Chromato liquide Flashcards

Question 1

Q

Décrit le principe général d’un HPLC en 5 étapes.

Answer

A

1) Un liquide circule continuellement du réservoir au détecteur
2) L’échantillon est introduit dans l’injecteur (boucle d’injection)
3) L’échantillon est injecté sur la colonne
4) Les substances interagissent avec la colonne (partition ou autre…)
5) Les substances sont détectées à la sortie de la colonne

Question 2

Q

Nomme 7 composantes d’un HPLC.

Answer

A

-Réservoirs et phases mobiles
-Dégazeur
-Pompes à pistons
-Injecteur automatique
-Compartiment pour colonnes
-Colonnes HPLC
-Détecteurs

Question 3

Q

Que contiennent les réservoirs de phase mobile en HPLC et combien y en a-t-il pour les modes isocratique et par gradient?

Answer

A

Phase mobile inertes ou propres

Nombre de réservoir:
- 1 pour isocratique
- >1 pour gradient

Question 4

Q

Où est situé le réservoir de phase mobile dans un HPLC par rapport à la pompe?

Answer

A

-Réservoir tjrs plus haut que la pompe pour une pression positive (minimum 10x le débit requis)

Question 5

Q

Comment les phases mobiles sont purifiées (sans particule et sans bulle d’air)?

Answer

A

-filtre de verre fritté
-membrane de nylon 0.45um
-dégazeur

Question 6

Q

Nomme deux modes de chromatographie. Comment la composition de la phase mobile varie durant la chromato dans ces deux modes?

Answer

A

-isocratique (composition de la phase mobile constante, phase inchangée pendant l’analyse)
-gradient (variation de la composition de la phase mobile durant la chromato)

Question 7

Q

Qu’est-ce qui contrôle le mélange des phases mobiles?

Answer

A

la pompe (quaternaire ou binaire)

Question 8

Q

Quel est le principe général d’un dégazeur et nomme deux façons de dégazer?

Answer

A

Principe: lignes perméables au gaz, sous vide, les bulles s’échappent

2 façons :
-purger avec un gaz inerte
-en utilisant un dégazeur automatique (+ commun)

Question 9

Q

Nomme deux conséquences possibles de ne pas retirer les bulle d’air avec un dégazeur.

Answer

A

-un problème de débit de pompe (plus problématique pour les mélanges de phases, oxygène moins soluble dans les mélanges de solvants que dans les solvants purs)
-un bruit de fond élevé

Question 10

Q

VRAI ou FAUX: Il n’est pas important de savoir le volume du dégazeur.

Answer

A

FAUX: c’est important de savoir le volume du dégazeur afin de savoir le temps qu’il faut pour purger la totalité du liquide

Question 11

Q

Nomme 3 types de pompes à piston.

Answer

A

-pompe à 1 piston
-pompe quaternaire
-pompe binaire

Question 12

Q

Nomme 3 composantes du HPLC qui font partie intégrante du système de pompe.

Answer

A

-pompe
-valve anti-retour
-valve de purge (ouvrir = vidange)
-valve pour sélectionner les solvants

Question 13

Q

nomme 3 utilités dune pompe à piston.

Answer

A

1) une pression élevée (+ de pression = + performante)
–HPLC: 400 – 550 bars (6 000 – 8 000 psi)
–UPLC: 550 – 1200 bars (8 000 – 17 000 psi)
2) un débit constant (sans pulsation)
3) un volume mort minimal (surtout pour chromato rapide, UPLC: rapide, sharp, mais moins résistant que HPLC au petit problème)

Question 14

Q

Quel est le principe de la pompe à un piston?

Answer

A

-Arrivée des phases mobiles = rempli la pompe et solvant et ensuite pousse le solvant dans la colonne
-Aidé par les valves anti-retour: les billes alternes et empêche le retour (back and forth fait par le cam, tire = recule et pousse = avance)

Question 15

Q

Quel est le principal désavantage de la pompe à 1 piston et nomme 2 solutions pour palier à ce problème?

Answer

A

Désavantages :
-Beaucoup de variations de pression (↓ pression lors du remplissage)
-plusieurs poussées, pas constant

Solution pour ↓ pulsations de pression:
-atténuateur de pression
-pompes différentes

Question 16

Q

Décrit 4 systèmes qui permettent d’atténuer les pulsations faites par la pompe.

