técnicas de biología celular Flashcards
Análisis morfológico
por microscopios
Microscopio óptico
microscopio óptico simple–>lupa
Microscopio óptico compuesto
fotónico campo oscuro, contraste de fases fluorescentes
Microscopio electrónico
transmisión, barrido, digital, efecto túnel o cuántico
El microscopio busca obtener
imágenes grandes y con buena resolución
Resolución
distancia mínima a la cual el equipo puede mostrar 2 puntos como entidades separadas
El ojo humano separa puntos a
0,25 mm
El microscopio óptico puede separar puntos a
0,25 micrometros
El microscopio electrónico puede separar puntos a
5 A
Cuanto más juntos estén los puntos y los vemos como puntos distintos
mayor será la resolución del instrumento
Microscopio óptico
Imagen real, invertida y aumentada
Sistema óptico
lentes oculares
Donde se posa la vista
Cada ocular aumenta en distinta cantidad: 10x, 15x, 20x
Lentes objetivos
- Están colocados en el revolver
- Tienen un sistema de amortiguación
- Un anillo coloreado indica los aumentos
- Son de 4, 10, 20, 40, 60 y 100 (inmersión) aumentos
Aumento total
aumento ocular x aumento objetivo
Poder se resolución
capacidad de distinguir separadamente 2 puntos muy cercanos entre si
Límite de resolución
distancia mínima entre 2 puntos para distinguirlos separadamente, si aumenta el poder de resolución, entonces la distancia de separación es menor
El microscopio óptico mejora
1000 veces el poder de resolución y disminuye el límite de resolución
El microscopio electrónico tiene un poder de resolución de
2 A, es decir, aumenta en un millón de veces la visión del ojo
Longitud de onda luz blanca
400-700 nm
Ultravioleta
300nm
Electrones
0,1nm (por esto la resolución de los microscopios electrónicos son muy buenas)
La apertura numérica (AN) es
la capacidad que tienen los lentes tanto del objetivo como el condensador para captar las haces que vienen de las fuentes de iluminación y hacer incidir en la muestra–>capacidad de hacer incidir la luz en la muestra
En el poder de resolución es importante la
longitud de onda que será la que incidirá sobre la muestra
El condensador permite
aumentar o disminuir la cantidad de luz que incide en la muestra
Si el condensador tiene una mayor apertura
entonces se mejora la resolución. Mientras mayor la apertura, mayor resolución de imagen al tener mayor incidencia de luz
El aceite de inmersión que se coloca sobre la muestra y evita
la refracción de la luz (conduce el 100% de los haces de luz que vienen de la fuente), así obtenemos una mejor resolución y aumento
Microscopía electrónica de transmisión
Su fuente luminosa son electrones
La diferencia con el MO es que podemos ver otras estructuras, desde una célula (longitud de onda es más pequeña, por lo que obtenemos una mayor resolución)
en la microscopia electrónica de transmisión no se usan lentes de vidrio
sino que se usan imanes que permiten conducir haces de electrones hacia la muestra
Con este microscopio encontramos regiones
electrodensas o electroclaras (depende de la cantidad de electrones que inciden sobre la muestra)
Microscopía electrónica de barrido
Da imágenes en 3D, su haz luminoso es un electrón
Tiene detectores, detectan los electrones que inciden sorbe la muestra. Se escanea la superficie y se obtienen imágenes 3D
Procesamiento histológico
Se prepara un tejido que es cortado para la obtención de secciones
Tinción hematoxilina/eosina
Células que son incoloras pueden tener contraste (se identifica el núcleo)
Los metales actúan como mordientes
su finalidad es actuar como mordientes entre el colorante y el tejido (se utiliza aluminio y hierro)
Hematoxilina
(presencia de metales). Los metales forman puente entre el colorante y el tejido por teñir. Se utiliza aluminio o hierro. Complejo hemalumbre catiónico –>RER y núcleo. Se relaciona con el ADN porque los grupos fosfatos tienen carga negativa
Eosina
da un color más rosado–>citoplasma. Se utiliza como contraste para diferenciar el citoplasma del núcleo. Tiene grupos carboxilos que son negativos y son afines con grupos básicos como las aminas en las proteínas
Células troncales embrionarias
Capacidad de reproducirse indefinidamente mientras mantengan la pluripotencialidad
Capacidad de diferenciarse en células de las 3 capas germinativas
La tinción hematoxilina eosina nos permite tener una buena definición del núcleo y citoplasma de las células
Al punto de poder determinar el linaje del que vienen
IPC
células pluripotenciales inducidas
Se puede usar para restaurar células de distintos linajes
La técnica de tinción permite conocer los distintos tipos celulares
Inmunohistoquímica e inmunofluorescencia
Se utilizan anticuerpos (tiene porción pareable (reconoce el organismo) y una porción constante)
