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BIOLOGÍA CELULAR > técnicas de biología celular > Flashcards

técnicas de biología celular Flashcards

1
Q

Análisis morfológico

A

por microscopios

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2
Q

Microscopio óptico

A

microscopio óptico simple–>lupa

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3
Q

Microscopio óptico compuesto

A

fotónico campo oscuro, contraste de fases fluorescentes

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4
Q

Microscopio electrónico

A

transmisión, barrido, digital, efecto túnel o cuántico

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5
Q

El microscopio busca obtener

A

imágenes grandes y con buena resolución

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6
Q

Resolución

A

distancia mínima a la cual el equipo puede mostrar 2 puntos como entidades separadas

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7
Q

El ojo humano separa puntos a

A

0,25 mm

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8
Q

El microscopio óptico puede separar puntos a

A

0,25 micrometros

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9
Q

El microscopio electrónico puede separar puntos a

A

5 A

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10
Q

Cuanto más juntos estén los puntos y los vemos como puntos distintos

A

mayor será la resolución del instrumento

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11
Q

Microscopio óptico

A

Imagen real, invertida y aumentada

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12
Q

Sistema óptico

A

lentes oculares
Donde se posa la vista
Cada ocular aumenta en distinta cantidad: 10x, 15x, 20x

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13
Q

Lentes objetivos

A
  • Están colocados en el revolver
  • Tienen un sistema de amortiguación
  • Un anillo coloreado indica los aumentos
  • Son de 4, 10, 20, 40, 60 y 100 (inmersión) aumentos
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14
Q

Aumento total

A

aumento ocular x aumento objetivo

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15
Q

Poder se resolución

A

capacidad de distinguir separadamente 2 puntos muy cercanos entre si

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16
Q

Límite de resolución

A

distancia mínima entre 2 puntos para distinguirlos separadamente, si aumenta el poder de resolución, entonces la distancia de separación es menor

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17
Q

El microscopio óptico mejora

A

1000 veces el poder de resolución y disminuye el límite de resolución

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18
Q

El microscopio electrónico tiene un poder de resolución de

A

2 A, es decir, aumenta en un millón de veces la visión del ojo

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19
Q

Longitud de onda luz blanca

A

400-700 nm

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20
Q

Ultravioleta

A

300nm

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21
Q

Electrones

A

0,1nm (por esto la resolución de los microscopios electrónicos son muy buenas)

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22
Q

La apertura numérica (AN) es

A

la capacidad que tienen los lentes tanto del objetivo como el condensador para captar las haces que vienen de las fuentes de iluminación y hacer incidir en la muestra–>capacidad de hacer incidir la luz en la muestra

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23
Q

En el poder de resolución es importante la

A

longitud de onda que será la que incidirá sobre la muestra

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24
Q

El condensador permite

A

aumentar o disminuir la cantidad de luz que incide en la muestra

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25
Q

Si el condensador tiene una mayor apertura

A

entonces se mejora la resolución. Mientras mayor la apertura, mayor resolución de imagen al tener mayor incidencia de luz

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26
Q

El aceite de inmersión que se coloca sobre la muestra y evita

A

la refracción de la luz (conduce el 100% de los haces de luz que vienen de la fuente), así obtenemos una mejor resolución y aumento

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27
Q

Microscopía electrónica de transmisión

A

Su fuente luminosa son electrones
La diferencia con el MO es que podemos ver otras estructuras, desde una célula (longitud de onda es más pequeña, por lo que obtenemos una mayor resolución)

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28
Q

en la microscopia electrónica de transmisión no se usan lentes de vidrio

A

sino que se usan imanes que permiten conducir haces de electrones hacia la muestra

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29
Q

Con este microscopio encontramos regiones

A

electrodensas o electroclaras (depende de la cantidad de electrones que inciden sobre la muestra)

