Spectro et Enzymo

Question 1

Qu’est-ce que la spectrophotométrie?

Answer 1

mesure de l’intensité de la lumière à une longueur d’onde définie dans la portion du spectre de lumière visible entre 380 et 750nm

Question 2

Nomme moi 2 méthodes colorimétriques sans réactifs en laboratoire.

Answer 2

-bilirubine néonatale
-pigments d’Hb en toxico comme oxyhémoglobine, carboxyhémoglobine

Question 3

Nomme moi 3 méthodes de déprotéinisation.

Answer 3

-précipitation acide (acide trichloracétique: TCA, phosphorique, acétique)
-sels
-solvants organiques
-dialyse
-filtration
-détergents (carry over possible avec d’autres analytes)

Question 4

Quel est le calcul de la loi de Beer-Lambert?

Answer 4

A=abc
a : coefficient d’extinction molaire
b: longueur de la trajection de la lumière
c: concentration de l’échantillon

Question 5

Quelle est la relation entre l’absorbance et la transmittance?

Answer 5

La concentration d’une substance (proportionnelle à la quantité de lumière absorbée) = inversement proportionnelle au logarithme de la lumière transmise
A = -log Is/I0 = -logT

Question 6

Est-il préférable d’avoir un coefficient d’extinction molaire bas ou élevé et pourquoi?

Answer 6

-Préférable d’avoir un coefficient d’absorption molaire élevé puisque plus il est grand et plus la linéarité est longue
-Ça permet de déterminer une concentration plus précise de la solution
-Ça peut permettre d’éviter de diluer les échantillons pour plus longtemps

Question 7

Nomme 4 conditions pour la Loi de Beer-Lambert.

Answer 7

-Radiation incidente sur la substance d’intérêt est monochromatique
-L’absorption du solvant est négligeable p/r à l’absorbance du soluté
-Pas d’interférence optique
-Une Rx chimique ne doit pas se produire entre la molécule d’intérêt et le solvant

Question 8

Quel technique peut-il être utilisé en spectrophotométrie pour éviter la présence de mesures de réactions non spécifiques?

Answer 8

Il est possible de prendre nos données à un temps spécifique (ex: entre 10 et 20 sec) dans lequel il n’y a pas de réactions non spécifiques.

Question 9

Qu’est-ce qu’une réaction sentielle?

Answer 9

La réaction sentinelle est une réaction qui permet de savoir si tu as un problème au niveau de ton spectrophotomètre. Par exemple, l’ utilisation d’un test qui fait très peu de coloration tel que du bleu pâle. Si le contrôle qualité interne de cette réaction ne fonctionne pas, cela veut dire que c’est un problème dans le spectro.

Question 10

Dessine moi un spectrophotomètre à un seul rayon.

Answer 10

Notes de la prof:
1) source de lumière
2) façon d’isoler la λ (monochromateur)
3) fibre optique
4) cuvette (cellule d’absorption)
5) photodétecteur (convertit énergie de la lumière en énergie électrique)
6) détecteur
7) enregistreur de données
8) ordinateur

Question 11

Dessine moi un spectrophotomètre à double rayons.

Answer 11

Spectrophotomètre double faisceau dans l’espace (double-beam-in-space)
ou
Spectrophotomètre double faisceau dans le temps (double-beam-in-time)

Question 12

Nomme trois façons d’isoler un spectre.

Answer 12

-Filtres
-Prismes: sépare la lumière blanche en un spectre continu par réfraction
-Gratings (grillage) de diffraction: dépôt d’une mince couche d’un alliage de cuivre-aluminium sur une surface de verre plat rainurée (1000-2000 lignes/mm), principe: chacune des lignes génère un petit spectre donc celles en phase se renforcent et les autres s’annulent, donne donc un spectre continu

Question 13

Qu’est-ce qu’un photodiode et nomme des avantages et désavantages.