El anticuerpo secundario (inmunohistoquímica indirecta) recibe enzimas que toman distintas tinciones y precipitan dando el color especifico a la proteína, viene con peroxidasa
Está basado en procesos inmunológicos, pero es una técnica inducida
La inmunofluorescencia directa
- Se utiliza un anticuerpo dirigido a la proteína a estudiar, este está unido a un fósforo, que permute estimular la longitud de onda
- La célula no responde, el segundo anticuerpo reacciona al químico por la enzima que tiene unida
- Utilizando filtros podemos observar determinados colores
- Las proteínas a las que se unen se encuentran fijadas. Las células están muertas
Inmunohistoquímica (IHQ)
Se inyecta IPS, se desarrollan teratomas, se aplica IHQ y se observa en el MO. Son marcadores específicos para identificar el linaje celular
Inmunofluorescencia (IF o IFI)
Florósforo de distintos colores que permiten identificar estructuras determinadas
Se utiliza MO modificado con determinados filtros
Proteína fluorescente verde (GFP)
Procede de una medusa, es natural
La molécula que se quiere observar, se pega la proteína fluorescente verde, se utiliza en muestras vivas
El anticuerpo puede reconocer distintas especies, mientras que el anticuerpo primario es solo para la especie humana
Análisis de ácidos nucleicos
- Sobreexpresión y silenciamiento de genes/edición génica
- Redacción de la polimerasa en cadena (PCR) y sus variantes
- Hibridación in situ, microarreglos y secuenciación
- Northern blot y Southern blot
Sobreexpresión de genes
busca inducir la sobreexpresión de un gen de interés o inhibir genes
1) Transducción
se incorporan genes en vectores virales (retrovirus o lentivirus). Estos virus se integran a nuestro DNA, por lo que no se pierde a medida que la célula se va dividiendo
2) Transducción adenoviral
se incorpora la información de gen en un tejido, pero este no se incorpora en el DNA, por lo que a medida que la célula se va dividiendo, esta información se va perdiendo
3) Transfección de plasmidios
plasmidios son DNA de doble hebra en forma circular, y esto se incorpora a la célula/tejido de interés, pero esta información no se va propagando, y se va perdiendo a medida que la célula se vaya dividiendo
1) Knockdown con RNA de interferencia
es un RNA corto de doble hebra que tiene forma de horquilla, la cual es complementaria a una secuencia mRNA, por lo que la presencia de una doble hebra (considerando que el RNA es una hebra simple) puede dar indicio de que algo extraño está ocurriendo, y esta doble hebra es reproducida por la proteína RISC, la cual degrada el segmento fijado de RNA
2) Knockout
se muta o insertan otros genes en determinados lugares. Funcionan como tijeras moleculares. Si cortamos y así silenciamos el gen, entonces lo que hacemos es inducir una mutación, y para eso, se crea un codón de término, por lo que la proteína modificada no se podrá traducir, ya que generará una proteína truncada.
en knockout se puede utilizar
Esta técnica se puede realizar a través de Crispr/Cas9, que es un sistema que utilizan las bacterias para deshacerse de DNA exógeno. Estas tijeras moleculares pueden cortar una región específica para I) incorporar una secuencia, II) reparar mutaciones o III) reemplazar genes alterados por uno normal
Reacción de la polimerasa en cadena (PCR)
- Una enzima DNA polimerasa que proviene de una bacteria la cual funciona a altas T°, por lo que puede estar sin desnaturalizarse hasta los 95°C
- DNA o cDNA donde se encuentra el “templado” para amplificar
- Tapón que permite trabajar en un pH óptimo
- Desoxinucleótidos que son los sustratos para la reacción que va a catalizar la polimerasa
- Partidores específicos: dan especificidad a la reacción de amplificación
- Mg+2: cofactor de la enzima
1° ciclo PCR
la T° aumenta a 95°C, se desnatura el DNA, se rompen los puentes de hidrógeno unidos a las bases nitrogenadas
en el 1° PCR las hebras se separan y al disminuir la T°
permite la unión de partidores a las secuencias específicas. La maquinaria se ubica en los extremos de la secuencia por amplificar, uno en el extremo 5’ y otro en el 3’
cuando se sube la t° de las huebras a 72°C
óptima para la catálisis de la polimerasa y se comienzan a unir los desoxinucleótidos complementarios a cada base
En un ciclo de PCR tenemos duplicados del material genético en un fragmento particular
en PCR,
Después de 20-40 ciclos, la amplificación es exponencial obteniéndose muchas copias del fragmento de interés
Para visualizar el amplificado se utiliza electroforesis
la electroforesis para observar post PCR
El gel se tiñe con un marcador intercalante de DNA que al ser estimulado con luz UV, emite luz.