Answer

A

1) Came elliptique (remplit vite et pousse tranquillement)
2) Deux pistons opposés (opposés: 1 seule cam, travail en alternance, 4 valves antiretour)
3) Deux pistons alignés (+ commun, un gros et un petit)
4) Atténuation de pulsation avec pulse damper : Phase mobile passe dans une chambre contenant un diaphragme pressurisé par un gaz (air ou azote)

Question 17

Q

Quelles sont les composantes et le principe d’une pompe quaternaire?

Answer

A

-Composé de : 1 pompe à 2 pistons + 1 valve de sélection du solvant
-Principe : Valve de sélection de solvant s’ouvre en alternance dans les différentes lignes de solvant pour un temps proportionnel au pourcentage souhaité
ex: Pour faire une solution 70:30 des solutions A et B. La valve va être ouverte à la sol A durant 70% du temps de remplissage puis à la sol B pour les 30% restants

Question 18

Q

Quelles sont les composantes et le principe d’une pompe binaire?

Answer

A

-Composé de : 2 pompes à 2 pistons
-Principe : Pour faire mélange désiré, les deux pompes fournissent un débit équivalent au pourcentage de solvant souhaité
pompe A contrôle ligne de solvant A, pompe B contrôle ligne de solvant B
ex : si on veut un mélange 70 (A) :30 (B) = pompe A fonctionne à 0,7mL/min pendant que pompe B fonctionne à 0,3mL/min

Question 19

Q

Quel est l’avantage et le désavantage de la pompe binaire?

Answer

A

-Avantages : Mélange plus précis
-Désavantages : Plus coûteux

Question 20

Q

Le mélange des phases mobiles doit être très homogène pour les deux types de pompes (binaire et quaternaire), comment peut-on s’en assurer?

Answer

A

Homogénéisation fait par turbulence avec :
-mélangeur de type colonne (limite: gros, fait du volume mort)
-un capillaire d’une longueur appropriée (limite: wall-effect)

Question 21

Q

Qu’est-ce que le tD (délai du gradient, Gradient Dwell Time) et comment on le détermine?

Answer

A

Le décalage entre la composition de la phase programmée et celle ressentie à la colonne.

1) on programme un gradient linéaire avec un solvant qui absorbe en UV (ex: méthanol)
2) tD = la partie avant de commencer à avoir une augmentation linéaire de l’UV
VD = tD x débit

Question 22

Q

Dans un HPLC, la pression est élevée après la pompe. Nomme deux composantes nécessaire pour permettre de garder une pression élevée pour le système HPLC.

Answer

A

-des capillaires spéciaux (acier inoxydable, SS, ou polyetheretherketone, PEEK)
-des connections résistantes à la pression

Question 23

Q

Quelle est la conséquence d’un mauvais raccordement des capillaires et nomme deux causes de ce problème?

Answer

A

Conséquence: ↑ volume extra colonne qui ↑ élargissement des pics

Causes:
-colonne trop sortie
-espace entre la férule et l’autre morceau

Question 24

Q

Quel est le principe d’un injecteur automatique?

Answer

A

1) Injecteur est en position bypass
-phase mobile bypass injecteur et va direct à la colonne
2) Aiguille prélève la quantité d’échantillons à injecter
-échantillon placé dans boucle d’injection (qui peut être mis en mode partial-loop ou filled-loop)
3) Injecteur passe de position bypass en position mainpass
-La phase mobile va aller dans la colonne en passant par la boucle d’injection

Question 25

Q

Quelle est la différence entre le mode filled-loop et partial-loop?

Answer

A

-Filled-loop : Échantillon rempli complètement la boucle donc rentre par l’entrée loin de la colonne et sort juste avant la colonne
-Partial-loop : Échantillon rempli en partie la boucle donc rentre par l’entré qui est proche de la colonne (avantage: pics plus fins et précis)

Question 26

Q

VRAI ou FAUX: Le compartiments des colonnes doit avoir une température contrôlée car ça affecte le temps de rétention (via four à effet Peltier ou four à colonne).

Question 27

Q

Comment peut-on faire du column-switching?

