TEMA 4.- DIAGNÓSTICO DE LABORATORIO DE LAS ANEMIAS HEMOLÍTICAS. HEMOGLOBINOPATÍAS Flashcards
Tipos de anemias hemolíticas
DOS TIPOS EN FISIOPATOLOGÍA:
ANEMIAS HEMOLÍTICAS CORPUSCULARES O INTRÍNSECAS:
Debidas a una alteración de los propios eritrocitos que los hace más frágiles, dando lugar a una hemólisis temprana.
Hereditarias, excepto la hemoglobinuria paroxística nocturna.
ANEMIAS HEMOLÍTICAS EXTRACORPUSCULARES O EXTRÍNSECAS :
Debidas a agresión externa
La mayoría son adquiridas, como la anemia hemolítica autoinmune
ANEMIA HEMOLÍTICA POR ALTERACIÓN DE LA MEMBRANA:
(CAUSAS)
- Esferocitosis hereditaria = Enfermedad de Minkowski-Chauffard: es la más frecuente anemia hemolítica congénito crónica en países occidentales (1:2000 en el área mediterránea) > 8% esferocitos
Una alteración del citoesqueleto de los hematíes que hacen que sea esférico (esferocitos), se ven más rojizos y sin zona pálida en el centro y son muy frágiles. - Eliptocitosis hereditaria > 25% eliptocitos. Los hematíes son ovalados.
- Estomatocitosis congénita: Hay una aumento en la permeabilidad del na y K y en la morfología. la depresión en vez de estar en el centro está en un lado y en el microscopio aparece como si fuera una banda pálida en vez de un centro pálido.
- Hemoglobinuria paroxística nocturna: Enfermedad de Marchiafava-Micheli, debida a la ausencia de glicosilfosfatidil inositol que causa déficit de proteínas de membrana y susceptibilidad al complemento (adquirida). El paciente orina hemoglobina solo por la noche, y se producen estas crisis nocturnas pq cuando dormimos se asume que baja la Tª corporal haciendo que se active el complemento, pero nuestros hematíes están protegidos frente al complemento activado. En esta enfermedad se produce una mutación somática (no es una enfermedad congénita, es adquirida) en una población de hematíes, tiene un déficit de glucosil fosfatidil inositol. Son las que confieren resistencia frente el complemento pq este forma poros en las membranas. Esas proteínas de membrana tienen que unirse al glucosidil inositol y tienen que unirse a la enzima? Entonces los hematíes carecen de glucosil inositol haciendo que no se anclen en su membrana estas proteínas haciéndolos susceptibles frente al complemento.
ANEMIA HEMOLÍTICA POR ALTERACIÓN DE LA MEMBRANA (DIAGN ÓSTICO)
1º Pruebas generales de anemia hemolítica: (se deben aplicar a todas las anemias hemolíticas)
Descenso de Hb en sangre. Aparece en algunas anemias hemolíticas. Pq cuando hay hemoglobinopatía podemos tener unos niveles normales de Hb, pero que está mutada.
Elevado recuento de reticulocitos.
Descenso de haptoglobina en suero (o plasma). Esta es una proteína plasmática que se une a la Hb que cuando sale del hematíe es importante evitar que se pierda en orina para evitar q se pierda hierro y la haptoglobina forma un complejo con la Hb q es rapidamente fagocitado por los macrofagos. Entonces cuando hay hemólisis el signo más visible es el descenso de haptoglobina y a veces desaparece.
Elevada LDH eritrocitaria (LD1 y LD2) en suero (o plasma). Parámetros más sensibles este y haptoglobina.
Elevada bilirrubina no conjugada en suero o plasma e ictericia.
Elevada Hb en suero y orina (hemólisis intravascular).
Elevado urobilinógeno en suero y orina.
Hemosiderinuria (hemosiderina en sedimento urinario).
Sin cambios en las transaminasas para descartar hepatopatía.
2º Examen de un frotis sanguíneo:
Esferocitos (1) : para que sea esferocitosis hereditaria tiene que ser superior al 8%
Esquistocitos (2) : son los hematíes rotos.
Eliptocitos:
La esquistocitos y eliptocitosis son problemas en el citoesqueleto.
