Spectrométrie de masse Flashcards

1
Q

Quel est le principe général d’un spectromètre de masse?

A
  1. L’échantillon est introduit dans le MS par l’interface
    ● Échantillon liquide ou gazeux
  2. Les substances sont ionisées dans la source
    ● Sous vide ou à pression atmosphérique
  3. Les ions produits sont séparés selon leur ratio masse sur charge (m/z)
  4. Les ions sont détectés et quantifiés
  5. Les données sont analysées par ordinateur
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2
Q

Est-ce que le vide est important pour un MS?

A

oui

L’intérieur du spectromètre de masse doit être sous vide pour permettre aux ions de se rendre au détecteur sans collision avec des gaz

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3
Q

Quels sont les 2 types de vides? Donnez un exemple d’une pompe par type

A

-Vide primaire (« Rough Vac »)
● Environ 1-2 Torr
● Pompes rotative à l’huile
● « Scroll pump » sans huile

Vide secondaire (par l’appareil)
● 10-3 à 10-6 Torr
● Pompes turbomoléculaires
● Pompes à diffusion

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4
Q

Est-ce que seulement les ions peuvent être séparés par spectrométrie de masse?

A

Oui

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5
Q

Qu’est-ce qu’une masse isotopique, mono-isotopique et atomique relative?

A

-Masse isotopique (masse exacte)
● Masse exacte des atomes
● Exprimée en unité de masse atomique unifiée (uma)

-Masse mono-isotopique
● Atome: masse exacte de l’isotope le plus abondant (ex: C12)
● Molécule: somme des masses mono-isotopiques de tous les atomes

-Masse atomique relative
● Masse du tableau périodique
● = masse isotopique x abondance relative des isotopes

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6
Q

Est-ce que les isotopes naturels ont les mêmes proportions?

A

Non, au contraire

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7
Q

Qu’est-ce qu’un spectre de masse?

A

-Spectre de masse
● graphique de l’intensité en fonction du ratio masse/charge
● Représente « l’empreinte » de la molécule (Ion moléculaire + fragments)
○ ion moléculaire = le plus lourd dans notre spectre de masse (molécule
d’intérêt)
○ les autres c’est des fragments (perte de proton)

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8
Q

Qu’est-ce que le pic de base, le pic moléculaire et le patron isotopique?

A

-Pic de base (« base peak »)
● Pic le plus intense dans le spectre de masse ⇒ toujours normalisé à 100%
● Par convention, l’intensité des autres pics et normalisée par rapport à ce pic

-Pic moléculaire
● Pic correspondant à l’ion moléculaire (M+)
● parfois pic moléculaire = pic de base, mais pas toujours le cas

Patron isotopique
-caractéristique de la distribution naturelle des isotopes
-Exemple Chlore
● 35Cl = 100%
● 37Cl = 32% (de la hauteur du pic le + intense)

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9
Q

Comment faire pour déterminer le nombre de carbone dans un patron isotopique?

A

-Pour 100 molécules de 12C, on a 1,08 molécules de 13C
-On peut estimer le nombre de carbone d’une molécule à l’aide du patron isotopique du carbone
● Carbone 12 = 1.00
● Carbone 13 = 1.08

-prendre la hauteur du pic M+1 et /1.08 = nombre de C
● à 120 : plus de 13C donc le pic de base est 13C

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10
Q

Comment déterminer la résolution entre deux pics?

A

-On peut calculer la résolution entre deux pics avec l’équation: R = m / Δm
● m = masse moyenne des deux pics
● Δm = largeur des pics (à 5 ou 50% hauteur, important si on veut comparer)
● plus m est grande, plus Δm est grand

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11
Q

Quel type d’ionisation allons-nous utiliser pour GC et HPLC?

