Tecniche di colorazione Flashcards
Emallume-eosina
È una colorazione bicromica che prevede l’uso sequenziale di due soluzioni coloranti, I’emallume (colorante basico, colora in blu/violetto i nuclei legandosi agli acidi nucleici) e l’eosina (colorante acido, colora in rosa il citoplasma legandosi a proteine basiche ).
- Colorazione del nucleo: il vetrino viene immerso in emallume (colorazione iniziale: rosso mattone).
- Passaggio in acqua distillata per eliminare l’emallume non legato.
- Viraggio del colore in acqua di fonte (colorazione: blu/violetto).
- Colorazione del citoplasma: immersione del vetrino in eosina.
- Passaggio in acqua distillata per eliminare eosina in eccesso.
- Disidratazione, chiarificazione e montaggio vetrino coprioggetto.
Oil red
L’oil red è una tecnica di colorazione che evidenzia i lipidi presenti nel tessuto/cellula in rosso; di conseguenza, precedentemente non avviene il processo di diafanizzazione e il tessuto non è incluso in paraffina.
- Tessuto affettato al criostato (-35°C).
- Fissazione.
- Immersione del vetrino in isopropanolo 60%.
- Colorazione con (polvere) oil red in isopropanolo 60%.
- Risciacquo in acqua distillata.
- Montaggio vetrino coprioggetto.
Tricromica di Azan Mallory
La colorazione di Azan-Mallory è una tecnica istologica usata per distinguere le cellule dalla matrice extracellulare e per mettere in evidenza le fibre di collagene del tessuto connettivo. Per questa tecnica viene utilizzata una miscela di coloranti, nello specifico tre soluzioni: soluzione A contenente fucsina acida che colora di rosso intenso il nucleo; soluzione B; soluzione C contenete methyl blue, che colora di blu il collagene, e orange C, che colora di arancio/rosa il citoplasma.
- Passaggio in soluzione A per 2 minuti.
- Passaggio in acqua distillata per 1 minuto.
- Passaggio in soluzione B per 2 minuti.
- Passaggio in acqua distillata per 1 minuto.
- Passaggio in soluzione C per 2 minuti.
- Passaggio in acqua distillata per 1 minuto.
- Disidratazione, chiarificazione e montaggio vetrino.
PAS
La reazione PAS (acido periodico - reattivo di Schiff) è una reazione istochimica, che evidenzia, colorando di rosso/magenta, i carboidrati.
È una colorazione bicromica: oltre a colorare i carboidrati, colora anche i nuclei (emallume – blu/viola).
1. Ossidazione dei carboidrati – per 5-10min – in una soluzione di acido periodico 0,5%; porta alla formazione di aldeidi.
2. Lavaggio in acqua corrente per 5-10min.
3. Passaggio delle sezioni nel reattivo di Schiff – per 30-40min – che riconosce le aldeidi e conferisce loro la colorazione rosso/magenta.
4. Lavaggio in acqua corrente per 5-10min.
5. Passaggio in emallume: colorazione nuclei.
6. Disidratazione e montaggio vetrino.
Picrosirius red
La picrosirius red è una reazione istochimica che dà come risultato una colorazione gialla per il citoplasma e rossa per il collagene.
- Passaggio in 100ml di soluzione satura di acido picrico (gialla) in cui si è sciolto 1g di polvere RED80.
- Lavaggio in acqua distillata.
- Passaggio in acqua acidificata per mantenere ben legato il collagene al RED80.
- Lavaggio in acqua distillata.
- Disidratazione e montaggio vetrino.
Immunoistochimica
L’immunoistochimica è un metodo complesso e altamente specifico per la rilevazione di determinati antigeni presenti nel tessuto o nelle cellule da esaminare. Su una sezione di tessuto o su cellule opportunamente preparate, si pone l’anticorpo specifico per l’antigene che stiamo cercando. Avremo, in questo modo, una reazione immunitaria antigene-anticorpo che sarà successivamente rivelata da un anticorpo secondario coniugato ad un enzima catalizzatore (ad es. perossidasi) che reagisce con un substrato (cromogeno, ad es. DAB, FAST RED-TR) formando un precipitato insolubile colorato visibile al microscopio ottico.
Come metodi di rilevazione si possono usare, a seconda del materiale a disposizione o della tematica da sviluppare, i seguenti metodi:
1. Metodo diretto. Si parte da uno anticorpo specifico legato alla perossidasi (enzima catalizzatore) che, applicato al tessuto, si legherà specificamente all’antigene permettendo la successiva rivelazione mediante un substrato cromogeno (DAB marrone, FAST-RED rosso, BPIC blu).
2. Metodo indiretto. Un anticorpo primario ottenuto da animale (ratto, topo, coniglio) viene fatto reagire con l’antigene eventualmente presente su una sezione di tessuto. Successivamente si aggiunge un anticorpo secondario coniugato specifico per gli anticorpi dell’animale usato in precedenza (ratto, topo o coniglio) e che poi, mediante un substrato colorato, viene rivelato.
Immunofluorescenza
L’immunofluorescenza, come l’immunoistochimica, è un metodo altamente specifico per la rilevazione di determinati antigeni presenti nel tessuto o nelle cellule da esaminare. Su una sezione di tessuto o su cellule opportunamente preparate, si pone l’anticorpo specifico per l’antigene da analizzare. Otterremo così una reazione immunitaria antigene-anticorpo. Si possono utilizzare sia anticorpi direttamente coniugati a molecole fluorescenti (fluorocromi, ad es. FITC, TRITC, PE, ecc.) ed in questo caso si parla di immunofluorescenza diretta, oppure la reazione antigene anticorpo viene evidenziata utilizzando un secondo anticorpo coniugato ad un fluorocromo, specifico per il primo anticorpo, in questo caso si parla di immunofluorescenza indiretta. Il campione così “colorato” sarà poi analizzato mediante microscopio a fluorescenza o microscopio confocale.
MGG
Il colorante May Grunwald Giemsa è usato per la colorazione dello striscio di midollo osseo.
1. Gli strisci di sangue vengono lasciati seccare all’aria.
2. Fissaggio con metanolo, e risciacquo.
3. Colorazione. Il colorante è dato da una soluzione di eosina (1.0g), methyl blue (1.0g) e metanolo (100mL) disciolta in acqua distillata secondo un rapporto 1:1.
4. Risciacquo.
5. Visione al microscopio 40x o 100x utilizzando un obiettivo a immersione ad olio.
Come risultato avremo: gli eritrociti in rosa-marrone, i linfociti in blu con nuclei viola, i granulociti eosinofili in blu-violetto, i granuli eosinofili in rosso, i granulociti neutrofili in blu-violetto, i granuli neutrofili in rosso, i granulociti basofili in blu-violetto.