3º Pruebas de hemólisis:
a) Para determinar la fragilidad eritrocitaria:
* Curva de hemólisis: Resistencia osmótica a medios hipotónicos: Sometemos los hematíes a soluciones hipotónicas de cloruro sódico. Vemos los primeros tubos sin hemólisis, luego ya vemos una ligera hipotonía con un poco de hemólisis. El sobrenadante rojizo indica que hay hemólisis. Cuando no hay hemólisis el sobrenadante es transparente. Aparece hemólisis con una ligera hipotomia indicando la fragilidad de los hematíes.
* Prueba de autohemólisis: Se determina la hemólisis después de incubar los eritrocitos a 37º durante 24 h en presencia o ausencia de glucosa. Es más lenta pq hay q incubar a los eritrocitos. Los hematíes carecen de núcleos y de orgánulos y su metabolismo anaeróbico depende exclusivamente de la glucólisis. S
Si es una anemia hemolítica incluso con glucosa habrá hemólisis
En ausencia de glucosa si los hematíes están bien la hemólisis tiene que ser mínima. En ausencia de glucosa con anemia habrá una disminución de los niveles de ATP favoreciendo la fragilidad de los hematíes favoreciendo su fragilidad y hay más hemólisis.
b) Determinar la susceptibilidad al complemento: Para la HPN (en esta enfermedad se produce por una degradación somática, es deficiencia en al enzima que sintetiza el glucosil fosfatidil inositol que es donde se anclan las proteínas de membrana que ofrecen resistencia al complemento) estas pruebas activan el complemento, se usan dos vías:
* Prueba de Ham-Dacie: Prueba de hemólisis en medio ácido que activa al sistema de complemento. Usa la acidificación del medio para activar al complemento.
* Prueba de la sacarosa: Prueba de hemólisis en medio isotónico de baja fuerza iónica con sacarosa que activa al sistema de complemento. Usa un medio con muy poca fuerza iónica que tmb activa al complemento. Si sustituimos los iones del plasma por moléculas que no tienen carga como la sacarosa, el complemento se activa automáticamente al bajar la carga iónica del medio. Entonces se incuban los hematíes con el plasma en un medio ácido y si hay hemólisis indica que hay HPN y si no es que son hematíes normales. La prueba alternativa es sustituir parte del plasma con sacarosa con muy poca carga iónica y se activará el complemento si no hay hemólisis son hematíes normales.
4º CITOMETRÍA DE FLUJO: utilizando anticuerpos fluorescentes
A) Con 5´eosina-maleimida (EMA) para la esferocitosis hereditaria: para confirmación de esferocitosis hereditaria: hay una alteración en el citoesqueleto, hay un déficit en la proteína EMA que confiere esa flexibilidad y pierde ese disco bicóncavo (la forma). Con esta técnica, usando esa proteína para marcar se usa una sonda fluorescente que es la EMA que cuando se une a la proteína de banda 3 emite una fluorescencia. Si emite mucha fluorescencia tiene una forma y si hay una población que carece de esta fluorescencia nos indicaría que es una población en la que encontraríamos esferocitos que con el frotis sanguíneo tmb hemos visto. Primero frotis y luego ema. Si hay déficit de fluorescencia quiere decir que hay un déficit de esa proteína.
Es muy sensible y específica para cuantificar la proteína de banda 3 en la membrana de los eritrocitos.
La fluorescencia de EMA está disminuida en la esferocitosis.
B) Para el diagnóstico de la hemoglobinuria paroxística nocturna:
Se usan Ac marcados con fluoresceína que reconocen la prot de membrana de los hematíes que son la CD55 y CD59. Habrá Ac específicos para cada una. Las proteinas de membrana que se van a anclar en el glucosil fosfatidil inositol son entre otras CD55 y CD59 que confieren resistencia frente al complemento entonces al hacer la incubación y aparecer fluorescencia, la población con fluorescencia es normal y sin fluorescencia indica que hay una población que carece de CD55 o CD59 en función del Ac que se utilice. No se deben mezclar los dos Ac CD55 y CD59, haces la prueba con uno u otro.