A

-En GC, l’échantillon est déjà volatilisé (dans l’injecteur du GC)
● Modes d’ionisation:
○ Impact électronique (EI – Electron Impact)
○ Ionisation chimique (CI – Chemical
Ionisation)

-En HPLC, l’échantillon doit être volatilisé avant de pénétrer dans
le MS
● Mode d’ionisation:
○ ESI (Electrospray)
○ APCI (Atmospheric Pressure Chemical
Ionisation)
○ APPI (Atmospheric Pressure
Photo-Ionisation)

MALDI

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12
Q

Mettre en ordre croissant la force de fragmentation des différentes méthodes ionisations.

A

○ 1.MALDI (moins forte en terme de
fragmentation, + de molécule non fragmentée)
○ 2.ESI
○ 3.APCI/APPI
○ 4.CI (surtout GC-MS)
○ 5.EI (presque tout est fragmenté)

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13
Q

Comment fonctionne le principe de l’impact électronique?

A

● Les substances passent dans un faisceau dense d’électrons à haute énergie (standardisée à
70 eV)
● Il y a perte d’un électron et augmentation de l’énergie interne (énergie excédentaire)
● L’énergie excédentaire est distribuée de façon uniforme dans la molécule (en énergie
vibrationnelle)
● Certains liens vont se dissocier si l’énergie excédentaire est suffisante (les liens les plus faibles brisent en premier)

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14
Q

Est-ce que l’impact électronique ionise en mode négatif?

A

Non

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15
Q

Nomme un avantage et inconvénient de l’impact électronique

A

Désavantages :
-Réarrangements moléculaires possibles (inconvénient: les fragments peuvent se combiner)

Avantages : Patrons de fragmentation très reproductibles (seulement en GC-MS)

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16
Q

Principe de l’ionisation chimique?

A

-Production d’ions par collision avec des molécules de gaz réactif/gaz ionisé
● La source contient un gaz (pression 0,1 – 1 Torr, petite quantité de gaz)
● Le gaz est « activé » par un faisceau d’électrons énergétiques
● Les analytes entrent en collision avec le gaz réactif et il y a transfert de protons ou
d’électrons
● formation de molécule MH+

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17
Q

Qu’est-ce qui affecte la réaction d’ionisation en ionisation chimique?

A

● Nature du gaz réactif (méthane, isobutane…)
● La pression du gaz dans la source

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18
Q

Qu’est-ce qu’on utilise pour avoir des fragments ou des molécules ionisés ?Impact électronique vs ionisation chimique

A

● impact électronique pour avoir fragment (+ rough)
● faire ionisation chimique pour avoir molécule (-rough)

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19
Q

Quel est le mécanisme de l’électrospray?

A

● *nébulisateur placé de façon orthogonal à l’entrée dans MS (pour éviter entrée des goutte non évaporée)
● La phase mobile contenant les analytes passe dans une aiguille à laquelle un fort potentiel est appliqué (4-5 kV)
● Du gaz est aussi appliqué de façon axiale pour aider à la nébulisation (tailor cone)
● De fines gouttelettes sont formées et possèdent une charge à leur surface
● Les gouttelettes s’évaporent progressivement dans la source chauffée
● Lorsque la répulsion des charges excède la force de tension de surface, les gouttelettes éclatent et les charges sont distribuées aux analytes en fonction de leur affinité protonique

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20
Q

Ionisation positive ou négative en ESI?

A

Les deux

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21
Q

Dans quelle situation c’est utile d’avoir des ions avec multiple charge par ESI?

A

-Idéal pour les haut poids moléculaires (multiples charges): protéines et peptides

-ex: spectre de la myoglobine (gros pic à 16 000, mais décorticé entre à plus petit m/z,
même patron mais juste z qui change, possible de faire une dé-convolution et
reconstruction le spectre réel

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22
Q

Pour quelle type de molécules la méthode ESI est faite?

A

Surtout pour les analytes capables de former des ions en solution donc, molécules polaires ou chargées.

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23
Q

Nomme une interférence très importante en ESI et décrit cette interférence

A

-Suppression d’ions

-compétition pour la charge (ex: sang, avec phospholipide)
-Réduction de l’efficacité d’ionisation d’un analyte d’intérêt.
● Perte de signal au détecteur
● Précision et exactitude peuvent être compromises (et quantification reproductible)

-Sources ESI plus affectées que APCI
● Suppression en phase liquide vs phase gazeuse
● + sujet pour les électrospray car échantillon liquide

24
Q

Qu’est-ce qui joue un rôle important dans le MS en ESI?

