intensités de fluorescence.
• Les indicateurs ratiométriques montrent un changement dans leurs spectres d’émission lorsqu’ils se lient au calcium, ils peuvent donc être classés en tant qu’indicateurs à double émission ou à double excitation.
• La mesure du calcium est réalisée en utilisant deux lasers à excitation (pour les indicateurs à double excitation) ou deux plages de détection (pour les indicateurs à double émission)

Question 41

Que montre l’Indo-1?

Answer 41

Indo-1 émet deux pics de fluorescence distincts: un lorsqu’il est libre, et un autre lorsqu’il est lié au calcium.

Question 42

Comment fait-on l’imagerie calcique avec le marqueur ratiométrique fura-2?

Answer 42

• Fura-2 émet toujours à 510 nm mais peut changer la longueur d’onde à laquelle il est excité de 340 nm à 380 nm en réponse à la liaison du calcium.
• Ainsi, le suivi du rapport de l’intensité de fluorescence émise par Fura-2 à 340 nm à la fluorescence émise à 380 nm révèle des changements de concentration en calcium.
• Pour mesurer la dynamique calcique, les images sont obtenues après avoir rempli les cellules de Fura-2 (A-C). Ce ratio peut être converti en concentration du niveau de calcium libre (D).
• À 0 µM de calcium, l’intensité relative est faible, mais elle augmente graduellement jusqu’à 40 µM.

Question 43

Quels sont les avantages des marqueurs ratiométriques?

Answer 43

• Résistance aux variations instrumentales: Ces marqueurs ne sont pas affectés par le photoblanchiment ou les fluctuations de l’intensité d’excitation. En effet, même si la fluorescence absolue diminue, le ratio entre les deux longueurs d’onde reste constant, garantissant des mesures précises.
• Stabilité: Les variations de l’optique du microscope ou des conditions d’éclairage n’altèrent pas la mesure.

Question 44

Quels sont les limitations des marqueurs ratiométriques?

Answer 44

• Complexité des mesures: La nécessité d’utiliser plusieurs longueurs d’onde rend les acquisitions plus complexes.
• Compatibilité des équipements: Tous les microscopes ne permettent pas de travailler avec ces longueurs d’onde multiples. Il faut du matériel spécialisé pour détecter simultanément les signaux d’excitation ou d’émission.
• Spécificité: Pas possible de cibler des populations spécifiques de neurones.

Question 45

Comment fait-on l’imagerie calcique avec les marqueurs non ratiométriques?

Answer 45

Les marqueurs non ratiométriques, contrairement aux ratiométriques, établissent une relation directe entre la concentration intracellulaire de calcium et l’intensité de fluorescence émise.
Cela signifie qu’avec Fluo-4, par exemple, il n’est pas nécessaire de calculer un ratio, car le signal est proportionnel à la concentration de calcium.
Par exemple, sur le graphique à droite, on peut voir l’évolution de l’intensité de fluorescence émise par Fluo-4 à 525 nm en fonction de l’augmentation de la concentration de calcium libre.
Ce marqueur présente une forte réponse, et son pic de fluorescence augmente avec la concentration calcique, ce qui permet une mesure directe.

Question 46

Quels sont les avantages des marqueurs non-ratiométriques?

Answer 46

• Les marqueurs non ratiométriques sont simple d’utilisation et facilitent la quantification. Cela le rend très populaire pour des expériences rapides ou des mesures qualitatives du calcium intracellulaire.

Question 47

Quels sont les limitations des marqueurs non-ratiométriques?

Answer 47

• Spécificité: Pas possible de cibler des populations spécifiques de neurones.
• Potentiel perturbation de l’homéostasie calcique: le marqueur agit comme un tampon, c’est-à-dire qu’il se lie au calcium intracellulaire. Cela peut modifier la dynamique naturelle du calcium et potentiellement affecter les processus biologiques.

Question 48

Que sont les senseurs de calcium génétiquement encodés?

Answer 48

GCaMP ou Pericam sont des marqueurs qui mesurent directement les changements d’intensité de fluorescence causés par un changement de conformation sensible au calcium.
C’est une technique qui est très sensible au niveau spatial et temporel.

Lorsque le calcium se lie à la calmoduline, cela modifie la conformation de la protéine, augmentant l’intensité de fluorescence.

Question 49

Quelle est la structure du GCaMP?