* Para detectar el déficit de CD55 y CD59 debidos a la ausencia de glucosil fosfatidil inositol, que se requiere para su unión a membrana.
ANEMIAS HEMOLÍTICAS POR HEMOGLOBINOPATÍA
a) β Talasemia: Por disminución en síntesis de globina β:
Hay una mutación en la región promotora del gen que codifica para la globina beta. Entonces disminuye la síntesis de la hemoglobina beta (su estructura es normal (la región codificante es normal por eso la estruc es normal) pero su síntesis es deficitaria)
Un paciente que tiene beta talasemia como tiene déficit de beta aumentara el % de Hb A2 y el de la Hb fetal que tiene las gamma en vez de beta. Aumentaran los % de las hemoglobinas minoritarias que no tienen beta. La beta talasemia es la más frecuente
- β Talasemia mayor: Homocigótica o anemia de Cooley; cuando las globinas β están ausentes o intensamente reducidas, el exceso de globina α precipita y causa hemólisis grave, ictericia, hipocromía y microcitosis. Es la forma más severa. Hay un exceso de globinas alfa y este exceso precipita y es lo que provoca la fragilidad, la hemólisis.
- β Talasemia menor: Heterocigótica o rasgo de Cooley; asintomática o con anemia moderada. Es la más frecuente.
b) α Talasemia: Por disminución en síntesis de globina α:
En el caso de los genes alfa no tenemos 2 alelos como en la beta sino que tenemos 4. Las alfa están en todas las hemoglobinas, entonces es necesario que haya 4 alelos como un sistema de protección.
- “Hydrops fetalis” con Hb Bart (γ4): Por ausencia de los 4 genes α genes que produce muerte fetal por edema grave pq hay una hipoxia grave, es la única hemoglobina que existe es la gamma 4, que son las subunidades que tiene la fetal en ausencia de la alfa, trasporta poco oxígeno y el feto sufre una hipoxia severa que produce edema y acaba produciendo la muerte. Es incompatible con la vida. Aborto.
- Enfermedad de la Hb H (β4): Por ausencia de 3 de los 4 genes α . Tiene 4 subunidades beta, transporta poco oxígeno y produce una hipoxia severa pero no es letal.
- α Talasemia menor: Por ausencia de 2 de los 4 genes α (–/αα) or (-α/-α) con anemia moderada y microcitosis. La anemia puede ser moderada.
2.2.Anemia drepanocítica: o falciforme
2.3.- Hemoglobinopatías heterocigóticas por sustitución de un aminoácido junto al grupo hemo:
2.4.- Hemoglobinas inestables:
2.5.- Persistencia hereditaria de Hb F:
2.6.- Diagnóstico de la laboratorio de las anemias hemolíticas por hemoglobinopatía:
Anemia drepanocítica: o falciforme
- Debida a la presencia de Hb S (β6 Glu Val) Tiene una mutación puntual en la cual hay un cambio de un aa en la posición 6 de la hemoglobina beta de glu a val. Si está oxigenada la hemoglobina S es normal pero cuando hay un hipoxia si se forma desoxi hemoglobina S es insoluble entonces precipita formando unos cristales llamados tactoides que producen una falciformación. Son alargados con forma de oz o media luna. Son muy frágiles, tenemos dos formas la homocigota y heterocigota.
- Anemia drepanocítica homocigota: Cursa con anemia hemolítica crónica cuya gravedad se incrementa con la edad, apareciendo drepanocitosis incluso a pO2 fisiológica. Puede aparecer hiperplasia medular, alteraciones óseas y úlceras en las piernas. La homocigota es la más común, sobretodo en la raza negra. Esta es la complicada. Cursa con una anemia que puede ser grave, aumenta la gravedad con la edad, pq cuando los dos alelos son de globina beta mutada, los dos son de hemoglobina S, y entonces con la edad hay un cierto grado, disminuye la función respiratoria. En un anciano sano no pasaría nada pero uno que tuviera los dos alelos la S puede producir una disminución de la función respiratoria produciendo una drepanocitosis con la edad haciendo que en los huesos se produzca una hiperplasia para intentar compensar. Entonces la médula ósea intenta compensar produciendo deformaciones óseas y úlceras en las piernas.