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30
Q

Microscopía electrónica de barrido

A

Da imágenes en 3D, su haz luminoso es un electrón
Tiene detectores, detectan los electrones que inciden sorbe la muestra. Se escanea la superficie y se obtienen imágenes 3D

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31
Q

Procesamiento histológico

A

Se prepara un tejido que es cortado para la obtención de secciones
Tinción hematoxilina/eosina
Células que son incoloras pueden tener contraste (se identifica el núcleo)

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32
Q

Los metales actúan como mordientes

A

su finalidad es actuar como mordientes entre el colorante y el tejido (se utiliza aluminio y hierro)

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33
Q

Hematoxilina

A

(presencia de metales). Los metales forman puente entre el colorante y el tejido por teñir. Se utiliza aluminio o hierro. Complejo hemalumbre catiónico –>RER y núcleo. Se relaciona con el ADN porque los grupos fosfatos tienen carga negativa

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34
Q

Eosina

A

da un color más rosado–>citoplasma. Se utiliza como contraste para diferenciar el citoplasma del núcleo. Tiene grupos carboxilos que son negativos y son afines con grupos básicos como las aminas en las proteínas

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35
Q

Células troncales embrionarias

A

Capacidad de reproducirse indefinidamente mientras mantengan la pluripotencialidad
Capacidad de diferenciarse en células de las 3 capas germinativas

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36
Q

La tinción hematoxilina eosina nos permite tener una buena definición del núcleo y citoplasma de las células

A

Al punto de poder determinar el linaje del que vienen

37
Q

IPC

A

células pluripotenciales inducidas
Se puede usar para restaurar células de distintos linajes
La técnica de tinción permite conocer los distintos tipos celulares

38
Q

Inmunohistoquímica e inmunofluorescencia

A

Se utilizan anticuerpos (tiene porción pareable (reconoce el organismo) y una porción constante)
El anticuerpo secundario (inmunohistoquímica indirecta) recibe enzimas que toman distintas tinciones y precipitan dando el color especifico a la proteína, viene con peroxidasa
Está basado en procesos inmunológicos, pero es una técnica inducida

39
Q

La inmunofluorescencia directa

A
  • Se utiliza un anticuerpo dirigido a la proteína a estudiar, este está unido a un fósforo, que permute estimular la longitud de onda
  • La célula no responde, el segundo anticuerpo reacciona al químico por la enzima que tiene unida
  • Utilizando filtros podemos observar determinados colores
  • Las proteínas a las que se unen se encuentran fijadas. Las células están muertas
40
Q

Inmunohistoquímica (IHQ)

A

Se inyecta IPS, se desarrollan teratomas, se aplica IHQ y se observa en el MO. Son marcadores específicos para identificar el linaje celular

41
Q

Inmunofluorescencia (IF o IFI)

A

Florósforo de distintos colores que permiten identificar estructuras determinadas
Se utiliza MO modificado con determinados filtros

42
Q

Proteína fluorescente verde (GFP)

A

Procede de una medusa, es natural
La molécula que se quiere observar, se pega la proteína fluorescente verde, se utiliza en muestras vivas
El anticuerpo puede reconocer distintas especies, mientras que el anticuerpo primario es solo para la especie humana

43
Q

Análisis de ácidos nucleicos

A
  • Sobreexpresión y silenciamiento de genes/edición génica
  • Redacción de la polimerasa en cadena (PCR) y sus variantes
  • Hibridación in situ, microarreglos y secuenciación
  • Northern blot y Southern blot
44
Q

Sobreexpresión de genes

A

busca inducir la sobreexpresión de un gen de interés o inhibir genes

45
Q

1) Transducción

A

se incorporan genes en vectores virales (retrovirus o lentivirus). Estos virus se integran a nuestro DNA, por lo que no se pierde a medida que la célula se va dividiendo

46
Q

2) Transducción adenoviral

A

se incorpora la información de gen en un tejido, pero este no se incorpora en el DNA, por lo que a medida que la célula se va dividiendo, esta información se va perdiendo