Answer 13

-Photodétecteur solide fabriqué avec un semi-conducteur photosensible (silicone, gallium, arsenide, indium, antimoine)
-Avantages : Rapide, peu coûteux, permet d’analyser composés dans plusieurs longueurs d’onde
-Désavantages : moins sensible qu’un photodétecteur, sensible aux effets de lumière parasite et augmentation bruit de fond avec les barrettes diode

Question 14

Illustre le principe d’un photomultiplicateur.

Answer 14

1) lumière arrive à photocathode (photon convertit en électron)
2) circuit de dynodes qui augmentent le nombre d’électrons, différence de potentiel croissante entre chaque dynode
3) anode : électrons détectés
*amplifie un photon en 10^7 électrons

Question 15

Quels sont les inconvénients (les interférences) d’un photodétecteur?

Answer 15

-Lumière parasite (radiation de la longueur d’onde à l’extérieur de la bande étroite par dispersion et diffraction)
-Fluorescence potentielle de l’échantillon

Question 16

Qu’est-ce que l’effet de crochet?

Answer 16

trop de substrat cause une réaction anormale (diminution de la réponse)

Question 17

Pourquoi doit-on faire très attention lorsqu’on dilue des échantillons avec le diluant de la compagnie dans des réactions enzymatiques?

Answer 17

Faire attention puisque plusieurs réactions enzymatiques nécessitent des cofacteurs pour leur réaction qui se retrouvent seulement dans le plasma/sérum donc, préférable de diluer avec sérum/plasma de personne normale.

Question 18

Dessine moi la photométrie de réflectance et indique moi les avantages et désavantages

Answer 18

-Pour dessin voir PP
-Avantages-: simple, rapide, peu coûteux
-Désavantage : peu précis, l’intensité de la lumière n’est pas linéaire

Question 19

Qu’est-ce que la spectrophotométrie de flamme et quels sont les avantages et désavantages? Dessine le.

Answer 19

-Principe: Émission de la lumière par les atomes de plusieurs éléments métalliques. Les métaux émettent dans des longueurs d’onde spécifiques lorsqu’on leur donne assez d’énergie. Les couleurs des métaux sont caractéristiques des atomes présents dans un échantillon. Technique de référence, mais peu utilisé de nos jours.
-Avantages : certains éléments sont analysés avec moins d’interférence
-désavantage : Pour l’analyse des alcalins et c’est assez coûteux

Question 20

Dessine moi avec ces composants le principe d’un fluoromètre. Quels sont ses avantages et inconvénients?

Answer 20

Voir PP du cours
-Avantages : sécuritaire (évite radio), essais homogènes, automatisée, rapide, sensible
-Désavantages : Certaines substances (drogues et ses métabolites) et autres molécules (ex : bilirubine) font de la fluorescence interférente, limité à 20kDa

Question 21

Qu’est-ce que la fluorescence en temps différé? Donne moi un exemple.

Answer 21

-Fluorescence en temps différé : Échantillons marqués avec fluorophore avec longue demi-vie. De ce fait, la lumière mesurée est celle qui persiste lorsque les émissions non spécifiques des autres surfaces et matériaux s’éteignent. Mesure du déclin du signal de fluorescence après excitation.
-Exemple : DELFIA pour dépistage néonatale

Question 22

Qu’est-ce que la fluorescence polarisée? Nomme des avantages et inconvénients.

Answer 22

-Fluorescence polarisée : Fluorophore absorbe plus efficacement dans les plans de ses niveaux d’énergie électronique – importance de la taille de la molécule – rotation de la molécule – on déterminer la durée moyenne de l’état d’excitation de la molécule (plus molécule grosses, et plus est élevé, + rotation est longue) – Plus rotation est longue et plus lumière reste polarisée- si lié à anticorps il y a réémission de lumière polarisé.
-Avantages : sensible, rapide, homogène, automatisée, réactifs stables
-Inconvénient : Instrumentation spécialisée, dédié au FPIA, kDa doit être plus petit que 20, pour drogues et médicaments.