A

-Le débit joue un rôle important dans la réponse MS
● Capacité d’évaporation
● Idéal: débit < 1 mL/min (voir 0,5 mL/min) et %B élevé (+ solvant = s’évapore mieux que l’eau)
● débit lent fit bien avec UPLC

25
Q

Quel est le principe de l’APCI? Est-ce que cela peut former des ions multiplement chargés?

A

-Très similaire à ESI, sauf que l’ionisation est effectuée par une autre aiguille (« Corona Discharge »)
● on ne met pas la charge sur l’aiguille
● l’ionisation n’est pas fait sur la molécule directement mais sur le gaz en premier et ensuite transféré sur la molécule d’intérêt

-il s’agit d’une ionisation chimique

-Ne forme pas d’ions multiplement chargés

26
Q

Qu’est-ce que l’APPI?

A

Atmospheric Pressure Photo-Ionisation)

-Comme APCI, mais utilise un faisceau de photons pour ioniser les analytes (directement ou avec dopants)

27
Q

Quels types de molécules pour APPI, APCI et ESI?

A

-Electrospray: bon pour molécule polaire ou très polaire,
avantage :molécule haut poids moléculaire

-les 2 autres c’est juste du simple charge donc molécule + petites, polaire ou non

28
Q

Quel est le mécanisme du MALDI et il est idéal pour l’utilisation de quel MS?

A

-Mécanisme:
● Les analytes sont mélangés à une matrice qui est placé sur un plaque pour introduire dans la source
● Un laser pulsé émet une lumière intense que la matrice absorbe
● La matrice se désorbe de la plaque et entraîne les analytes
● Les analytes sont ionisés

-Produit des pulsations d’ions : Idéal pour analyse par TOF (time of light) car fonctionne aussi par pulsation
● TOF pas le best pour LC car liquide arrive toujour en continu

29
Q

Qu’est-ce qui cause la suppression d’ions et qu’est-ce qui peut causer la suppression d’ions?

A

-La suppression ionique est engendrée par une élution simultanée de l’analyte d’intérêt avec des molécules contaminantes.

-ce qui peut causer suppression d’ions:
● Sels non volatils
● Agents de pairage ionique (agent pour rendre molécule + soluble)
● Métabolites endogènes (ex: phospholipide sanguin)
● Médicaments
● Composantes de la matrice biologique

30
Q

Quels sont les mécanismes de la suppression d’ions?

A
  1. Précipitation ou co-précipitation (sels peuvent se former et précipiter, le gros se passe ici surtout en ESI)
  2. Évaporation incomplète (entraîne signal incomplet)
  3. Éjection de la gouttelette sous forme neutre (molécule ne capte pas la charge)
  4. Neutralisation ou transfert de charge en phase gazeuse (molécule capte charge en gouttelette, s’évapore et se fait voler son proton par autre molécule)
31
Q

Comment mettre en évidence la suppression d’ions?

A

-Ajouts dosés (spiker l’analyte dans des extraits de matrice)
● Façon de faire:
○ 1-prendre matrice (ex: sang total)
○ 2-extraire matrice
○ 3-faire même chose avec eau avec eau
○ 4-spiker la même quantité d’analyte dans ces 2matrices et comparer
● Comparaison des réponses MS pour les analytes ajoutés dans des extraits de matrice ou des extraits d’eau
● Mesure de l’ampleur de la suppression
● ex: suppression d’environ 50% dans le sang total p/r à eau

-Infusion post-colonne (infuser l’analyte de façon constante après la chromato)
● Façon de faire:
○ 1. Infusion constante de l’analyte d’intérêt
○ 2. Injection d’un extrait d’échantillon ne
contenant pas l’analyte
● Localisation temporelle de la suppression d’ions
● ex: on voit qu’il y a une suppression d’ion au debut

32
Q

Comment diminuer des effets de suppression?