Answer 49

Il est consituté de trois éléments principaux :

• GFP (Green Fluorescent Protein) pour la fluorescence.
• Calmoduline (CaM), qui lie le calcium avec grande affinité.
• M13, une séquence peptidique issue de la myosin light chain kinase, permettant le changement de conformation.

Question 50

Comment le GCamP6 a-t-il évolué?

Answer 50

• Les premières souris transgéniques exprimant le GCaMP ont été générées en 2004.
• Depuis, les versions ont été améliorées pour une meilleure sensibilité et résolution temporelle (de GCaMP3 à GCaMP8).
• GCaMP6 et GCaMP8 sont les versions les plus utilisées en neurosciences pour leur capacité à capturer des signaux rapides et précis.
• Les GCaMP utilisent exclusivement des variantes de la GFP comme fluorophore.

Question 51

Nommez d’autres senseurs de calcium génétiquement encodés qui utilisent différents fluorophores que GCaMP

Answer 51

• RCaMP utilise une protéine fluorescente rouge (comme RFP, mRuby ou mApple).
• YC3.60 (Yellow Cameleon) qui combine CFP (Cyan Fluorescent Protein) et YFP (Yellow Fluorescent Protein).

Question 52

Quels sont les deux microscopie utilisées pour faire l’imagerie calcique avec les senseurs de calcium génétiquement encodés?

Answer 52

Microscopie à deux photons
Microscope miniature

Question 53

Que permet la microscopie à deux photons dans l’imagerie calcique?

Answer 53

• Permet d’imager l’activité neuronale en temps réel chez des souris vivantes.
• Neurones présynaptiques marqués par GCaMP (fluorescence verte) et neurones postsynaptiques par RCaMP (fluorescence rouge).
• Avantage: Analyse simultanée des interactions présynaptiques et postsynaptiques dans le même tissu.

Question 54

Que permet le microscope miniature portable dans l’imagerie calcique?

Answer 54

• Utilisé pour les souris libres de leurs mouvements.
• Capture de l’activité calcique avec des objectifs légers implantés sur la tête de l’animal.
• Avantage: Visualisation des changements d’activité neuronale pendant le comportement.

Question 55

Quels sont les avantages des senseurs de calcium génétiquement encodés?

Answer 55

• Spécificité de ciblage : Expression ciblée grâce à des promoteurs spécifiques à certains types de cellules ou régions cérébrales.
• Haute sensibilité : Détection précise des variations de calcium intracellulaire.
• Facilité d’analyse : Simplicité d’utilisation pour visualiser l’activité neuronale en temps réel.

Question 56

Quels sont les limitations des senseurs de calcium génétiquement encodés?

Answer 56

• Longs signaux décroissants : Certaines versions des senseurs retournent lentement à l’état basal, réduisant la résolution temporelle. Les versions rapides (GCaMP6 Fast) améliorent ce point.
• Tamponnage de calcium : Une surexpression du senseur peut interférer avec les voies de signalisation calcique normales, bien que cet effet soit généralement négligeable dans des conditions contrôlées.

Question 57

Quelles sont les deux principales méthodes de manipulation optique de l’activité neuronale?

Answer 57

• Stimulation par libération de molécules (« uncaging »): Technique où des molécules actives, liées à des cages photosensibles, sont libérées par exposition à la lumière, stimulant ainsi les neurones.
• Canaux activés par la lumière: Intégration de protéines activées par des impulsions lumineuses pour contrôler l’activité des neurones.

Question 58

Quels sont les avantages de la manipulation optique de l’activité neuronale?

Answer 58

• Ciblage précis de sous-types de neurones grâce à des promoteurs spécifiques.
• Activation d’une large population neuronale, selon les besoins expérimentaux.
• Réduction des effets non spécifiques, souvent observés avec des méthodes électriques classiques, pour une manipulation plus contrôlée.

Question 59

Expliquez la stimulation par la libération des molécules (‘‘uncaging’’)

Answer 59

Une variété de composés peuvent être encagés en ajoutant un groupe chimique pouvant être libéré par la lumière. Le composé encagé ne possède pas les propriétés actives du composé seul.

-Les molécules “encagées” :
Un groupe chimique protecteur (“cage”) peut être ajouté à une molécule d’intérêt pour bloquer son activité jusqu’à ce qu’une source de lumière d’une certaine longueur d’onde soit appliquée pour séparer la partie “encageante” (« caged ») et libérer les molécules actives.

