Translationell och posttranslationell genreglering

Question 1

Vad kallas ett oveckat protein+

Answer 1

Denaturerat. Dessa kan aggregera på grund av de exponerade hydrofoba sidokedjorna

Question 2

Hur är ribosomen uppbyggd?

Answer 2

• Byggs upp av ca 80 protein och 4 rRNA

* Den har tre sites: aminoacyl (där en ny tRNA kommer in), peptidyl (där peptidbindning bildas) och exit.

Question 3

Hur fungerar rRNA?

Answer 3

• rRNA-gener finns i många kopior och står för 90% av allt RNA
• Efter att rRNA har bildats i nukleolen genomgår det omfattande modifieringa
• rRNA har en katalytisk aktivitet (ribozyme)
• Det ger ribosomen sin struktur

Question 4

Hur sätts ribosomen ihop?

Answer 4

Subenheterna byggs upp i kärnan vilket innebär att de proteiner som de innehåller måste importeras. När de är färdiga exporteras de och subenheterna sätts ihop i cytoplasman. De innehåller flera kemiska modifieringar, troligtvis för att kunna anta rätt struktur

Question 5

Hur fungerar tRNA?

Answer 5

• Som adaptorer mellan mRNA och ribosomen
• Syntetiseras av RNApol III
• Har en treklöverstruktur genom självkomplementaritet
• Har ett antikodon som basparar med mRNA
• Bär med sig en aminosyra i 3’-änden CCA
• Det innehåller flera kovalenta modifieringar
• Den 3e positionen i antikodonet är en “wobble position”. Då tRNA basparar mot mRNA kan tRNA ibland binda utan perfekt komplementaritet och det kan räcka med att bara den första och andra basen matchar

Question 6

Hur laddas tRNA med aminosyror?

Answer 6

Varje aminosyra använder ett eget aminoacyl-tRNA-syntetas.

1. Aminosyra och ATP binder till enzymet
2. Enzymet katalyserar ihopkopplingen av aminosyra och AMP. 2 fosfatmolekyler klyvs bort
3. Oladdat tRNA binder till enzymet
4. Enzymet överför aminosyran från aminoacyl.AMP till aminoacyl-tRNA
5. aa-tRNA och AMP släpper från enzymet som går tillbaka till sin ursprungliga konformation. Energin som lagras i bindningen mellan tRNA och aminosyra används senare för att skapa peptidbindningar mellan aminosyrorna i det växande proteinet.

Hela processen har en väldigt hög specificitet (fel 1/40,000 tRNA)

Question 7

Varför är ett ringslutet mRNA viktigt för translationen från fria ribosomer?

Answer 7

Ringslutningen sker tillföljd av interaktion mellan 3’-bindande proteinet PAB1 och 5’-bindande proteinet eIF4E via eIF4G. Ribosomen känner då av 5’-capen och vandrar sedan mot polyA. Efter att en ribosom har gått 80 nukleotider kan en ny binda in. Då en ribosom sen har gått till polyA - ett “varv” på mRNA - kan den släppa och lätt gå tillbaka till starten och translatera ett nytt protein då ändarna ligger så nära varandra.

Question 8

Vad är mRNP?

Answer 8

mRNA med bundna proteiner

Question 9

Hur kan translation regleras genom signaler om degradering av mRNP?

Answer 9

Genom deadenylering och repression av mRNP kommer ringslutningen att förstöras vilket gör det svårare för ribosomern att binda in och leder till mindre effektiv translation

Question 10

Vilket är startkodonet och vad kodar det för?

Answer 10

AUG vilket kodar för metionin. Denna klyvs ofta bort efter proteinbildningen

Question 11

Vilken betydelse kommer wobble position ha i translationen?

Answer 11

Samma tRNA kan användas för att läsa av mer än ett kodon i mRNA:t

Question 12

Vilka tre delar kan proteinbildningen delas upp i och vad sker i dessa?

Answer 12

Initiering:
• Interaktion mellan mRNAts polyA-svans och 5’-cap leder till ringslutning
• Ribosomens lilla subenhet binder initierings-tRNA (Met)
• Uträtning av mRNA, identifiering av AUG och rekrytering av stora subenheten

Elongering:
• Inbindning av tRNA baserat på komplementaritet
• Peptidyltransferasreaktioner katalyserat av RNA

Terminering:
• Release factors binder stop-kodon i A-site
• Katalyserar tillsatsen av H2O istället för en aminosyra –> fri C-terminal
•Polypeptidkedja släpper från tRNA och ribosom
• mRNA släpper från ribosomen vilken delas i stora och lilla subenheten

Question 13

Hur sker translationsinitieringen?