Question 23

Limites de la fluorescence.

Answer 23

-Effet de filtre intérieur (lorsque concentration de l’échantillon et fluorescence n’est plus linéaire)
-concentration quenching (plus faible fluorescence à cause d’une faible distance entre fluorophore et molécule d’intérêt)
-dispersion de lumière
-effet de la cuvette de solvant
-effet de matrice
-température (intensité de la fluorescence diminue avec l’augmentation de température)
-photodécomposition (diminution fluorescence à cause de lumières intenses)

Question 24

Qu’est-ce que la chimiluminescence et donne moi un exemple.

Answer 24

-Chimiluminescence : Émission de lumière lorsqu’une molécule (électrons) possédant une énergie élevé (ou excité) devient basse. L’excitation est causée par une Rx chimique qui implique l’oxydation d’un composé organique (ex: luminol, isoluminol, les esters d’acridinium, la luciférine) par un oxydant (oxygène, peroxyde d’hydrogène, hypochlorite). Nécessite catalyseurs comme des enzymes (ALP) ou des ions/complexes métaliques (Cu2+, Fe2+)
-Exemple en immunologie : anticorps/haptènes liés à molécules luminescentes, lorsqu’antigène se lie à l’anticorps marqué, réaction de chimiluminescence, donc intensité lumière proportionnelle à conc échantillon (peut avoir background ou fuite de lumière)

Question 25

Qu’-est ce que l’électrochimiluminescence?

Answer 25

Rx générée par des précurseurs stables à la surface d’une électrode (ex ruthenium tris(bipyridyl) chélaté fait une Rx oxydo-réduction avec tripropylamine)

Question 26

Qu’est-ce que la bioluminescence et donne un exemple de molécule.

Answer 26

Forme spéciale de chimiluminescence retrouvée dans des systèmes biologiques, enzyme ou une photoprotéine augmente l’efficacité de la réaction de luminescence.
ex: luciférase et l’aequorine (émet de la lumière en présence de Ca)

Question 27

Est-ce qu’une réaction enzymatique est plus coûteuse qu’une réaction colorimétrique?

Answer 27

Oui

Question 28

Nomme moi certains produits fréquemment rencontrés en réactions enzymatiques.

Answer 28

NADPH
NADH (absorbe à 340nm don interférence avec lipémie)
H2O2
O2

Question 29

Qu’est-ce que des isoenzymes et nomme moi des exemples.

Answer 29

-Isoenzymes : Catalyse même réaction, mais possède structures différentes car elles proviennent de gènes différents (ex: isoenzymes dans des organes différents). Distingués par mobilité électrophorétique, résistance à l’inactivation chimique ou physique.
-Exemples : LDH, ALP (isoenzyme avec phosphatase alcaline placentaire)

Question 30

Dans quel contexte il peut y avoir une modification de la distribution des isoenzymes?

Answer 30

L’expression de plusieurs isoenzymes changent durant l’embryogenèse, la cancérogenèse et des dystrophies musculaires progressives par exemple.
ex: augmentation de ALP chez les patients atteint s de carcinomes pulmonaires

Question 31

Dans le cas d’un trauma grave (ex: accident de moto), pourquoi certains marqueurs sont moins bons pour évaluer l’état d’un organe?

Answer 31

Certaines enzymes, comme AST et ALT, sont des marqueurs reconnus pour le foie. Par contre, ce enzymes de sont pas exclusives au foie. Dans le cas d’une trauma grave, des saignements intravasculaires peuvent fausser les résultats à cause d’autres sources d’ALT et AST.

Question 32

Pourquoi peut-il être plus pertinent d’analyser l’amylase comparativement à la lipase?

Answer 32

Réponse de Nic: L’amylase a plus petite demi-vie que la lipase donc on peut savoir si écoulement du pancréas
Réponse de No: Lors d’une pancréatite, il y a une augmentation d’amylase et de lipase. Comme la lipase a une demi-vie plus grande, elle reste plus longtemps dans le corps et peut-être analysée sur une plus longue période.

