Preparazione campione Flashcards
Fasi
- Prelievo del campione tramite biopsia.
- Processamento.
a. Lavaggio in NaCl 0,9%
b. Fissazione
c. Disidratazione
d. Diafanizzazione
e. Inclusione - Taglio e posizionamento su vetrino
- Reidratazione
- Colorazione
- Risciascquo e montaggio vetrino coprioggetto
- Visione al microscopio
Processamento
I campioni da osservare con il microscopio ottico devono essere processati attraverso una serie di passaggi che servono ad arrestare le funzioni biologiche senza alterare l’organizzazione strutturale delle diverse componenti (fissazione), a rimuovere dalla cellula la componente acquosa (disidratazione), che risulta incompatibile con una buona osservazione al microscopio ottico, e alla sua sostituzione con il mezzo includente (inclusione). Il campione così processato viene sottoposto al taglio e successivamente alla colorazione. La colorazione permette la visualizzazione delle varie strutture presenti a livello sia tissutale che cellulare, altrimenti non distinguibili.
Perchè viene effettuato il lavaggio in NaCl 0.9%?
Si lava il campione nelle stesse condizioni fisiologiche in cui si trova nell’organismo (la quota fisiologica di NaCl che si ha normalmente nelle cellule è 0.9)
Fissazione
. La fissazione è una procedura molto delicata da cui dipende la conservazione dell’organizzazione della cellula, dei componenti tissutali e, di conseguenza, la possibilità di una loro corretta disamina. Lo scopo della fissazione è quello di uccidere rapidamente le cellule dei tessuti mediante processi chimici o fisici che, nel più breve tempo possibile, inattivano l’azione di enzimi e batteri litici al fine di evitare la disorganizzazione della cellula e del tessuto, preservando così nel tempo la morfologia originaria del tessuto o dell’organo in studio.
Disidratazione
Poiché le cellule sono formate principalmente da acqua, questa va rimossa. Si procede quindi all’immersione del tessuto in una soluzione alcolica a concentrazione crescente (miscela di acqua e alcol), a partire da etanolo al 75% fino ad arrivare ad etanolo al 100%. Questo processo deve essere graduale per non provocare il raggrinzimento delle cellule. La rimozione dell’acqua è necessaria per una buona osservazione del campione al microscopio ottico e per poter infiltrare il tessuto con la paraffina, materiale idrofobo.
Diafanizzazione
Il campione viene immerso in xilene, solvente organico miscibile sia con l’etanolo che si è sostituito all’acqua, sia con la paraffina. Poiché lo xilene è un solvente diafanizzante, a fine infiltrazione il tessuto risulterà trasparente (processo di schiarimento). Inoltre, con questo processo, vengono eliminati i lipidi.
Inclusione
Il tessuto così processato è pronto per essere infiltrato con un mezzo di inclusione che, dopo solidificazione, fornisce il supporto meccanico durante il sezionamento. Per la microscopia ottica il mezzo di inclusione utilizzato è la paraffina (cera), una miscela di idrocarburi saturi che diventa fluida se riscaldata (50-60°C), mentre solidifica a temperatura ambiente. Il campione viene immerso in paraffina fusa e, completata la fase di infiltrazione, viene lasciato solidificare a temperatura ambiente. Il campione a questo punto presenta la consistenza idonea per essere tagliato al microtomo in sezioni molto sottili.
Taglio e posizionamento
I blocchetti così preparati devono essere tagliati in sezioni di spessore opportuno per essere poi colorate e analizzate al microscopio. La scelta dello strumento di taglio dipende sia dallo spessore che si vuole ottenere che dal tipo di inclusione utilizzato. Il microtomo è uno strumento dotato di una lama e di un braccio su cui viene fissato il blocchetto di paraffina contenente il campione che, avanzando verso la lama, permette di ottenere sezioni sottili (con spessori che vanno da 5 a 110 µm) che vengono trasferite in un recipiente contenente acqua distillata per favorirne la distensione.
In seguito, le sezioni vengono raccolte, trasferite su un vetrino portaoggetti, precedentemente trattato con materiale adesivo, e fatte asciugare per garantirne una buona adesione al vetrino.
Reidratazione
Le sezioni tagliate dal microtomo saranno ovviamente intrise di paraffina che dovrà essere successivamente rimossa, attraverso un processo inverso di reidratazione, prima di essere colorato con coloranti in soluzione acquosa. Poiché nella microscopia ottica la maggior parte dei coloranti è idrosolubile, è necessario rimuovere la paraffina dal campione immergendo il vetrino nello xilene. La successiva eliminazione dello xilene, non miscibile in acqua, si ottiene immergendo le sezioni in etanolo assoluto; in un secondo tempo le sezioni vengono gradualmente idratate immergendole in una serie di alcoli a concentrazione decrescente fino ad arrivare all’acqua pura.
A questo punto le sezioni vengono immerse nel colorante scelto.
Terminata la colorazione…
Terminata la colorazione, dopo aver lavato il vetrino per allontanare il colorante in eccesso, si procede con il montaggio del vetrino. Questo procedimento consiste nell’applicare sopra le sezioni un vetrino coprioggetto, che viene fatto aderire al vetrino portaoggetti tramite una resina trasparente non miscibile in acqua avente lo stesso indice di rifrazione del portaoggetto e del coprioggetto.