Answer 13

1. Två makromolekylära komplex bildas i cytosolen:
   •eIF4F-komplexet (eIF4A, eIF4E, eIF4G)
   • 43S preinitieringskomplexet (40S-subenheten, eIF2-GTP-initiator-tRNA(Met), eIF3, eIF1 och eIF5). Initiator sitter bundet i P-site på 40S
2. eIF4E bindet 5’-cap på mRNA och för med sig övriga eIF4F-komponenter
3. eIF4B binder till eIF4A och mRNAt
4. eIF4G och eIF3 interagerar vilket leder till att hela 43S-ribosomen binder in till mRNAt
5. Preinitieringskomplexet med lilla subenheten av ribosomen rör sig mot 3’. Det finns dock vissa sekundärstrukturer på mRNA som gör att ribosomen inte kan röra sig framåt
6. eIF4A har helikasaktivitet och löser upp sekundärstrukturer mha eIF4B och ATP-hydrolys
7. eIF3 binder till både mRNA och 40S och ser till att ribosomen “följer efter” eIF4A/B allteftersom mRNA rätas ut
8. Ribosomen stannar upp när den stöter på startkodon till vilket initiator-tRNA basparar
9. Cap-bindande protein (eIF4E, eIF4G, eIF4A och eIF4B) släpper från preinitieringskomplexet. Dessa kan nu rekrytera ett nytt komplex och starta en nya runda av translation
10. eIF5 hydrolyserar GTP till GDP i eIF2
11. eIF1, eIF3 och eIF2-GDP dissocierar
12. Initiator-tRNA sitter bundet till AUG på mRNA och till 40S-subenheten
13. eIF5B-GTP binder in till lilla subenheten och rekryterar sedan 60S-subenheten
14. eIF5B-GTP hydrolyseras till eIF5B-GDP, vilket leder till dess dissociering och till en konformationsförändring som tillåter 40S och 60S att anta rätt positioner
15. Ribosomen rör sig 5’ till 3’
16. eIF2 laddas med GTP mha eIF2B och kan då laddas med ett nytt initiator-tRNA.

Question 14

Vilken är konsensussekvensen för translationsstart?

Answer 14

ACCAUG

Question 15

Vilka kontrollmekanismer finns för att hindra att lilla subenheten binder in (steg 4 i initiering)?

Answer 15

• Trasigt mRNA kan inte användas för translation då både 5’-cap och 3’-polyA behövs
• Non-sense-mediated mRNA decay förhindrar att felaktigt splicat mRNA translateras

Question 16

Hur styr eIF2-fosforylering translationen?

Answer 16

eIF2 kommer att fosforyleras då cellen inte vill ha translation.

• eIF2B är en GEF
• Det finns alltid mer eIF2 än eIF2B
• eIF2B krävs för nukleotidutbyte i eIF2 och därmed för translationsinitiering
• Fosforylerat eIF2 binder starkt till eIF2B och förhindrar nukleotidutbyte och därmed translationsstart.

Question 17

Hur sker translationselongeringen?

Answer 17

1. 80S-ribosomen sitter bundet till mRNAt med initiator-tRNA bundet till startkodonet i P-site
2. EF1-GTP-tRNA finns tillgängliga i cytosolen och kan nå ribosomen. Elongation factors är G-protein som tar med tRNA+aminosyra
3. EF1-GTP-tRNA(aa) binder till 80S i A-site. Detta sker i en slumpmässig process till rätt tRNA har hittats med tillräckligt bra komplementaritet.
4. EF1-GTP hydrolyseras till EF1-GDP, vilken släpper från ribosomen. Energin som frigörs leder till en konformationsförändring i ribosomen viken för de två aminosyrorna nära varandra vilket leder till att en peptidbindning skapas mellan de två aminosyrorna i A-site samt till att den stora subenheten rör sig ett kodon i 3’-riktning.
5. Hydrolys av EF2-GTP till EF2-GDP leder till en konformationsförändring i lilla subenheten och till att initiator-tRNA släpper från E-site. EF2-GDP släpper ribosomen.
6. Ribosomen har nu den växande polypeptidkedjan i P-site och kan binda in nästa EF1-GTP-tRNA(aa) i A-site

Question 18

Vad sker om EF1-GT-tRNA inte är korrekt basparad till mRNA?

Answer 18

• EF1-GTP hydrolyseras inte till EF1-GDP, vilket förhindrar dissociation och därmed peptidylreaktionen
• Är bindningen mellan tRNA och mRNA för svag stannar inte tRNA länge nog för att peptidylreaktionen ska slutföras

Question 19

Hur snabbt går elongering av en aminosyra?

Answer 19

En halv sekund

Question 20

Hur sker translationsterminering?