Le modulateur :
Il s’agit de la molécule active (en bleu), capable de se lier au récepteur et de déclencher une réponse biologique. Initialement, ce modulateur est inactif car il est lié à une cage chimique.

La cage chimique :
Représentée ici en vert, la cage bloque temporairement l’activité du modulateur. Cette liaison rend le modulateur incapable d’interagir avec le récepteur.

• Une source lumineuse, comme un laser ou une lumière UV, est dirigée précisément vers la région d’intérêt.
• La lumière est choisie avec une longueur d’onde spécifique, adaptée à la cage chimique utilisée. Cette longueur d’onde est calibrée pour provoquer une rupture de la liaison chimique entre le modulateur et la cage chimique.
• Ce processus est rapide et localisé, empêchant des effets dans des zones non éclairées ou des molécules voisines.

Le modulateur se lie au récepteur cible, entraînant une réponse spécifique, comme un signal électrique ou chimique dans le neurone.
Cette réponse peut être mesurée et analysée, fournissant des informations précieuses sur le fonctionnement du réseau neuronal.

Question 60

Quels sont les avantages de la stimulation par la libération des molécules (‘‘uncaging’’)

Answer 60

-Précision temporelle : Le moment exact de l’activation est contrôlé par la lumière.
-Précision spatiale : Seule la région illuminée est activée, évitant des réponses dans d’autres zones.
-Flexibilité expérimentale : Permet d’ajouter un composant encagé à l’avance, puis de l’activer lorsque le système de mesure est prêt, garantissant des données fiables.

Question 61

Expliquez l’uncaging de neurotransmetteurs avec l’exemple du glutamate

Answer 61

Photo-libération hautement localisée de glutamate

• Le glutamate est le neurotransmetteur excitateur le plus abondant dans le cerveau.
• Il agit en se liant à divers récepteurs, notamment les récepteurs AMPA et NMDA, présents sur les neurones postsynaptiques.
• Problème : Si le glutamate est appliqué directement, il active une grande population de neurones de manière diffuse, rendant difficile l’étude des réponses spécifiques.

On pourrait utiliser du glutamate lié à un groupe chimique protecteur, appelé MNI (4-methoxy-7 nitroindolinyl), afin d’utiliser la technique de uncaging.
Ce lien rend le glutamate inactif : il ne peut pas se lier à ses récepteurs ou exciter les neurones.
Une fois le MNI libéré, le glutamate peut se lier aux récepteurs.

On peut comparer ce processus à un oiseau (le glutamate) qui est enfermé dans une cage (MNI).
La lumière agit comme une clé : elle ouvre la cage, permettant à l’oiseau de s’échapper et de voler, symbolisant l’activation du glutamate.

Question 62

Expliquez l’uncaging de neurotransmetteurs par stimulation à 2-photons d’épines individuelles et donnez les résultats de l’expérience

Answer 62

• Le faisceau de lumière est focalisé sur une épine dendritique unique, permettant une stimulation extrêmement localisée.
• Cette technique garantit que seul un petit groupe de récepteurs est activé, réduisant les interférences avec d’autres neurones ou épines.
• En bas à gauche, l’image montre un neurone pyramidal avec ses dendrites, les épines dendritiques étant marquées et visualisées individuellement.
• Les chercheurs ont stimulé le glutamate sur des épines spécifiques pour observer des réponses locales.
• Le graphique montre la comparaison entre les signaux électriques mesurés au niveau de la dendrite et du soma.
• Après stimulation, les chercheurs ont observé des potentiels membranaires et des signaux calciques dendritiques, confirmant l’activation locale.

Question 63

Expliquez ce qu’est l’optogénétique pour la manipulation optique de l’activité neuronale

Answer 63

L’optogénétique est une technique révolutionnaire en neurosciences, développée ces dernières années, permettant de manipuler l’activité neuronale avec une précision spatio-temporelle remarquable.
Cette méthode repose sur l’utilisation de protéines sensibles à la lumière, appelées opsines, présentes naturellement dans certains organismes comme les algues ou les archées.

Question 64

Quelles opsines pouvons-nous utiliser en optogénétique?

Answer 64

Channelrhodopsine-2 (ChR2)
Halorhodopsine (NpHR)

Question 65

Qu’est-ce qu’est la Channelrhodopsine-2 (ChR2)?