- Forma heterocigótica o rasgo drepanocítico: La anemia sólo aparece cuando hay hipoxia (vuelos transoceánicos, anestesia, insuficiencia respiratoria, insuficiencia cardiaca). Con alta incidencia (25% en África; 9% de la raza negra en USA). Protege frente al paludismo. Son asintomáticos excepto cuando aparece hipoxia. Por ejemplo una gripe a nosotros nos produciría lo típico de malestar pero en este caso se agravan los síntomas. Una operación que requiera anestesia produce también cierto grado de hipoxia pero estas personas necesitan un aporte extra de oxígeno. En un crucero trasatlántico hay cierto % de hipoxia.
Ahora ya vamos a ver anemias menores: la beta talasemia y la falciforme son las más potentes la alfa ya no tanto
Hemoglobinopatías heterocigóticas por sustitución de un aminoácido junto al grupo hemo
a) Asociada con metahemoglobina y cianosis: estas estabilizan la meta hemoglobina. En los hematíes tenemos hemoglobina con hierro ferroso se tiene que mantener reducido si se oxida a hierro +3 se convierte en metahemoglobina. En el eritrocito tenemos un ambiente reductor donde hay una hemoglobina reductora que reduce rápidamente a la hemoglobina. La metahemoglobina es inestable y transporta poco oxigeno. Cuando hay una mutación que estabiliza la metahemoglobina, hace que se forme la hemoglobina M, que es una hemoglobina que cuando se oxida queda estabilizada, entonces estos pacientes tienen en sus eritrocitos una cantidad significativa de metahemoglobina M, que como trasporta poco oxigeno producirá una hipoxia grave y por eso estos pacientes sufren cianosis, no tienen ictericia sino que tienen cianosis por la hipoxia grave.
Debida a Hb M que transporta poco oxígeno.
Debida a mutación en globinas α o β.
b) Por alteración de la afinidad por el oxígeno:
- Por aumento de la afinidad por el oxígeno, produciendo policitemia y relativa hipoxia tisular: por ej. La Hb Chesapeake tmb pueden producir anemia pero la hipoxia nunca será grave, será ligera. Si tiene mucha afinidad se cargará con mucho oxígeno a los pulmones, hay anemia pq lo cede difícilmente, hay hipoxia tisular aunque en sangre hay mucho oxígeno, se produce hipoxia relativa, no es grave nunca. Hay varias hemoglobinas de este tipo y reciben cada una un nombre carac.
- Por disminución de la afinidad hacia el oxígeno, que produce hipoxia grave y cianosis: por ej. Kansas (la + conocida)
Hemoglobinas inestables:
- Debidas a sustitución o deleción de una secuencia en los genes de las globinas α o β . Esto genera hemoglobinas poco solubles que precipitan. Hemoglobinas inestables pq suelen precipitar y forman los corpúsculos de heinz. En las talasemias como falta la globina beta hay exceso de alfa. El precipitado de las alfa o beta se produce en el citosol del eritrocito y está repartido de forma más o menos homogénea. Cuando se forman corpúsculos de heinz se fijan a la membrana provocando la fragilidad entonces es un precipitado focalizado en la membrana no en el citosol, y estas anemias suelen ser normocíticas, bien normocrómicas o hipocrómicas.
- Las Hbs inestables precipitan formando corpúsculos de Heinz que se fijan a las membranas produciendo fragilidad
- Las Hbs inestables pueden dar lugar a anemias normocíticas, bien normocrómica o hipocrómicas.
Persistencia hereditaria de Hb F
Es una anemia hemolítica rara en la cual el % de hemoglobina fetal es mucho más alto de lo normal y esto provocará la paradoja tendrá mas afinidad por el O2 la hipoxia nunca será grave, será relativa y se debe por menor cesión a los tejidos del O2.
Diagnóstico de la laboratorio de las anemias hemolíticas por hemoglobinopatía
1º Pruebas generales de anemia hemolítica:
Descenso Hb en sangre. Esto no se produce en todas las anemias por hemoglobinopatía. Esta es la norma general. En las anemias suele estar baja pero no en todas pq podemos tener una concentración normal en una hemoglobina anormal (pq tiene una mutación).
Recuento de reticulocitos.