A

-Pré-traiter les échantillons pour obtenir des extraits plus propres
● Extraction liquide-liquide ou extraction en phase solide (+ propre)
● ↑ Complexité et ↑ Coût (matériel / technique)

-Optimiser la chromatographie pour séparer l’analyte des régions de suppression ionique
● faire sortir l’analyte dans une autre région où il n’y a pas de suppression ionique
● ↑ Temps d’analyse

-Compenser la suppression ionique en utilisant l’analyte deutéré comme standard interne
● Disponibilité limitée et coût élevé
● avantage: meilleure précision pour standard deutéré

-Note: possible de conditionner dans sang total
● s’assurer que notre suppression ionique est constante et reproductible selon la matrice sanguine (ex: sérum)
● ex: matrice urinaire = très variable en composantes donc peut amener plus de
suppression ionique variable (pas possible de compenser en calibrant dans urique, trop variable)
● on pourrait prendre le standard interne deutéré dans ce cas-là

33
Q

Nomme 4 types de spectromètre de masse pour mesure des masses

A

● Quadripôles
● Trappes ioniques
● Temps d’envol
● Secteurs électromagnétiques

34
Q

Comment faire pour avoir 2 mesures de masse pour la même molécule?

A

spectrométrie de masse en tandem

Permet d’avoir :
-Ions parents
-Ions produits (fragments)

35
Q

Qu’est-ce qu’un quadrupôle? Quel est le principe?

A
  • « filtres de masse » qui laissent passer de façon séquentielle uniquement les ions avec un m/z choisi
    -Sélection des masses basée sur la stabilisation de la trajectoire des ions entres les 4 pôles

-Principe:
● ions pénètre dans les 4 pôles et sa trajectoire = affectée par charge et masse
● résonant : capable de passer
● non résonnant: se ramasse dans le vide

36
Q

Quels sont les types de modes de mesures de MS?

A

-Scan
● Analyse d’une intervalle de masse (ex: 35 – 400)

-SIM (Selected Ion Monitoring)
● Analyse d’une seule masse qui transitionne ou d’un ensemble défini de masses

-MRM (Multiple Reaction Monitoring)
● Analyse d’une transition de masse (parent → fragment) ou d’un ensemble défini de transitions de masse

-TIC (Total Ion Chromatogram)
● Chromatogramme représentant la somme de tous les ions mesurés par la MS
(somme/ensemble de tous les ions)
● Soit d’un scan, d’une analyse SIM ou d’une analyse MRM

37
Q

Comment analyser des fragments avec un quadripole?

A

-Analyse de fragments avec un quadripôle
● La source d’ionisation est à pression atmosphérique
● Après la source, il y a un région à pression réduite (ex: 2 Torr) que les ions
doivent franchir avant d’accéder au quadripôle
● Les ions sont entraînés par une différence de potentiel
● Si on augmente suffisamment ce voltage, l’ion moléculaire est fragmenté
○ on applique une différence de potentiel pour que le flot des ions se fasse, on tire les ions + qui traverse le gaz rideau (gaz axial)
○ si on tire trop, ça fait des fragment, donc aussi façon de faire des fragments

-augmentation de la différence de potentiel qui cause des fragmentation
● en haut (+ grand voltage): seulement des
fragments de fragments
● milieu: on commence à voir des fragments
● en bas (+ faible voltage): seulement ion
moléculaire

38
Q

avantages du QQQ? Quel est son set up?

A

Avantages :
● Meilleure spécificité (meilleur ratio signal/bruit)
● Meilleure sensibilité

Set-up:
● source d’ions
● Q#1 permet de mesurer molécule non fragmenté
● Q#2 sert de cellules de collisions pour briser les molécules en fragments
● Q#3 mesure la masse des fragments produits
● détecteur

39
Q

Expliquez les 4 modes d’opération du QQQ?

