TP

Question 1

Les différentes classes de cellules immunitaires impliquées dans la réponse humorale sont retrouvées surtout au niveau des …

Answer 1

organes lymphoïdes secondaires (rate et ganglions lymphatiques)

Question 2

Quoi faire afin d’éliminer les érythrocytes de la rate?

Answer 2

on procède à une lyse des globules rouges avec une solution ACK ou de red lysis buffer. La solution ACK et une solution d’Ammonium-Chloride-Potassium qui permet d’éliminer les globules rouges sans affecter les globules blancs.

*Pour les ganglions lymphotiques, il n’y a pas de globules rouges.

Question 3

Comment différencier les lymphocytes?

Answer 3

Une fois les lymphocytes isolés de la suspension cellulaire de la rate, il est possible de les différencier grâce aux glycoprotéines spécifiques qu’ils portent à leur surface.

Des anticorps monoclonaux spécifiques à ces glycoprotéines et couplés à des fluorochromes seront utilisés en cytométrie en flux, permettant ainsi de déterminer les proportions de chacune des populations de cellules lymphoïdes de la rate.

Question 4

Que renseigne FSC vs SSC dans la cytométrie e flux?

Answer 4

En traversant le faisceau, la cellule diffuse et réfracte la lumière, ce qui nous renseigne sur sa taille (FSC) et sa granularité (SSC), respectivement.

Question 5

À quoi sert un contrôle négatif dans la cytométrie en flux (unstained cells)?

Answer 5

Afin de distinguer l’auto-fluorescence de la fluorescence attribuée aux fluorochromes, on s’assure d’avoir un contrôle de cellules non-marquées, ce qui détermine le bruit de fond, exclusivement attribué à la fluorescence naturelle.

Question 6

À quoi sert un hématimètre?

Answer 6

On dénombre les cellules contenues dans une solution à l’aide d’un hématimètre,

i.e. une lame de verre épaisse portant, gravé à sa surface, des carrés de dimensions précises d’une hauteur de 0,1 mm (la chambre à compter). Chaque hématimètre possède deux chambres à compter.

Question 7

L’énumération de cellules nucléées est effectuée en utilisant quel colorant?

Answer 7

le bleu de trypan.

Question 8

Que va colorer le bleu de trypan?

Answer 8

Ce colorant imperméable n’est pas internalisé par les cellules vivantes, mais les cellules mortes (perméables) peuvent l’internaliser. Il s’agit d’un colorant toxique pour les cellules : il faut donc procéder assez rapidement pour ne pas induire de mortalité cellulaire et ainsi fausser l’énumération cellulaire.

Question 9

Formule comptage de cellules avec hématimètre.

Answer 9

Formule : Nombre de cellules X (dilution dans bleu de trypan) X 10 000.

*Pour la dilution, si votre dilution était 1 :10, vous devez mettre le nombre 10 pour la dilution dans bleu de trypan. Cependant, si votre dilution était de 1 :5, vous devez mettre le nombre 5 pour la dilution dans bleu de trypan.

—> La formule donne la concentration => nombre de cellules/mL, si on veut la quantité totale on doit multiplier par le volume de l’échantillon

Question 10

Quel va être le marquage pour les cellules T naïves vs activées vs mémoires?

Answer 10

CD4, CD8, CD44, CD62L et TCR

Permettra de déterminer les cellules T naïves (CD44 négative et CD62L hi), activées (CD44 hi et CD62L low, et mémoires (CD44 mid et CD62L hi)

• TCR+

Question 11

Que permet la technique ELISA?

Answer 11

La technique ELISA (enzyme linked immunosorbent assay) est une technique immunoenzymatique qui permet la détection et le dosage des antigènes ou des anticorps présents dans une solution.

Question 12

Comment est adsorbé l’antigène dans l’ELISA?

Answer 12

On adsorbe l’antigène à une concentration connue dans le fond de la plaque qui servira à l’ELISA. L’antigène se fixera au plastique en fonction du pH, des forces électrostatiques et surtout, des forces hydrophobes.

Question 13

Expliquer comment faire un ELISA (5 étapes)