Haptoglobina en suero (o plasma).
LDH eritrocitaria (LD1 y LD2) en suero (o plasma).
Bilirrubina no conjugada en suero o plasma e ictericia.
Aumento de Hb en suero y orina (hemólisis intravascular).
Aumento de urobilinógeno en suero y orina.
Hemosiderinuria (hemosiderina en sedimento urinario). Sin cambios en las transaminasas para descartar hepatopatía.
2º Electroforesis de hemoglobina o HPLC:
* Electroforesis sobre acetato de celulosa o en gel de poliacrilamida para cuantificar la Hb A2 y HbF que se incrementan en la β talasemia. Se puede hacer en papel (acetato) o en gel. Generalmente se hace con gel. Entonces se detectan las bandas, la A tendría la banda común y la fetal o la S tienen bandas que se diferencian mínimamente pero en la migración se pueden llegar a diferenciar, entonces se cuantifica la banda de la hemoglobina minoritaria o de la hemoglobina anormal. Si fuera una beta talasemia tendría que aumentar el % de hemoglobina fetal o A2 croe.
* HPLC (Cromatografía líquida de alta resolución) para cuantificar las Hbs menos abundantes. Es más precisa. Si un sujeto es normal tiene el cromatograma de la izq (mucha Hb A y poca A2) cuando aparecen Hb anormales aparecen los picos extras (pico de la HbF, de la Hb S) si fuera una beta talasemia el pico de la F aumenta y el de la A2 tmb , la S no.
3º Pruebas de falciformación: recuerda que la hemo S precipita cuando hay hipoxia. hay dos variantes: y se deben hacer las dos.
a) Prueba de Itano: prueba muy sencilla, incubar en un porta una gota de sangre durante 1 h a 37ºC solo es suficiente para inducir una hipoxia relativa. Si la anemia drepanocítica es homocigota en esa hora se producirá falciformación (media luna o de oz) por la formación de desoxy hemoglobina S que precipita y hay falciformación. El problema está en las anemias drepanocíticas heterocigotas pq la falciformación como solo hay un alelo con la hemo S la falciformación es más lenta y puede haber falsos negativos, los homo serán todos positivos pero los heterocigotos pueden ser positivo y negativos. Por eso es necesario hacer la segunda prueba
Incubación durante 1 h a 37 ºC
- Falciformación rápida en homocigosis
- Falciformación lenta en heterocigosis que puede ocasionar falsos negativos
b) Prueba del metabisulfito: incuba una gota de sangre con metabisulfito que provoca una desoxigenación rapida de sangre provocando la formación de desoxihemoglobina A y S en caso de que la haya la S. Entonces la formación es muy rápida, rescatamos los posibles falsos negativos de la prueba de itano pq inducimos una desoxigenación rapida e intensa con metabisulfito
Si la primera prueba da positiva ya no hace falta hacer la segunda. (Metabisulfito → desoxiHb S)
4º Tinción con azul de cresilo brillante: este colorante tiñe las Hb precipitadas. Entonces nos sirve para apoyar el diagnóstico de las talasemias, y de las hemoglobinas inestables y para diferenciarlos. La diferenciación si es una talasemia el precipitado se produce dentro de la cel en el citosol, es un precipitado más o menos homogéneo. El precipitado azulado en la beta talasemia está distribuido más o menos en el citosol en cambio si es una Hb inestable son los corpúsculos de heinz que estan adheridos a la membrana entonces los puntos precipitados solo hay 1 o 2 y están en la membrana justo en las paredes de la célula, esto nos sirve para diferenciar una hemoglobina inestable de una talasemia. La mayoría de los casos de talasemia son betas y suelen ser beta talasemia makro sin síntomas y entonces no habrá precipitado.
* La presencia de inclusiones azul verdosas en la membrana es indicativa de corpúsculos de Heinz (Hbs inestables)
* La presencia de inclusiones azul verdosas en el citosol es indicativa de talasemia
5º PCR para detectar mutaciones en promotores de globinas:
Cuando se conoce la mutación que hay en el promotor del gen alfa o del beta. Cuando la mutación es conocida se utilizan polinucleótidos conocidos. Hay que aislar el ADN del paciente para detectar los oligonucleótidos específicos. Se obtiene ADN y se hace la hibridación con los oligonucleótidos específicos de esa mutación entonces es cuando la mutación es conocida, el hecho de que no se detecte puede ser una mutación nueva, es una prueba muy sensible pero para mutaciones conocidas.