Question 33

Suite à une opération, devrait-on se fier à l’amylase ou à la lipase pour décider quand retirer un drain?

Answer 33

L’amylase a une demi-vie plus courte. Si on se fit à elle, on prendra la décision d’enlever le drain plus tôt ce qui pourrait causer moins de préjudice au patient.

Question 34

Indiquez des facteurs qui influencent une réaction enzymatique.

Answer 34

-Concentration de l’enzyme (principe de base: vitesse de réaction est proportionnelle à la concentration d’enzyme)
-pH (faire attention aux dilutions qui peuvent affecter la réaction vu diminution des cofacteurs)
-Température
-Molécules inhibitrices

Question 35

Dans un graphique de la vitesse de réaction en fonction de la concentration du substrat, comment on calcule le Km?

Answer 35

Km = 1/2Vmax
Vmax se détermine avec le plateau de la courbe.

Question 36

Un graphique de la vitesse de Rx en fonction de la concentration du substrat donne une courbe qui atteint un plateau. Lorsqu’on transforme cette courbe pour obtenir une droite, on fait un graphique de 1/v en fonction de 1/[S]. Dans ce dernier graphique, que représentent l’abscisse et l’ordonnée à l’origine?

Answer 36

intersection avec axe des x (abscisse à l’origine) = -(1/Km)
intersection avec axe des y (ordonnée à l’origine) : 1/Vmax

Question 37

Dans une réaction où un complexe ternaire se forme (E + S1 → ES1 + S2 → ES1S2 → P1 + P2 +E, ex: déshydrogénase), comment la [S2] affecte la droite du graphique de1/v en fonction de 1/[S1]?

Answer 37

La pente de la droite et l’ordonnée/l’abscisse à l’origine dépendent de la concentration du 2e substrat. Plus la [S2] diminue, plus la pente est à pic et plus l’ordonnée à l’origine augmente.

Question 38

Dans une réaction où aucun complexe ternaire se forme (E + S1 → ES1 + S2 → P1 + P2 +E, ex: aminotransférase), comment la [S2] affecte la droite du graphique de1/v en fonction de 1/[S1]?

Answer 38

-La pente de la droite ne change pas
-L’abscisse/l’ordonnée à l’origine dépende de la concentration du substrat 2
-Ainsi, la valeur de Vmax change selon la [S2]
-Plus la [S2] diminue, plus l’ordonnée à l’origine augmente en gardant la même pente (la droite se déplace parallèlement vers le haut)

Question 39

Vrai ou Faux: Il y a des pH optimum pour les différents tampons de réactions enzymatiques.

Answer 39

Vrai
Ex: Le pH optimal pour une activité maximal d’uréase est de 6.3 dans tampon acétate, 6.7 dans un tampon citrate et 7.3 dans un tampon phosphate.

Question 40

Quelle est la différence de l’effet de la température sur une réaction chimique non-enzymatique et une réaction catalysée par un enzyme?

Answer 40

À partir d’une certaine température (souvent >37-39’C), la vitesse de la réaction catalysée par un enzyme diminue car l’enzyme est dénaturée par la chaleur. Pour la réaction chimique non-enzymatique, la vitesse de réaction peut augmenter de façon exponentielle avec la température.

Question 41

Quel est l’effet des différents types d’inhibiteurs sur la droite dans un graphique de 1/v en fonction de 1/[S]
-inhibiteur compétitif
-inhibiteur non compétitif
-inhibiteur “uncompétitif”

Answer 41

-inhibiteur compétitif : Km augmente et Vmax n’est pas affecté (pente plus à pic)
-inhibiteur non compétitif : Km n’est pas affecté et Vmax diminue
-inhibiteur “uncompétitif” : Km diminue et Vmax diminue

Question 42

Quelle est la relation de la vitesse et de Km dans la portion linéaire d’une droite (là ou il faut prendre les mesures d’une analyse) ?