Answer 13

1. Adsorption de l’antigène sur le support : on adsorbe une quantité connue de l’antigène utilisé pour l’immunisation sur une plaque 96 puits. Les protéines se lient au polystyrène de façon non-covalente et pH-dépendante. Les protéines non fixées au support sont ensuite lavées.
2. Blocage des sites résiduels : afin d’empêcher que les anticorps se fixent au support de façon non-spécifique, on bloque les sites résiduels avec une protéine (élimination du « bruit de fond »).
3. Échantillons de sérum : les anticorps spécifiques à l’antigène utilisé, présents dans l’antisérum de souris, se fixent de façon spécifique à l’antigène adsorbé au support. Les anticorps non fixés sont ensuite éliminés par l’étape de lavage.
4. Anticorps secondaires : des anticorps anti-immunoglobulines de souris conjugués à la peroxydase de raifort, une enzyme, sont ajoutés aux puits. Ces anticorps se fixent aux anticorps de l’antisérum de souris fixés aux antigènes adsorbés au support. Les anticorps secondaires non-fixés sont éliminés par l’étape de lavage.
5. Révélation : le chromogène utilisé dans ce test est le dihydrochloride o‑phénylènediamine (OPD), lequel est ajouté aux puits avec du peroxyde d’hydrogène (H2O2), le substrat de l’enzyme conjuguée aux anticorps secondaires. Lorsque le H2O2 et la peroxydase de raifort réagissent ensemble, l’OPD s’oxyde, ce qui entraîne la coloration jaune du puits. L’intensité de la coloration est directement proportionnelle à la concentration d’anticorps dans le puits. Une fois la réaction chromogénique arrêtée avec l’acide sulfurique (H2SO4) 2M, l’intensité de coloration peut être lue au spectrophotomètre à 492 nm.

Question 14

Qu’est-ce qui compose le chromogène de l’ELISA?

Answer 14

OPD + tampon citrate

Question 15

Qu’est-ce qui cause l’apparition de couleur dans les puits de l’ELISA?

Answer 15

L’enzyme conjuguée à l’anticorps secondaire cause l’oxydation du chromogène, faisant apparaître de la couleur.

Lorsque le H2O2 et la peroxydase de raifort réagissent ensemble, l’OPD s’oxyde, ce qui entraîne la coloration jaune du puits.

Réaction positive

Question 16

Que représente le blanc dans l’ELISA?

Answer 16

Toute absorbance mesurée dans le blanc représente le bruit de fond qui ne doit pas être considéré comme une réaction positive, puisqu’elle ne résulte pas de la réaction substrat-enzyme spécifique à la fixation de l’antigène adsorbé sur le support.

Question 17

Comment déterminer un titre?

Answer 17

L’Inverse de la plus grande dilution qui a donné une réaction positive

Question 18

Qu’est-ce que l’électrophorèse?

Answer 18

L’électrophorèse fait référence à la migration d’une particule chargée sous l’influence d’un champ électrique.

Question 19

En fonction de quoi migrent les protéines dans un SDS-PAGE?

Answer 19

Puisqu’on utilise une matrice de migration non-homogène (le gel de polyacrylamide) et qu’on homogénéise grâce à l’ajout de SDS la charge de toutes les molécules de la solution, celles-ci migreront dans le gel en fonction de leur poids moléculaire.

Question 20

La polymérisation de l’acrylamide et de la bisacrylamide est initiée par quoi (2)?

Answer 20

des catalyseurs, soit le persulfate d’ammonium (APS) et le TEMED.

Les radicaux libres du APS catalysent la polymérisation de l’acrylamide et de la bisacrylamide, tandis que le TEMED accélère le taux de formation de radicaux libres du APS.

Question 21

Plus le pourcentage de polyacrylamide est élevé, plus la migration des protéines se fera de façon …

Answer 21

Précise —> plus détaillée

Question 22

La mobilité relative (Rf) des protéines dans le gel est ______________ au logarithme de leur poids moléculaire (Mr).

Answer 22

inversement proportionnelle

Question 23

Que permet SDS?

Answer 23

puissant dénaturant de protéines. Il s’agit d’un détergent anionique qui permet, d’une part, de solubiliser les protéines de l’échantillon, et d’autre part, d’appliquer une charge négative constante par unité de masse, en s’enrobant autour de la structure du polypeptide.

Question 24

Quels sont les gels présents dans la méthode Laemmi (2)?

Answer 24

On coule un gel de compactage au-dessus du gel de séparation, ce qui permet à l’échantillon de se compacter et se concentrer avant de pénétrer dans le gel de séparation, ce qui améliore ensuite la résolution et la séparation des polypeptides lors de la migration.

Question 25

Que permet le glycérol dans le gel?

Answer 25

Le glycérol augmente la densité de l’échantillon, ce qui facilite son chargement dans les puits

Question 26

Que permet le bleu de bromophémol dans le gel?

Answer 26

la coloration permet de suivre l’évolution de la migration, en plus de permettre le calcul du Rf des protéines (la mobilité d’une protéine divisée par la mobilité du front de migration).

Puisque le bleu de bromophénol est une très petite molécule anionique, elle migrera plus rapidement que toutes les autres, formant ainsi le front de migration.

Question 27

Qu’est-ce qu’on utilise pour la coloration des protéines sur le gel?

Answer 27

Pour la coloration des protéines sur le gel, on utilise une solution de bleu de Coomassie R250.

*On doit utiliser 10X le volume du gel pour la coloration, afin de s’assurer de diluer le SDS qui pourrait faire compétition aux protéines pour la liaison au colorant.

la coloration est non-réversible.

Question 28

Comment se fait le transfert des protéines du gel à la membrane PVDF?

Answer 28

Le gel de polyacrylamide et la membrane de PVDF sont ensuite mis en sandwich entre deux papiers absorbants pour ensuite être placés entre une anode et une cathode dans le module de transfert.