Amplificación del ADN mediante PCR (polymerase chain reaction)
Hibridación con oligonucleótidos marcados específicos para mutaciones
Detección del marcaje
6º Cuantificación de la Hb F tras desnaturalización alcalina:
Una electroforesis o HPLC es el método más recomendado. Cuando no se dispone, podemos usar como alternativa la prueba de la desnaturalización alcalina.
En medio alcalino (ph básico) la única Hb soluble es la fetal, las demás precipitan. Se trata la muestra de sangre con sosa se hemolizan los hematíes, precipitan todas las Hb menos la fetal, se filtra donde se quedan retenidos las membrana de hematíes y Hb precipitadas y en el sobrenadante se determina la Hb.
Tratamiento de la muestra de sangre con NaOH
Filtración
Determinación de Hb
Anemias hemolíticas por enzimopatía (Causas)
- Déficit de glucosa 6 P deshidrogenasa (G6PDH): Induce susceptibilidad a la hemólisis en los tratamientos con fármacos pro-oxidantes (sulfamidas, nitrofurano, aminoquinolina, y primaquina), en infecciones o tras ingesta de habas (favismo). Debido a este déficit, no se genera NADPH, no actúa la glutatión reductasa y no se regenera el glutatión, de esta forma no se pueden reducir las sustancias oxidantes.
- Déficit de piruvato quinasa que bloquea la glucólisis, la única fuente energética de los eritrocitos. El último paso, que convierte fosfoenolpiruvato en piruvato, está bloqueado. La deficiencia de ATP hace que las membranas de los GR se vuelvan frágiles.
- Déficit de pirimidin 5’ nucleotidasa que se requiere para degradar ARN en los reticulocitos. El acúmulo de ARN puede provocar fragilidad.
Anemias hemolíticas por enzimopatía (Diagnóstico de laboratorio del déficit de G6PDH)
a) Métodos cualitativos: ALTERNATIVA
- Prueba de la mancha fluorescente: unas gotas de sangre se ponen en contacto con Glu-6-P + NADP, por tanto, si está presente la enzima, se generará NADPH y se detectará una mancha fluorescente.
- Determinación de los niveles de glutatión reducido (GSH), que dependen del NADPH y actividad G6PDH
- Prueba citoquímica para detectar la actividad G6PDH que reduce el metiltiotiazol a formazan que forma gránulos. Es sensible para detectar heterocigotos.
b) Métodos cuantitativos: DE ELECCIÓN
Consiste en medir la actividad G6PDH según la tasa de formación de NADPH (absorbancia a 340 nm)
Anemias hemolíticas extracorpusculares
- Anemia hemolítica autoinmune inducida por anticuerpos frente a la membrana eritrocitaria, tales como IgG (anticuerpos calientes), IgM (anticuerpos fríos), aloinmune o inducida por fármacos
Podemos encontrar anticuerpos que son inmunoglobulinas G (AC calientes) o anticuerpos fríos (IgG). Dentro de este grupo encontramos las anemias hemolíticas inducidas por fármacos, que es cuando no se conoce el componente inmunológico. - Hipersplenismo: cuando aumenta de tamaño del bazo que es donde se produce la eritrocateresis cuando los eritrocitos tienen 120 días. Cuando son más frágiles en las corpusculares se acelera y en este caso cuando aumenta de tamaño el bazo incluso los hematíes jóvenes se rompen.
- Agresión mecánica debida a válvulas cardíacas o depósitos de fibrina en capilares que ocurren en la coagulación intravascular diseminada o en microangiopatías. Cuando hay una insuf cardiaca y se implanta una válvula para corregir la insuficiencia como efecto colateral puede producir eso
- Patógenos: Paludismos, babesiosis, clostridium perfringens son mo que liberan toxinas hemolizantes
- Anemia hemolítica microangiopática: con esquistocitos en el frotis sanguíneo. Cuando hay un problema en los vasos que va a provocar la ruptura de los hematíes, la presencia de muchos esquistocitos.