A

● scan
○ 2 et 3 = pas d’E pour juste avoir effet de scan (Q1)

● SIM
○ mesurer les ions spécifiques en provenant de Q1 qui laisse passer une
seule masse

● product ion scan
○ Q1 laisse passer une seule masse
○ faire collision en Q2 pour fragmenter
○ permet d’identifier l’ion a suivre en MRM

● MRM
○ 1.Q1 laisse passer une seule masse
○ 2.faire collision en Q2 pour fragmenter
○ 3.Q3 laisser passer uniquement le fragment d’intérêt (qualifier)
○ Très grande spécificité (Nécessité de la chromatographie?)
○ On peut aussi suivre plusieurs transitions pour le même produit
○ « Quantifier » :
○ « Qualifier »: permet de confirmer qu’on a la bonne molécule avec les
ratio
○ limites du qualifier
■ temps pour mesurer cette transition (ex: mélange de bcp de
molécules et qualifier pour chaque)
■ diminue la précision

40
Q

Comment fonctionne la cellule de collision?

A

-Cellule contient un peu de gaz
-Une différence de potentiel est appliquée entre l’entrée et la sortie de la cellule (briser lien les + faibles en premier)

41
Q

Est-ce qu’augmenter le nombre de pôles dans la cellule collision est utile?

A

Oui,

● + il y a de pôles, + les faisceau sont fin, + efficace pour les collisions

42
Q

Qu’est-ce qui permet d’éviter le crosstalk?

A

Voltage de base (ex: 10 V)

43
Q

Comment est-ce qu’on contrôle la fragmentation?

A

-On contrôle la fragmentation en optimisant le voltage appliqué sur la cellule (« Collision
Energy »)
● + le voltage est élevé, + la collision est violente, + on fragmente

44
Q

Qu’est-ce que fait une trappe ionique?

A

-permettent d’accumuler spécifiquement des ions d’intérêt
-Les ions peuvent être quantifiés ou caractérisés par fragmentation
-permet de faire des fragmentations successive (MSn)
● toujours refragmenter les fragments et ainsi de suite
○ 1.accumulation
○ 2.éjection des ions non voulus
○ 3.collision
○ 4.éjection et détection des ions d’intérêt
● En autant que l’abondance des fragments le permette

45
Q

Qu’est-ce qu’une trappe ionique linéaire?

A

-Trappes ioniques linéaires (Q-Trap)
● Q3 est remplacé par une trappe ionique linéaire (Quadripôle modifié)
● Meilleure sensibilité due à l’accumulation des ions avant la détection

46
Q

Qu’est-ce que permet le TOF?

A

-Mesure des masses basée sur le temps requis pour qu’un ion parcourt une distance
connue
● ex: gros = moins vite et arrive en dernier
● ex: charge = moteur et masse = ce qui le ralentit

-On doit permettre à tous les ions d’arriver au détecteur avant d’introduire d’autres ions
dans l’appareil
● Analyse pulsée (MALDI-TOF)

Q-TOF
● Le « pusher » est activé de façon pulsée
● utile pour la protéomique
● Quad (sélectionne les ions) suivi de cellule de collision:

47
Q

Quel est le problème de la résolution du TOF?

A

-Résolution TOF
● La résolution des TOF est affectée par la dispersion spatio-temporelle des ions
● 2 ions de même masse qui commencent en même temps, devrait se rendre en
même temps
● mais pleins de petits phénomènes qui peuvent causer des décalage
● ex: point de départ différent, arrive pas en même temps même si même charge
● quand elles rentrent, certaines ont pas la même directions
● Pour corriger ces différences entre les ions d’un même m/z, on utilise un
réflecteur ionique

48
Q

Qu’est-ce qu’un TOF avec un réflecteur ionique?

A

-TOF avec réflecteur ionique
● permet de corriger les petites différences dans la fentes (genre de trampoline)
● permet aux masses pareilles de se recentrer sur elle-mêmes

49
Q

Expliquer le détecteur du MS?