Answer 20

1. Ribosomen når ett stopp-kodon. Den växande polypeptidkedjan befinner sig i P-site.
2. eRF-GTP och eRF3 finns tillgängliga i cytosolen (komplex)
3. eRF3 binder in till stopp-kodonet
4. GTP-hydrolys av eRF1-GTP frigör energi som används till att skapa en konformationsförändring i 60S som medför hydrolys av bindningen mellan tRNA(aa) och polypeptidkedjan och frigör den från ribosomen
5. Ribosomen faller av mRNA och de två subenheterna dissocierar
6. Om mRNA är ringslutet kan ribosomen åter lätt binda till 5’-cappen och initiera ytterligare translation.

Question 21

Hur fungerar många antibiotikum?

Answer 21

Genom att på olika sätt hämma bakteriell translation

Question 22

Vilka posttranslationella proteinmodifieringar finns det och vilka är några exempel på de olika klasserna?

Answer 22

• Påkoppling av funktionell grupp: fosforylering, lipidering, acetylering och glykosylering
• Påkoppling av proteiner: ubiquitinylering
• Kemisk modifiering: prolinhydroxylering
• Strukturell modifiering: proteolys och disulfidbryggor

Question 23

Vad gäller för fosforylering?

Answer 23

• Kovalent modifiering
• Reversibel
• Påverkar protein på tre sätt: konformationsförändring, skapande av bindningsyta (SH2-domän) eller maskering av bindningsyta
• Cirka 1/3 av våra proteiner är fosforylerade på minst en aminosyra

Question 24

Vad gäller för lipidering av proteiner?

Answer 24

• Lipidering katalyseras av lipidtransferaser
• Möjliggör semi-permanent integrering av proteiner i cellulära membran
• Viktigt för korrekt lokalisering av protein
• Farnesylering av Cystein i C-terminala CaaX-box element vanligast
• Ofta polybasisk region N-terminalt om lipidmodifieringen

Exempel:
•Farnesylering av Ras som skapar ett plasmamembranlokaliserat Ras som då kommer i kontakt med dess cellytereceptorer
•Farnesyltransferashämmare för cancerbehandling

Question 25

Vad gäller för acetylering?

Answer 25

*  Liknar fosforylering * Acetylering av histoner leder till öppet kromatin och aktiv transkription *  Acetylering av tubulin leder till med stabila mikrotubuli, exempelvis vid celldelning

Question 26

Vad är en klinisk tillämpning av acetylering?

Answer 26

HDAC-hämmare kan användas vid cancer då det premierar öppet kromatin vilket underlättar eget försvar genom uttryck av tumörsuppressorer

Question 27

Vad gäller för prolinhydroxylering av proteiner?

Answer 27

* Kovalent modifiering av aminosyran prolin *  Kan möjliggöra nya interaktioner och stabilisera proteinstrukturer (trippelhelix i kollagen) *  Kräver askorbinsyra (Vitamin C) och brist på denna leder till minskad stabilitet hos kollagenet och bidrar till uppkomst av skörbjugg

Question 28

Hur sker ubiquitinylering?

Answer 28

1. Aktivering. Biquitinmolekyl konjugerar till activating enzyme (E1) genom en thioesterbindning. Ubiquitinet lämnas sedan över till E2. 2. Substratigenkänning. Målproteinet binder till E3 3. Ubiquitinylering. E3 flyttar över ubiquitinet till målproteinet

Question 29

Vad gäller för proteolys?

Answer 29

* Ett protein klyvs efter det har syntetiserats *  Kan leda både till aktivering och inaktivering av proteinet *  Ett sätt att kontrollera proteinets livslängd (bara tillgängligt så länge det syntetiseras) Ett exempel är ACE (angiotensine converting enzyme) som klyver angiotensin I till angiotensin II vilket leder till ökad vasokonstriktion och ökat blodtryck. Det klyver också bradykinin vilket leder till minskad vasodilatation och därigenom ökat blodtryck.

Question 30

Vilka faktorer finns det som spelar in för hur translationell genreglering sker?

Answer 30

* Proteinsyntes kan ske i cytoplasman eller på ER *  mRNA är specifikt distribuerat i cytoplasman * Leaky translation - ribosomen kan hoppa överett startkodon och välja ett som ligger längre ner vilket ger ett annat protein. * mRNA-bindande protein kan stimulera eller hämma translation * Fosforylering av translationsinitieringsfaktorer * IRES (internal ribosome entry site) * mRNA-stabilitet * Proteinstabilitet

Question 31

På vilka sätt kan mRNA-stabilitet påverkas för translationell kontroll?

Answer 31

* Inhibering av ringslutning (ex oocyten vid befruktning) * Deadenylering och un-capping (långsam) *  Endonukleas och mRNA-nedbrytning (snabb)

Question 32

Vad är det som händer i oocyten vid befruktning?