Dos patologias raras: - Púrpura trombocitopénica idiopática debida a un grave descenso en la actividad ADAMTS13 (proteasa que degrada al factor de Von Willebrand). Causa desconocida pero el mec es una pérdida del factor que degrada el factor de von willebrand que actúa de puente entre las plaquetas activadas y el endotelio.
- Síndrome hemolítico urémico atípico debido a la alteración en la regulación del sistema de complemento. esto es cuando hay uremia. otras causas de anemia hemolítica puede ser el veneno de serpiente.
- Otras causas: venenos, intoxicación por cobre o toxinas.
Anemias hemolíticas extracorpusculares (DIAGNÓSTICO)
Test de Coombs cómo diagnosticar anemia autoinmune hemolítica
a) Test de Coombs directo:
* Para detectar anticuerpos fijados a las membranas de los eritrocitos, cuando los eritrocitos se incuban con suero anti-globulina humana serum (suero poliespecífico anti IgG y anti C3d)
* Es la técnica serológica más importante en inmunohematología.
* Se requiere para el diagnóstico de:
Anemia hemolítica autoinmune.
Anemia hemolítica inducida por fármacos. (que podría tener un componente inmune)
Anemia hemolítica inducida por transfusión.
Anemia hemolítica de los neonatos.(tmb puede tener un componente mediado por ac)
El directo detecta Ac fijados a la membrana de los eritrocitos, para ello se incuban los eritrocitos del paciente con suero de conejo que tiene antiglobulina humana. Es un suero poliespecífico con anti Ig G y anti C3D.
Es la técnica serológica más importante y usada en inmunohematología y se usa no sólo para el diagnóstico de la anemia hemolítica autoinmune, sino tmb inducidas por fármacos que podrían tener un componente autoinmune.
Estos anticuerpos del reactivo de coombs van a unirse a los autoanticuerpos y al unirse se provoca una aglutinación y se ve como hay precipitado. Si hay precipitado es positiva la prueba pq quiere decir que había autoanticuepros fijados a la membrana
b) Test de Coombs indirecto:
* Para detectar autoanticuerpos en el suero dirigidos a antígenos eritrocitarios que son normales, cuando se incuban con suero del paciente que es el que contiene los autoanticuerpos.
* Se requiere:
Como complemento del test de Coombs directo en diagnóstico de anemia hemolítica autoinmune. Y además se recomienda para valorar la compatibilidad antes de realizar una transfusión. Es para evitar generar una anemia hemolítica por transfusión.
Directo: en verde son los autoanticuerpos que se unen a proteínas del eritrocito y estan fijados.
La clave de usar los dos test, directo y indirecto es que el paciente tiene autoanticuerpos que pueden estar fijados a la membrana o libres en el plasma. Al hacer el directo no excluye que haya anemia hemolítica inmune pq podrían haber libres en el plasma. La anemia hemolítica inmune tiene autoanticuerpos que atacan la membrana del eritrocito y producen hemólisis. Estos autoanticuerpos pueden estar fijados a la membrana o circulando libres en el plasma entonces es necesario buscarlos en ambos sitios. Si no encontramos fijados en la membrana no podríamos decir que no hay anemia hemolítica inmune pq podrían haber en plasma. Por tanto hay que hacer tmb el indirecto como complemento.
Indirecto: se usan hematíes de un sujeto control (hematíes que se han aislado, que se han lavado) y se usan para hacer el indirecto. En el caso del directo los hematíes del paciente tmb se retiran y se lavan para incubar con el coombs. En el indirecto los hematíes son de un sujeto control normal se lavan y se incuban con el suero del paciente se van a unir los autoanticuerpos a los ag normales del eritrocitos y después de que se produce esta sensibilización entonce cuando se incuban con el reactivo de coombs. Estos anticuerpos antiglobulina humana del reactivo de coombs si se unen a la membrana produce la aglutinación y el precipitado.
Con que uno de los dos test sea positivo ya es anemia hemolítica autoinmune, y el indirecto se utiliza antes de hacer una transfusión para comprobar que es compatible.