47
Q

3) Transfección de plasmidios

A

plasmidios son DNA de doble hebra en forma circular, y esto se incorpora a la célula/tejido de interés, pero esta información no se va propagando, y se va perdiendo a medida que la célula se vaya dividiendo

48
Q

1) Knockdown con RNA de interferencia

A

es un RNA corto de doble hebra que tiene forma de horquilla, la cual es complementaria a una secuencia mRNA, por lo que la presencia de una doble hebra (considerando que el RNA es una hebra simple) puede dar indicio de que algo extraño está ocurriendo, y esta doble hebra es reproducida por la proteína RISC, la cual degrada el segmento fijado de RNA

49
Q

2) Knockout

A

se muta o insertan otros genes en determinados lugares. Funcionan como tijeras moleculares. Si cortamos y así silenciamos el gen, entonces lo que hacemos es inducir una mutación, y para eso, se crea un codón de término, por lo que la proteína modificada no se podrá traducir, ya que generará una proteína truncada.

50
Q

en knockout se puede utilizar

A

Esta técnica se puede realizar a través de Crispr/Cas9, que es un sistema que utilizan las bacterias para deshacerse de DNA exógeno. Estas tijeras moleculares pueden cortar una región específica para I) incorporar una secuencia, II) reparar mutaciones o III) reemplazar genes alterados por uno normal

51
Q

Reacción de la polimerasa en cadena (PCR)

A
  • Una enzima DNA polimerasa que proviene de una bacteria la cual funciona a altas T°, por lo que puede estar sin desnaturalizarse hasta los 95°C
  • DNA o cDNA donde se encuentra el “templado” para amplificar
  • Tapón que permite trabajar en un pH óptimo
  • Desoxinucleótidos que son los sustratos para la reacción que va a catalizar la polimerasa
  • Partidores específicos: dan especificidad a la reacción de amplificación
  • Mg+2: cofactor de la enzima
52
Q

1° ciclo PCR

A

la T° aumenta a 95°C, se desnatura el DNA, se rompen los puentes de hidrógeno unidos a las bases nitrogenadas

53
Q

en el 1° PCR las hebras se separan y al disminuir la T°

A

permite la unión de partidores a las secuencias específicas. La maquinaria se ubica en los extremos de la secuencia por amplificar, uno en el extremo 5’ y otro en el 3’

54
Q

cuando se sube la t° de las huebras a 72°C

A

óptima para la catálisis de la polimerasa y se comienzan a unir los desoxinucleótidos complementarios a cada base
En un ciclo de PCR tenemos duplicados del material genético en un fragmento particular

55
Q

en PCR,

A

Después de 20-40 ciclos, la amplificación es exponencial obteniéndose muchas copias del fragmento de interés
Para visualizar el amplificado se utiliza electroforesis

56
Q

la electroforesis para observar post PCR

A

El gel se tiñe con un marcador intercalante de DNA que al ser estimulado con luz UV, emite luz.
También se utiliza un marcador de tamaño de pares de bases que permite estimar el tamaño del producto obtenido
PCR convencional: estima cantidades

57
Q

RT-PCR (transcripción inversa + reacción de la polimerasa en cadena)

A

Se realiza una lisis a la célula y se extrae el RNA mediante distintos detergentes (cloroformo/fenol), luego se hace una separación por fases y se precipita usando isopropanol para obtener el RNA total (se incluyen TODOS los RNAs de la célula), también se obtiene la cDNA (DNA complementario) usando la enzima transcriptasa reversa que convierte RNA en DNA

58
Q

el oligodT es

A

partidor para la enzima transcriptasa reversa que realiza la transcripción inversa
nos permiten identificar su la célula IPS expresa el gen

59
Q

house keeping gene

A

Estos genes nunca pueden faltar en una célula, ya que son fundamentales para el metabolismo celular y siempre tienen que expresarse (se utiliza para cuantificación relativa)