Answer 65

• Une opsine qui permet l’entrée de cations (Na+, Ca2+) dans le neurone lorsqu’elle est exposée à une lumière bleue (∼470 nm).
• Résultat : dépolarisation de la membrane neuronale, entraînant l’activation du neurone (potentiel d’action).

Question 66

Qu’est-ce qu’est la Halorhodopsine (NpHR) ?

Answer 66

• Une opsine activée par une lumière jaune (∼590 nm) qui permet l’entrée d’ions chlorure (Cl⁻) dans le neurone.
• Résultat : hyperpolarisation de la membrane, inhibant l’activité neuronale.

Question 67

Qu’est-ce que l’optogénétique par activation in vivo de ChR2 et/ou NpHR?

Answer 67

Cette technique repose sur l’expression d’opsines spécifiques, comme Channelrhodopsin-2 (ChR2) et Halorhodopsin (NpHR), dans un sous-groupe précis de neurones grâce à l’utilisation de virus ou de souris transgéniques.
Ces opsines permettent soit d’activer soit d’inhiber l’activité neuronale lorsque ces protéines sont stimulées par une lumière d’une certaine longueur d’onde.
Ces deux techniques permettent de manipuler simultanément différents groupes de neurones dans le même animal:
* Activer un circuit neuronal avec ChR2.
* Inhiber un autre circuit avec NpHR.
Cette approche offre une résolution spatio-temporelle précise pour l’étude des interactions entre circuits neuronaux.

Question 68

Que sont les réponses orthodromiques?

Answer 68

La propagation d’un signal ou dans la direction physiologique normale du neurone, de l’axone initial vers les terminaisons synaptiques

Question 69

Quelles sont les étapes d’optogénétique pour étudier les réponses orthodromiques?

Answer 69

• Injection de ChR2-eYFP dans le soma des neurones.
• Stimulation à l’aide de fibres optiques (473 nm) au niveau des somas transfectés.
• Mesure des potentiels électriques générés dans les somas en réponse à une photostimulation orthodromique.

Question 70

Que sont les réponses antidromique?

Answer 70

La propagation d’un signal ou d’un potentiel d’action dans la direction inverse à la normale, des terminaisons synaptiques vers le soma

Question 71

Quelles sont les étapes optogénétique pour étudier les réponses antidromiques?

Answer 71

• Injection dans une région cible des projections axonales.
• Stimulation des terminaisons synaptiques.
• Mesure des signaux électriques qui remontent de manière antidromique jusqu’aux somas.

Question 72

Pour quelles maladies l’optogénétique pourrait servir de potentielles thérapies?

Answer 72

Maladie de Parkinson
Dépression
Trouble obsessionnel-compulsif (TOC)
Douleur chronique
Épilepsie

Question 73

Comment l’optogénétique pourrait aider la maladie de Parkinson?

Answer 73

L’optogénétique pourrait remplacer la stimulation cérébrale profonde (DBS) en ciblant spécifiquement les neurones glutamatergiques excitateurs dans le noyau sous thalamique (STN) avec des opsines comme la NpHR, permettant une inhibition précise avec moins d’effets secondaires.

Question 74

Comment l’optogénétique pourrait aider la dépression?

Answer 74

L’introduction de NpHR dans la région Cg25 (gyrus cingulaire subgénual) pourrait réduire l’activité neuronale associée à la dépression. Alternativement, la ChR2 pourrait être utilisée dans le noyau accumbens pour moduler l’excitation et soulager les symptômes.

Question 75

Comment l’optogénétique pourrait aider le trouble obsessionnel-compulsif (TOC)?

Answer 75

Des approches optogénétiques utilisant NpHR pourraient inhiber des régions spécifiques comme la capsule antérieure ou d’autres zones (e.g., BA32), où une activité métabolique excessive est liée au TOC sévère.

Question 76

Comment l’optogénétique pourrait aider la douleur chronique

Answer 76

L’optogénétique pourrait inhiber les fibres nerveuses responsables de la douleur via NpHR ou activer des neurones analgésiques avec ChR2, offrant un soulagement efficace tout en limitant la tolérance et la dépendance liées aux traitements pharmacologiques.

Question 77

Comment l’optogénétique pourrait aider l’épilepsie ?

Answer 77

L’activation de NpHR pourrait supprimer les activités neuronales anormales à l’origine des crises épileptiques. L’activation de ChR2 dans des interneurones GABAergiques pourrait également inhiber l’activité excessive et prévenir la propagation des crises.