Answer 32

Ett obefruktat ägg har ingen translation då poly-A-polymeras PAP är hämmat av det dominerade Poly-A-deadenylas PARN. Vid befruktning frisätts progesteron som aktiverar auroraA-kinas. Detta fosforylerar CPEB vilket gör att maskin släpper så att 5' blir fritt och även gör så att PAP istället dominerar och polyadenylerar 3'-änden. Då kan en aktiv ringslutning bildas och translation genomföras

Question 33

Vad är några exempel på translationell kontroll och värd-patogeninteraktioner?

Answer 33

* Cellens försvar mot virus *  Virusmekanism för att undkomma värdcellens försvar *  Avstängning av translation mha viralt proteas

Question 34

Vilken är cellens försvarsmekanism mot virus och hur har virus bekämpat detta?

Answer 34

1. Virusinfektion sker och dsRNA kommer in i cellen 2. IFN-gamma kommer att stiga i kroppen och signalera om transkription av PKR - RNA-beroende proteinkinas med RNA-bindande yta 3. PKR hittar dsRNA, binder in det och kinaset aktiveras 4. Det kommer att fosforylera eIF2 som då binder upp sin GEF. Det innebär att alla eIF2B binds upp och kan inte utföra sin aktivitet vid translationsinitiering 5. Virala protein hindras att uttryckas Detta kan kringgås på två sätt: 1. Viruset kan ha ett pseudosubstrat för PKR som gör att PKR slösar med energi för att fosforylera detta istället för eIF2 2. Viruset kan också ha ett decoy-dsRNA som binder upp PKR men aktiverar det inte.

Question 35

Hur fungerar virala proteaser och IRES?

Answer 35

Virala proteaser, exempelvis från polio, kan klyva eIF4G vilket gör att ringslutningen av mRNA förstörs och det blir en dålig translation av mRNA från den egna cellen. Däremot är det virala mRNAt utrustat med IRES som är en sekundärstruktur som kan fungera ungefär som proteiner gör för att skapa ringslutningen. På det sättet kan viruset göra att de kroppsegna proteinerna inte uttrycks utan bara de virala.

Question 36

Vilka ytterligare exempel finns det då translationell kontroll utövas?

Answer 36

*  Värmechock stänger av eIF4E/Cap-beroende proteinsyntes * Tillväxt/celldelning slår på eIF4E-beroende proteinsyntes * Järnhomeostas

Question 37

Vad händer med translation vid värmechock?

Answer 37

1. Proteiner denaturerar 2. Hydrofoba aminosyror exponeras och protein aggregerar i cellen. De kan återveckas men det är svårt så länge temperaturen är hög 3. hsp70 kommer att produceras trots den höga temperaturen i en cap-oberoende reaktion då mRNAt har en sekundärstruktur som möjliggör translation 4. hsp70 kan binda till aggregerade och försöka vecka dem rätt 5. Samtidigt måste cellen stänga ner proteinsyntes av nya protein eftersom majoriteten ändå blir felveckade. Det görs genom att fosfataser verkar på fosforylerade eIF4E vilket gör att ingen 5'-cap bildas och ingen translation sker. Då har hsp70 möjlighet att vecka rätt de protein som redan finns.

Question 38

Hur uppnås translationsökning mha S6K och hur går signaleringen innan dess?

Answer 38

1. Tillväxtfaktorer binder till receptorn 2. PI3K aktiveras och verkar på PIP så PDK1 blir aktivt 3. PDK1 fosforylerar Akt som fosforylerar mTorC1 som fosforylerar p70 S6K, vilken gör stora subenheten i ribosomen 4. S6K fosforyerar S6-protein i 40S-subenheten vilket ger en ökad translation 5. p70 S6K fosforylerar också eIF4B vilket ger en ökad eIF4A-helikasaktivitet som ger en effektivare translation indirekt då det underlättar för ribosomen att läsa av mRNAt

Question 39

Hur sker translationell kontroll för att reglera järnhomeostas?

Answer 39

Järn tas upp från omgivning av transferrinreceptorn. I cellen kan järn antingen befinna sig i fri form eller bundet till transferrin. Om det är bundet kan det inte medverka i reaktioner i cellen. I cellen finns också IRE-BP vilken finns i jämvikt som fri och aktiv och bunden till järn och inaktiv. Då järnnivåerna sjunker i cellen finns mer aktivt IRE-BP tillgängligt och kan binda till två mRNA: • Uppströms om start-kodonet på ferritin-mRNA vilket förhindrar 5'-cap-bildning och därigenom minskar ferritinproduktionen. Mindre järn finns uppbundet och "låst" i cellen • Nedströms om start för transferrinreceptor-mRNA och stabiliserar molekylen genom att skydda mot endonukleaser. Det ger en ökad TfR-produktion så att mer järn kommer in i cellen. Båda effekterna av IRE-BP leder till mer fritt järn som kan binda upp IRE-BP och IRE-BP-processen stängs av.