60
Q

Control negativo RT minus busca detectar

A

alguna contaminación del RNA con el DNA genómico

61
Q

PCR en tiempo real (COVID-19)

A
  • Altamente sensible
  • Permite amplificar y cuantificar la secuencia nucleótida específica
  • Usa fluoróforos que se unen a la doble hebra
  • Cada vez que se usa doble hebra, fluorece
  • TaqMan: secuencias específicas marcadas=sondas
62
Q

Hibridación in situ fluorescente (FISH)

A

Se agrega una sonda a la célula, la cual es específica para ciertos tipos de proteínas, y veremos bajo microscopio de fluorescencia que va a fluorescer
DNA FISH se utiliza para detectar anomalías en la dotación genética, como una trisomía

63
Q

Microarreglos

A
  • Útil para expresión génica de varios genes
  • Se hace un microarreglo de un cDNA
  • Se prepara un microchip en el que hay una secuencia de DNA específico que corresponde a algun gen de interés
  • Cada pocillo tiene uno de estos genes
64
Q

el RNA de una célula control en los microarreglos y de una muestra se marca con

A

flurósforos de distintos colores u se ponen a hibridar

  • Se hace un lavado y posteriormente se analiza cuál de los pocillos se expresa más y cual se reprime más
  • Si el resultado de 1 gen se dispersa mucho, podría ser el gen de interés y el resultado se valida por PCR
65
Q

Secuenciación de Sanger

A
  • Se conoce exactamente la secuencia de una región
  • Se hacen 4 PCRs distintos, cada uno con dideoxinucleótido (ddt)=nucleótido modificado que no puede elongar, si se coloca ese ddNT en la secuencia, no se va a ubicar uno a su lado
  • Si utilizamos distintos dideoxis en la misma muestra, cada uno marcado con un color distinto, se obtienen fragmentos de distinto tamaño. De esta forma se podría reconstruir la secuencia buscada en base al tamaño de los fragmentos que quedan en cada sección del PCR
66
Q

Northern blot (RNA) y southern blot (DNA)

A

Técnicas que permiten a través de electroforesis separar por tamaño el DNA y RNA
Estas muestras son cargadas en distintos pocillos, se realiza la electroforesis y luego se transfiere desde el gel a una membrana nitrocelulosa, y se hibrida con una sonda específica

67
Q

Análisis proteínas

A

Western blot y ELISA
Inmunoprecipitación y sus variantes
Fraccionamiento subcelular
Pulso y caza

68
Q

Detección y cuantificación relativa de proteínas

A

Puede ser en tejidos o células

  • Primero se rompe la membrana para liberar todas las proteínas de su interior
  • En la extracción de puede incluir hervir la muestra
  • Se hace una sonicación que rompe todas las membranas
  • Se homogeniza en un mortero con presencia de N2 líquido o un homogenizado vidrio/vidrio
  • La finalidad es ir rompiendo la membrana para liberar todas las proteínas
69
Q

Separación de las proteínas

A

Electroforesis en condiciones desnaturantes y reductoras
- Las muestras se incuban con un tampón (SDS y beta-mercaptoetanol)
-

70
Q
  • SDS
A

al agregarlo, éste adiciona cargas negativas a todas las proteínas (la carga neta ya no es un factor importante en la migración)

71
Q
  • Beta-mercaptoetanol
A

reductor de puentes de disulfuro (mantienen estructura terciaria). Solo tendremos la secuencia lineal. No afectará la forma de la proteína en la migración de un gel. Solo migrarán a partir de su tamaño en la electroforesis

72
Q

Western blot

A

Transferencia a la membrana de nitrocelulosa
El gel poliacrilamida contiene todas las proteínas separadas por tamañose transfiere a membrana de nitrocelulosa y a continuación se puede realizar una tinción con rojo poceau
El colorante se utiliza para confirmar la transferencia se realizó correctamente
Hay presencia marcadores de peso molecular