Answer 42

v = Km

Question 43

Indiquez 2 méthodes d’analyse en enzymologie.

Answer 43

-Point final : Tout le substrat est transformé en produit par la réaction analytique

-Mode cinétique : Changement absorbance par unité de temps, spectro et chrono précis, cinétique initiale d’ordre 1 (vitesse proportionnelle à la concentration)

Question 44

Nomme un inconvénient de la méthode point final

Answer 44

Inconvénient : temps réaction plus long pour une réaction complète

Question 45

Vrai ou Faux : Une réaction en cascade (ex: A+B → C → D → E) est conditionnée par la Rx la plus rapide.

Answer 45

Faux: la Rx la plus lente conditionne la vitesse

Question 46

Indiquez des éléments à faire attention lorsqu’on fait une calibration à un facteur

Answer 46

-effet du pH
-température
-force ionique sur le coefficient d’absorption molaire

Question 47

Indiquez 3 éléments qui font de l’interférence avec des réactions enzymatiques et quelles sont des pistes de solutions pour corriger ces interférences, lorsque possible.

Answer 47

Interférences:
-Turbidimétrie (lactescence/lipémie, protéines, précipité)
-Bilirubine (ictère)
-Hémolyse
Solutions:
-mesure à deux longueurs d’onde
-facteur de correction

Question 48

Qu’est-ce que l’EMIT (Enzyme multiplied immunoassay technique)?

Answer 48

1-Anticorps + analyte sont mélangé et la liaison se fait
2-Ensuite, on ajoute d’un enzyme lié à l’antigène (même chose que l’analyte)
3-Les anticorps en excès vont lier l’enzyme-antigène, ce qui va diminuer l’activité de l’enzyme.
4-Mesure de l’Activité de l’enzyme (si + activité enzymatique dans échantillon donc, + analytes du patient (homogène))

Question 49

Qu’est-ce que le CEDIA (Cloned enzyme donor immunoassay)?

Answer 49

1-Les Ac et le fragment donneur de l’enzyme (b-galactosidase) sont liés. L’Ac bloque la dimérisation et ainsi son activité.
2-L’ajout de l’antigène déplace le fragment donneur de l’enzyme et lie l’Ac.
3-Le fragment donneur est libéré, ce qui permet l’assemblage des deux fragments de l’enzyme et active l’enzyme.
*Si antigène présent en grande quantité, l’activité de la beta-galactosidase est maximale.

Question 50

Donne une exemple de méthode qui dépend d’une cofacteur et comment ce cofacteur peut influencer l’analyse.

Answer 50

AST/ALT dépendent du pyridoxal-5-phosphate.
L’analyse serait perturbée dans le cas d’une déficience du pyridoxal-5-phosphate, d’une carence en pyridoxal-5-phosphate lors de l’hémodialyse (pire avec l’hémodiafiltration) ou par une inhibition enzymatique en contexte urémique.

Question 51

Nomme des enzymes qu’on utilise en réactions enzymatiques pour les analyse et qu’on mesure par des méthodes colorimétriques.

Answer 51

GGT
lipase pancréatique
amylase
glucosidase
AST
MDH
ALT
LDH
LD

Question 52

Pourquoi c’est important de calibrer une réaction enzymatique?

Answer 52

Pour faire la comparaison avec les pairs. Pour établir des valeurs cliniques comparables (ex: 2-3x la limite supérieure normale = problème)

Question 53

Comment on calibre une enzyme?

Answer 53

-ca prend une méthode de référence IFCC (qui permet de faire du matériel certifié et qui est vérifiée avec ce matériel)
-ce qui permet de produire du matériel de référence secondaire certifié
-ensuite les manufacturiers travaille avec ca pour leur procédure d’analyses, leurs calibrateurs
-enfin au labo on travaille avec les calibrateurs du manufacturier. on l’utilise pour les procédures et les analyses de routine
-désavantage: les calibrateurs standards peuvent être très chers