A

-La détection des ions en MS est presque toujours accomplie à l’aide de multiplicateurs d’électrons
-Différence de potentiel entre chaque dynodes et mesure le courant à la fin sur anode

50
Q

Quels sont les 3 types de calibration pour les analyses chromatographiques? Expliquer

A

1.Étalonnage par ajouts dosés
● Peu fréquent
● Pour analyses avec effet de matrice prononcé
● Requiert plusieurs analyses par échantillon !
● on a un échantillon inconnu, on dose,
on reprend le même échantillon et on
spike 2-3x notre analyte d’intérêt,
faire une droite, on retrouve la concentration de notre inconnu avec
l’interception avec les X
● pas meilleure méthode car variable

2.Étalonnage externe
● Peu fréquent
● Méthode de calibration généralement employée pour les autres types d’analyses (colorimétrique, immunologiques…)
● mesurer concentrations connues, tirées une droite, et s’en servir pour identifier concentration

3.Étalonnage interne
● Méthode la plus fréquente
● Utilisation d’un standard interne
(concentration fixe dans tous les
échantillons)
● Courbe du ratio analyte/standard interne en fonction de la concentration d’analyte
● on mesure les ratio

51
Q

Quels sont les caractéristiques du standard interne?

A

● Caractéristiques du standard interne:
○ Chimiquement comparable à l’analyte
○ Pas présent dans l’échantillon à analyser
○ Séparé des analytes
■ Par le tR en HPLC-UV
■ Par le tR ou la masse en MS
○ Réagis de la même façon que les analytes aux variations analytiques

52
Q

Le standard interne corrige pour quoi?

A

○ Rendement d’extraction
○ Suppression d’ions en MS (parfois)
○ Erreurs de pipetage (dans les étapes suivant l’addition du standard
interne), ex: volume de solvant organique pour précipiter les protéines
○ Variations du volume d’injection
○ Variations légères dans les conditions chromatographiques
○ Sensibilité de détecteur (MS particulièrement); la réponse a tendance a
diminué dans le temps, tout au long des analyse des 150 patients

53
Q

Quels éléments importants pour l’entretien du MS?

A

-PRENDRE UN CONTRAT DE SERVICE!

-Source
● Nettoyer régulièrement la source (selon utilisation)

-Pompe rotative à l’huile
● Ouvrir le « ballast » pour permettre à l’huile de redescendre dans le réservoir

-MS
● Vérifier la calibration des masses après chaque nettoyage de source et recalibrer
au besoin
● Remplacer multiplicateur d’électrons (> 2 000

54
Q

Quels sont les 2 types de courbes de calibration retrouvé?

A

Les courbes peuvent être linéaires ou quadratiques

55
Q

Comment choisir le bon type de courbe?

A

-Pondération des courbes
● La pondération (« weight ») tient compte du fait que l’imprécision en valeur absolue est plus grande sur les hautes concentrations
● 10% de 2,5 ng/mL = 0,25 ng/mL
● 7% de 25 ng/mL = 1,75 ng/mL (en valeur absolu, c’est plus gros
● ex: accorder plus d’importance au point plus tôt avec pondération

-Pour choisir le bon type de courbe, on fait de multiples calibrations (n = 10)
● Choisir le modèle qui donne des exactitudes moyenne pour les calibrateurs le plus près possible de 100%
● Typiquement, on recommande une pondération 1/x^2 pour les calibrations linéaires (et 1/x pour quadratique)

-Forcer la courbe à zéro si l’intervalle de confiance de l’ordonnée à l’origine inclus le zéro

56
Q

Comment quantifier les masses en LC-MS?