Les protéines, chargées négativement par le SDS, sont attirées vers l’anode (électrode positive). Elles quittent donc le gel et sont arrêtées par la membrane de PVDF, où elles se lient par des interactions hydrophobes.

Question 29

Quelles sont les 2 méthodes pour marquer les protéines totales sur la membrane PVDF?

Answer 29

La première, la coloration au Ponceau S, est réversible. Le colorant se fixe aux régions non-polaires des protéines et sert dans notre protocole à vérifier l’efficacité du transfert des protéines sur la membrane. La deuxième est la coloration à la NHS-biotine.

Question 30

Comment se fait la coloration de NHS-biotine (3 étapes)?

Answer 30

1. On incube d’abord la membrane avec la NHS-biotine : La NHS-biotine se fixe de façon irréversible aux résidus lysines ou au N-terminus des polypeptides qui ont migrés dans le gel et qui ont été transférés sur la membrane.
2. On ajoute ensuite la streptavidine couplé à la peroxydase de raifort (HRP) :
   —> La streptavidine est une protéine qui se fixe avec grande affinité à son ligand, la biotine. Le complexe formé par la streptavidine et la biotine possède la plus forte interaction non-covalente connue entre une protéine et son ligand.
   —> La peroxydase de raifort (HRP) est une enzyme qui agit sur le substrat utilisé pour la révélation.
3. On termine avec l’ajout du substrat (luminol), qui mène à la réaction de chemiluminescence, détectable avec le système Amersham Imager, équipé d’une caméra CCD : La peroxydase catalyse l’oxydation du luminol.

Question 31

Une fois le transfert confirmé, on peut également détecter une protéine immunologiquement, grâce aux anticorps spécifiques contenus dans l’antisérum de souris immunisée. Cette technique se déroule en quatre étapes :

Answer 31

1. Blocage non-spécifique des sites libres : Le blocage empêche l’adhérence non-spécifique des anticorps, ce qui augmenterait le bruit de fond.
2. Ajout de l’anticorps primaire : On incube la membrane avec l’antisérum produit par la souris immunisée. Les anticorps produits suite à l’immunisation se fixent sur les antigènes pour lesquels ils sont spécifiques.
3. Ajout de l’anticorps secondaire couplé à la HRP : Les anticorps anti-Ig de souris couplés à la HRP se fixent aux anticorps murins de l’antisérum, lesquels sont liés de façon spécifique aux protéines qui ont servies à l’immunisation de la souris.
4. Ajout du substrat (luminol) pour la révélation par chemiluminescence : La HRP couplée aux anticorps secondaires catalyse l’oxydation du luminol (réactif de détection), ce qui produit de la lumière d’intensité proportionnelle à la quantité de protéine détectée par les anticorps

Question 32

Quel est l’ordre des composant du sandwich de transfert?

Answer 32

papier absorbant, membrane de PVDF (marque sur le dessus), gel, papier absorbant.

Question 33

L’intensité de la coloration est _______________ à la concentration d’anticorps dans le puits (ELISA).

Answer 33

Directement proportionnelle

Question 34

Avec quoi arrêter la réaction chromogénique (ELISA)?

Answer 34

avec l’acide sulfurique (H2SO4)

Question 35

Que signifie une réaction négative lors de l’ELISA?

Answer 35

L’anticorps du sérum n’était pas complémentaire à l’antigène adsorbé sur la plaque donc ne sait pas lié. Si pas d’anticorps primaire alors l’anticorps secondaire couplé à la peroxydase (enzyme de raifort) n’a pas pu se lier. En absence de la peroxydase, il n’y a pas de réaction avec l’H2O2 donc pas d’oxydation de chromogène (OPD) donc pas d’apparition de couleur (pas d’absorbance)

Question 36

Comment fonctionnent les catalyseurs pour la polymérisation de l’acrylamide et de a bisacrylamide?

Answer 36

Les radicaux libres du APS catalysent la polymérisation de l’acrylamide et de la bisacrylamide, tandis que le TEMED accélère le taux de formation de radicaux libres du APS.

Question 37

À quelle température doit-on faire un gel d’électrophorèse?

Answer 37

Lors de la préparation d’un gel d’électrophorèse, on devrait toujours utiliser des solutions à température de la pièce, préparées avec de l’eau distillée ou désionisée et dégazées. La polymérisation d’un gel de polyacrylamide est un processus exothermique, qui peut être influencé par la température ambiante et l’oxygène atmosphérique.

*Bien qu’après 15-20 minutes le mélange ait commencé à gélifier, la polymérisation se poursuit pendant environ 2 heures.

Question 38

En règle générale, plus le pourcentage d’acrylamide est faible et que le gel est mince, plus le transfert sera ___________.

Answer 38

efficace

Question 39

Comment déterminer Rf?

Answer 39

Rf = distance migration de protéine/distance front de migration

Distance front de migration —> bleu de bromophénol