También se utiliza un marcador de tamaño de pares de bases que permite estimar el tamaño del producto obtenido
PCR convencional: estima cantidades
RT-PCR (transcripción inversa + reacción de la polimerasa en cadena)
Se realiza una lisis a la célula y se extrae el RNA mediante distintos detergentes (cloroformo/fenol), luego se hace una separación por fases y se precipita usando isopropanol para obtener el RNA total (se incluyen TODOS los RNAs de la célula), también se obtiene la cDNA (DNA complementario) usando la enzima transcriptasa reversa que convierte RNA en DNA
el oligodT es
partidor para la enzima transcriptasa reversa que realiza la transcripción inversa
nos permiten identificar su la célula IPS expresa el gen
house keeping gene
Estos genes nunca pueden faltar en una célula, ya que son fundamentales para el metabolismo celular y siempre tienen que expresarse (se utiliza para cuantificación relativa)
Control negativo RT minus busca detectar
alguna contaminación del RNA con el DNA genómico
PCR en tiempo real (COVID-19)
- Altamente sensible
- Permite amplificar y cuantificar la secuencia nucleótida específica
- Usa fluoróforos que se unen a la doble hebra
- Cada vez que se usa doble hebra, fluorece
- TaqMan: secuencias específicas marcadas=sondas
Hibridación in situ fluorescente (FISH)
Se agrega una sonda a la célula, la cual es específica para ciertos tipos de proteínas, y veremos bajo microscopio de fluorescencia que va a fluorescer
DNA FISH se utiliza para detectar anomalías en la dotación genética, como una trisomía
Microarreglos
- Útil para expresión génica de varios genes
- Se hace un microarreglo de un cDNA
- Se prepara un microchip en el que hay una secuencia de DNA específico que corresponde a algun gen de interés
- Cada pocillo tiene uno de estos genes
el RNA de una célula control en los microarreglos y de una muestra se marca con
flurósforos de distintos colores u se ponen a hibridar
- Se hace un lavado y posteriormente se analiza cuál de los pocillos se expresa más y cual se reprime más
- Si el resultado de 1 gen se dispersa mucho, podría ser el gen de interés y el resultado se valida por PCR
Secuenciación de Sanger
- Se conoce exactamente la secuencia de una región
- Se hacen 4 PCRs distintos, cada uno con dideoxinucleótido (ddt)=nucleótido modificado que no puede elongar, si se coloca ese ddNT en la secuencia, no se va a ubicar uno a su lado
- Si utilizamos distintos dideoxis en la misma muestra, cada uno marcado con un color distinto, se obtienen fragmentos de distinto tamaño. De esta forma se podría reconstruir la secuencia buscada en base al tamaño de los fragmentos que quedan en cada sección del PCR
Northern blot (RNA) y southern blot (DNA)
Técnicas que permiten a través de electroforesis separar por tamaño el DNA y RNA
Estas muestras son cargadas en distintos pocillos, se realiza la electroforesis y luego se transfiere desde el gel a una membrana nitrocelulosa, y se hibrida con una sonda específica
Análisis proteínas
Western blot y ELISA
Inmunoprecipitación y sus variantes
Fraccionamiento subcelular
Pulso y caza
Detección y cuantificación relativa de proteínas
Puede ser en tejidos o células
- Primero se rompe la membrana para liberar todas las proteínas de su interior
- En la extracción de puede incluir hervir la muestra
- Se hace una sonicación que rompe todas las membranas
- Se homogeniza en un mortero con presencia de N2 líquido o un homogenizado vidrio/vidrio
- La finalidad es ir rompiendo la membrana para liberar todas las proteínas
Separación de las proteínas
Electroforesis en condiciones desnaturantes y reductoras
- Las muestras se incuban con un tampón (SDS y beta-mercaptoetanol)
-
- SDS
al agregarlo, éste adiciona cargas negativas a todas las proteínas (la carga neta ya no es un factor importante en la migración)
- Beta-mercaptoetanol
reductor de puentes de disulfuro (mantienen estructura terciaria). Solo tendremos la secuencia lineal. No afectará la forma de la proteína en la migración de un gel. Solo migrarán a partir de su tamaño en la electroforesis