A

-quantifie les masses (ou les transitions) de façon séquentielle
● « Dwell time » = temps passé à quantifier chaque masse
● Le ratio signal/bruit augmente lorsque le dwell time est augmenté (meilleur)

-Par contre, on doit avoir suffisamment de points dans le pic chromatographique pour permettre une bonne intégration
● Minimum 10-12 points pour avoir une bonne intégration

-Le dwell time est ajusté en fonction du nombre de transitions à mesurer et de la largeur des pics chromatographiques
● ex: largeur = 1 min, avoir 12 point en 1min = ok
● ex2: si largeur en UPLC = 3 sec, plus difficile d’avoir 12 points entre ça
● ajuster le dwell time en fonction de ça mais min 30msec entre chaque
10

57
Q

Étapes de mise au point d’une nouvelle méthode par LC-ESI-QQQ

A

-Comme toute analyse de laboratoire, le développement d’une nouvelle méthode par spectrométrie de masse débute par une évaluation des besoins cliniques et de l’utilité de l’analyse
-La littérature déjà publiée sur les méthodes HPLC ou LC-MS pour le paramètre d’intérêt doit aussi être revue

  1. Trouver le matériel
    ● Après revue de littérature, on se fait une idée sur:
    ○ La méthode de préparation de l’échantillon à employer
    ○ Le type de colonne chromatographique à utiliser
    ○ La limite de quantification à viser
    ● Aussi, on achète étalon de pureté suffisante (idéalement certifiée, poudre ou solution)
  2. Trouver les paramètres MS
    ● Remplacer la colonne chromatographique du HPLC-MS/MS par un union (+ rapide)
    ○ Flow Injection Analysis (FIA)
    ● Diluer l’étalon à une concentration suffisante dans une solution compatible avec la préparation d’échantillon envisagée
    ○ ex: 1 g/mL dans méthanol 50%
    ● Préparer une phase mobile similaire
    ○ ex: Méthanol 50% +0,1% acide formique
  3. Établir paramètre de la source ESI
    ● Paramètre généraux:
    ○ Température: 350 C
    ○ Débit du gaz: 10 – 12 L/min
    ○ Pression du gaz: 40 – 60 psi
    ○ Voltage de l’aiguille: 4 000 V
    ○ Débit LC: 0,5 mL/min
    ● Selon littérature
  4. Trouver la masse de l’analyte
    ● Faire une injection en mode SCAN
    ○ Choisir un intervalle compatible avec la masse du produit, mais plus large (ex:
    400 – 1 100 Da pour une molécule de 1 000 Da)
    ○ Ionisation en mode positif (M+1) ou négatif (M-1), selon littérature ou
    structure chimique
  5. Optimiser le voltage du fragmenteur
    ● Faire une injection en mode SIM et varier le voltage du fragmenteur
    ● masse identifiée dans le SCAN (laisser passer juste ca, ex: 980,6)
    ● but: avoir transmission maximal sans fragmentation, on voit que ca diminue a 375V
  6. Identifier les fragments
    ● Faire une injection en mode PRODUCT ION
    ○ Masse du précurseur fixée (ex: 980,6)
    ○ Voltage du fragmenteur connu (ex: 325 V)
    ○ Énergie de collision minimale (ex: 5-10 V)
    ● ex: beau fragment à 389 pour le quant, lui à côté a 400ish pourrait être le qualifier
  7. Optimiser l’énergie de collision
    ● Faire une injection en mode MRM et varier l’énergie de collision (et fixer Q3)
    ○ Masse du précurseur fixe (ex: 980,6)
    ○ Voltage du fragmenteur connu (ex: 325 V)
    ○ Masses des fragments connues (ex: 389,4 et 409,3)
    ● ex: trop d’E (70): fragment fragmente à leur tour aussi
  8. Optimiser la chromatographie
    ● Commencer par gradient
    ○ ex: 5 à 100% méthanol sur 10 min)
    ● Optimiser chromatographie (surtout k)
    ● Lorsque rétention est satisfaisante, refaire optimisation pour le voltage du fragmenteur et l’énergie de collision
    ○ Paramètres peuvent variés en fonction de la composition de la phase mobile
    ● Vérifier effet d’une modification des paramètre de la source (T°, pression, voltage aiguille)
    ○ On cherche le meilleur rapport signal au bruit
  9. Valider la méthode
    ● Comme les autres méthodes, plus:
    ○ SUPRESSION D’IONS
    ○ Rendement d’extra