73
Q

El WB puede ayudar a detectar

A

proteínas específicas usando anticuerpos dirigidos contra la proteína en la membrana de nitrocelulosa

74
Q

Ab primario específico

A

se dirige a la proteína de interés

75
Q

Ab secundario

A

especifico contra el primario. Generalmente está conjugado con una enzima, de esta forma se puede ver sobre un film de rayos X, quimioluminiscencia o fluorescencia

76
Q

Colorimétrico

A

el Ab secundario esta conjugado a una enzima que genera un producto coloreado

77
Q

Quimioluminiscencia

A

se genera un producto. Se usa luminol HRP que es la peroxidasa que oxida al luminol y genera luz. Se expone a un film de rayos X o contra un detector digital de quimioluminiscencia. Se pueden ver las bandas oscuras en los lugares que la luz emite centello

78
Q

Fluorescencia

A

el Ab puede estar conjugado a un fluoróforo

79
Q

ELISA

A
  • Determinación cuantitativa de proteínas
  • Se hace una curva de cuantificación con valores ya conocidos y se compara la absorbancia de cada una en estos pocillos con la curva de calibración
  • Se utiliza para detectar antígenos o Ab como el VIH
80
Q

en los pocillos para ELISA se tiene

A

Ab que reconoce el antígeno que puede estar, por ejemplo, en el suero

  • La muestra se le coloca un segundo Ab conjugado con una enzima
  • Se genera una solución coloreada y la intensidad del color será directamente proporcional a la cantidad
81
Q

Evaluación de asociaciones proteicas

A

Se determina si las proteínas están formando algún complejo

  • La mezcla se homogeniza con un detergente suave, ya que se quiere mantener la interacción proteína-proteína
  • Se incuba la muestra con Ab conjugado con esferas de agarosa, las cuales son pesadas, por lo que el Ab al reconocer el antígeno y ser puesto en una centrifugadora, el complejo Ab-antígeno/complejo va a precipitar
  • Luego se lava el precipitado, resuspende y se corre en un gel de poliacrilamida, luego se hace un WB usando un Ab distinto a la usada en la precipitación
82
Q

EMSA

A

cambio de movilidad electroforética si hay asociaciones proteicas

83
Q

Pull down

A

para purificar proteínas de fusión que se quieren sobreexpresar

84
Q

FRET

A

similar al sistema en que se usa un fluoróforo con un apagador. “muy cerca”: la fluorescencia se apaga; “muy separado”: no hay apagamiento

85
Q

Fluoróforo al ser estimulado

A

emite una longitud de onda que va a estimular a otro fluoróforo

86
Q

Fraccionamiento subcelular

A
  • Tejido o cultivo celular
  • Se hace homogenización y se rómpela membrana para obtener los organelos del interior del homogenizado
  • Sedimentación diferencial: se centrifuga la muestra a distintas velocidades
87
Q

velocidades para el fraccionamiento

A

Baja velocidad: precipitan los más pesados (núcleo)
Aumento la velocidad: precipitan organelos medianos (mitocondrias)
Mayor velocidad: precipitan organelos más pequeños (microsomas o vesículas)
Máxima velocidad: obtenemos ribosomas, virus, lo más pequeño

88
Q

Fraccionamiento celular homogenizado

A

Homogenizado obtenido se coloca sobre una gradiente de sacarosa
Gradiente compuesta por soluciones de sacarosa a distintas densidades (más densas en el fondo del tubo)
Si se centrifuga, los organelos se van a separar y quedarán en sus densidades correspondientes

89
Q

Ensayo de pulso y caza

A

Importante para el estudio de la ruta secretora/exocítica de la célula

Células se incuban con un precursor radioactivo, L-leucina-H, que es un aminoácido marcado radioactivamente

Las células se incuban por 3 min con el aminoácido marcado y se lava para remover todo lo que no fue incorporado en las células, luego se detecta la radioactividad incorporada en las células en el tiempo
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