Metoder för DNA-, RNA- och proteinanalys Flashcards
Hur gör man för att undersöka mRNA?
Man gör om det till komplementärt DNA - cDNA. Först extraheras RNA från vävnaden för att kunna arbeta med det.
- mRNA hybridiseras med poly-T primer till poly A-svansen
- En komplementär DNA-kopia göra med reverstranskriptas som är framrenat från virus.
- RNA-strängen degraderas med RNas H.
- En andra cDNA-sträng syntetiseras genom att använda DNA-polymeras. RNA-fragment kommer att fungera som en primer
Hur kan man påvisa en makromolekyl?
•Med hjälp av specifika affinitetsreagens som binder till rätt molekyl:
- För DNA och RNA: komplementära DNA-strängar som basparar
- För proteiner: antikroppar
•Genom att identifiera dem via sekvensen av deras byggstenar:
- För DNA och RNA: DNA-sekvensering läser av nukleotidsekvensen hos ett stort antal molekyler i ett prov
- För proteiner: mass-spektrometri läser av aminosyrasekvensen för undersökta molekyler
Vilka olika typer av affinitetsbaserade molekylära analyser finns i vätskefas?
För detektion/kvantifiering
- PCR för detektion av DNA/mRNA (cDNA)
- qPCR för kvantifiering av DNA/mRNA
- Immun-(antikropps)reaktioner för proteindetektion
Vilka olika typer av affinitetsbaserade in situ-analyser finns?
- Flourescens in situ-hybridisering (FISH) för DNA och RNA
- Immunohistokemi för antikroppsbaserad proteindetektion
Används för att se avbildning/distribution
Vilka är de DNA/RNA-specifika enzymerna som används för olika typer av arbete med DNA/RNA?
•DNA-polymeras • RNA-polymeras (transkriptas) •Revers transkriptas •Ligas •Restriktionsenzym •RNas H etc...
Vilka är de olika typerna av restriktionsenzym och vad är den generella funktionen för enzymklassen?
De klipper av DNA vid specifika DNA-sekvenser - molekylära saxar.
- EcoR I
- Pst I
- Hpa I
Hur går reaktionerna med restriktionsenzymen?
De kommer att känna igen sekvenser på 6 baser vilka är palindromiska sekvenser. Efter att ha delat enzymet kommer något olika processer att ske beroende på vilket restriktionsenzym som har använts:
• EcoR I: vi kommer att få ett klyvningsmönster så att vi har ett överhäng med en enkelsträngad DNA i 5’-ändan - en så kallad 5’-sticky end - som sedan kan ligera samman denna med den andra strängens 5’-sticky end via DNA-ligas i en ATP-beroende sammanfogning
• Pst I: genomgår samma process som med EcoR men får istället en 3’-sticky end.
•Hpa I: klyver strängen rakt av så att vi får som två separerade DNA-molekyler med så kallade blunt ends. Dessa kan sedan ligeras samman eller binda till vilken annan DNA-molekyl som helst som har ett dubbelsträngsbrott.
Hur går agarosgel-elektrofores till?
Framrenat DNA, exempelvis från PCR, tillsätts i brunnar i gelen vilka kopplas till minuspolen i ett elektriskt fält. DNA är negativt laddat på grund av fosfatgrupperna i backbone och kommer därför att vandra genom gelen mot pluspolen. Gelen kommer att bilda som en matris och mindre DNA-fragment kommer att vandra snabbare genom gelen än större vilket kommer ge upphov till att band bildas. Vid sidan om de framtagna proverna inkluderas en stege med DNA-fragment av känd storlek som kan användas för att få en uppskattning om hur stora fragmenten i ett band är. För att synliggöra banden används olika flourescerande färger (ex SYBR green/safe) som binder in till dubbelsträngat DNA och ger en signal då den belyses med UV-ljus.
Vilka är tre vanliga metoder för isolering samt syntetiskt skapande av specifika DNA-sekvenser?
- Cell-baserad kloning (vanligtvis e-coli)
- In vitro-kloning via polymeras-kedjereaktion (PCR)
- Konstruktion av syntetiska DNA-strängar (beställningsvara)
Vanligtvis kombineras dessa metoder.
Hur sker cellbaserad kloning med hjälp av cirkulära plasmider i bakterier?
Plasmiderna kommer att användas som cirkulära dubbelsträngade kloningsvektorer. Först sker plasmidklyvning med hjälp av ett specifikt restriktionsenzym för det aktuella försöket. Det brukar vara bra att ha ett enzym som är specifikt för 5-10 sites så att man kan skapa just det sticky end som man är intresserad av. Sedan ligeras det framtagna DNA-fragmentet samman med den linjäriserade plasmiden via DNA-ligas. Då kommer vi att få en cirkulär rekombinant DNA-plasmid. Denna kommer sedan att introduceras in i en bakterieceller, vanligen E-coli, som i en cellkultur kommer att producera hundratals nya bakterier med den rekombinanta DNA-plasmiden. Därefter kan man rena plasmiderna så att bara DNA-fragmentet är kvar.
Vad finns det för användsningsområden för cellbaserad kloning, exempelvis?
- Undersöka hur en cell påverkas av överuttryck av en viss gen
- Producera större mängder av ett protein för att kunna rena fram det och använda de framrenate proteinerna i biokemiska in vitro-analyser.
Vilka är komponenterna som behövs vid in vitro-amplifiering av specifika DNA-sekvenser via PCR?
- Templat: DNA (alt cDNA) innehållandes den DNA-sekvens man önskar amplifiera.
- Primers: komplementäar oligonukliotider som hjälper DNA-polymeras att initiera DNA-syntes vid önskad plats
- dNTPs: byggstenarna nödvändiga för att kunna syntetisera DNA.
- DNA-polymeras: enzym som utför DNA-syntesen.
- Buffert: skapar optimala förhållanden för DNA-syntes (pH, salt etc)
Hur många nukleotider ska en primer för PCR innehålla?
Cirka 20 nukleotider
Vad gör primern vid PCR?
Det binder in (hybridiserar) till DNA och hjälper DNA-polymeras att initiera DNA-syntes, via den fria OH-gruppen i 3’änden på primern.
Vilka två primers behövs vid PCR?
- Reverse primer som är komplementär till sense-strängen och leder därmed till syntes av en ny anti-sense-sträng.
- Forward primer som är komplementär till anti-sense-strängen och leder till syntes av ny sense-sträng.
Hur sker den första cykeln av PCR?
- Temperatur höjs till 95-99 grader för att bryta vätebindningarna mellan basparen i DNA-strängarna.
- Temperaturen kyls ner till 55-60 grader så att primern ska kunna binda in till DNA-strängen.
- Temperaturen höjs lite igen till 70-72 grader så att syntes kan köras från primern och framåt tills templatet tar slut eller temperaturen ändras frö att nästa cykel ska kunna starta.
Hur många cykler ungefär brukar man köra PCR?
Ett 30-tal
I vilken cykel bildas den första PCR-produkten som är rätt längd?
I den tredje kommer två att bildas.
Hur tar man fram den DNA-sekvens som amplifieras via PCR?
Antingen direkt från genomiskt DNA eller efter skapande av cDNA från mRNA isolerat från cellerna.
Hur kan PCR användas inom klinisk diagnostik?
Exempelvis kan man använda RT-PCR (reverse transcriptase) för att diagnostisera en person med HIV genom att extrahera RNA från HIV-partiklar i plasma. Därefter körs revers transkription och PCR-amplifiering av cDN. Detta kan sedan användas i gelelektrofores för att se om det finns någon produkt. Därtill används ett kontrollprov från en person som känt är HIV-negativ.