Western blot
Transferencia a la membrana de nitrocelulosa
El gel poliacrilamida contiene todas las proteínas separadas por tamañose transfiere a membrana de nitrocelulosa y a continuación se puede realizar una tinción con rojo poceau
El colorante se utiliza para confirmar la transferencia se realizó correctamente
Hay presencia marcadores de peso molecular
El WB puede ayudar a detectar
proteínas específicas usando anticuerpos dirigidos contra la proteína en la membrana de nitrocelulosa
Ab primario específico
se dirige a la proteína de interés
Ab secundario
especifico contra el primario. Generalmente está conjugado con una enzima, de esta forma se puede ver sobre un film de rayos X, quimioluminiscencia o fluorescencia
Colorimétrico
el Ab secundario esta conjugado a una enzima que genera un producto coloreado
Quimioluminiscencia
se genera un producto. Se usa luminol HRP que es la peroxidasa que oxida al luminol y genera luz. Se expone a un film de rayos X o contra un detector digital de quimioluminiscencia. Se pueden ver las bandas oscuras en los lugares que la luz emite centello
Fluorescencia
el Ab puede estar conjugado a un fluoróforo
ELISA
- Determinación cuantitativa de proteínas
- Se hace una curva de cuantificación con valores ya conocidos y se compara la absorbancia de cada una en estos pocillos con la curva de calibración
- Se utiliza para detectar antígenos o Ab como el VIH
en los pocillos para ELISA se tiene
Ab que reconoce el antígeno que puede estar, por ejemplo, en el suero
- La muestra se le coloca un segundo Ab conjugado con una enzima
- Se genera una solución coloreada y la intensidad del color será directamente proporcional a la cantidad
Evaluación de asociaciones proteicas
Se determina si las proteínas están formando algún complejo
- La mezcla se homogeniza con un detergente suave, ya que se quiere mantener la interacción proteína-proteína
- Se incuba la muestra con Ab conjugado con esferas de agarosa, las cuales son pesadas, por lo que el Ab al reconocer el antígeno y ser puesto en una centrifugadora, el complejo Ab-antígeno/complejo va a precipitar
- Luego se lava el precipitado, resuspende y se corre en un gel de poliacrilamida, luego se hace un WB usando un Ab distinto a la usada en la precipitación
EMSA
cambio de movilidad electroforética si hay asociaciones proteicas
Pull down
para purificar proteínas de fusión que se quieren sobreexpresar
FRET
similar al sistema en que se usa un fluoróforo con un apagador. “muy cerca”: la fluorescencia se apaga; “muy separado”: no hay apagamiento
Fluoróforo al ser estimulado
emite una longitud de onda que va a estimular a otro fluoróforo
Fraccionamiento subcelular
- Tejido o cultivo celular
- Se hace homogenización y se rómpela membrana para obtener los organelos del interior del homogenizado
- Sedimentación diferencial: se centrifuga la muestra a distintas velocidades
velocidades para el fraccionamiento
Baja velocidad: precipitan los más pesados (núcleo)
Aumento la velocidad: precipitan organelos medianos (mitocondrias)
Mayor velocidad: precipitan organelos más pequeños (microsomas o vesículas)
Máxima velocidad: obtenemos ribosomas, virus, lo más pequeño
Fraccionamiento celular homogenizado
Homogenizado obtenido se coloca sobre una gradiente de sacarosa
Gradiente compuesta por soluciones de sacarosa a distintas densidades (más densas en el fondo del tubo)
Si se centrifuga, los organelos se van a separar y quedarán en sus densidades correspondientes
Ensayo de pulso y caza
Importante para el estudio de la ruta secretora/exocítica de la célula
Células se incuban con un precursor radioactivo, L-leucina-H, que es un aminoácido marcado radioactivamente
Las células se incuban por 3 min con el aminoácido marcado y se lava para remover todo lo que no fue incorporado en las células, luego se detecta la radioactividad incorporada en las células en el tiempo
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