Answer

A

1)Lorsqu’une valve de sélection de colonnes est installée, on peut faire des extractions en ligne, on-line SPE dans la machine (on y retrouve une trap colonne avec solution de lavage de la pompe 1 et solution d’élution de la pompe 2)
2)On peut aussi faire du Boxcar qui permet de faire deux séparations de suite

Question 28

Q

Décrit une colonne de HPLC?

Answer

A

-Cylindre métallique contenant des particules de support solide recouverte d’une phase stationnaire liquide attachée de façon covalente
-Longueur des colonnes: 10 à 250 mm (+ court que GC)
-Diamètre des colonnes: 2,1 – 4,6 mm
-Taille des particules (1,5 – 5 microm), <2 = UPLC
-Porosité variable des particules (petit particules = augmente la pression, colonnes porous shell particles: HPLC qui se rapproche du UPLC sans augmentation de pression)
-Phases stationnaires variées (ex: C18, C8, CN, Phényl, PFP_
-Flow unidirectionnel (porosité des filtres en verre fritté, plus grande porosité du filtre à l’entrée)

Question 29

Q

Il existe plusieurs types d’interaction avec la phase stationnaire, nomme les 2 plus populaires.

Answer

A

intéractions hydrophobe et échange de cations

Question 30

Q

Qu’est-ce que la rétention mixte et que peut-on faire pour l’éviter ou la diminuer?

Answer

A

Rétention mixte: interaction entre la phase stationnaire et la substance de >1 façon
ex: amine peut être retenue par hydrophobicité et cation exchange (silice = SiOH, s’il reste des O-, amine peut interagir avec O-), possibilité d’avoir pic dédoublé

Solution: Possible de faire du capping (N ou autre) pour cacher les O- à cause de présence d’interactions ioniques dans la phase inverse (permet une meilleure séparation et résistance à l’eau)

Question 31

Q

Quelle est l’équation de Knox et que représente elle?

Answer

A

Ralentissement du flow central lorsque deux chemins différents se mélangent

H = A𝑣1/3 + B/𝑣 + C (pas à retenir)
A = diffusion d’eddy +Cm
B = diffusion longitudinale
C = transfert de masse (Cs)

Question 32

Q

Quel es l’impact de la taille des particules en HPLC?

Answer

A

Plus la taille est petite et plus la chromatographie est efficace (↓ H)
- Pics plus fin (on veut des pics plus fin, petite colonne, plus difficile de passer le flo, plus de pression)
- ↑ pression
- ↑ débit
- ↓ longueur de la colonne
- ↓ temps d’analyse

Question 33

Q

Quel est l’utilité d’une pré-colonne?

Answer

A

-Sert à protéger la colonne (50$ pour pré-colonne vs 1000$ pour colonne)
-Retient les particules des échantillons
-Prévient la dégradation de la colonne

Question 34

Q

Nomme différents types de détecteurs compatible avec un HPLC.

Answer

A

-UV-visible
-fluorescence
-spectrométrie de masse
-Électrochimie, Conductivité, Réfractométrie, Radioactivité

Question 35

Q

En HPLC, les détecteurs d’absorbance sont les plus courants, décrit 2 types.

Answer

A

VWD (variable wavelength detector)
- + courant
- mesure une longueur d’onde à la fois

DAD (diode array detector)
-plus coûteux
- avantage : mesure plusieurs longueurs d’ondes à la fois (spectre d’absorbance)

Note: Un capillaire fin ou un régulateur de pression est généralement installé après la cellule du détecteur pour maintenir une certaine pression

Question 36

Q

Décrit un détecteur de fluorescence.

Answer

A

irradier échantillon avec longueur d’onde excitatrice et mesuré l’émission a 90’
meilleure sensibilité
meilleure spécificité
possible de dérivation pour introduire marqueur fluorescent
désavantage : besoin que ca soit fluorescent

Note: Un capillaire fin ou un régulateur de pression est généralement installé après la cellule du détecteur pour maintenir une certaine pression

Question 37

Q

À quoi peut servir le ratio signal sur bruit (S/N) en HPLC et il est dans quelle formule?

Answer

A

-pour déterminer LOD et LOQ
limite de détection (LOD) idéal : S/N = 3
limite de quantification (LOQ) idéal : S/N = 10

%CV ≈ 50 / (S/N)
meilleur est le signal, plus c’est reproductible

Question 38

Q

Le ratio signal sur bruit (S/N) peut servir à déterminer LOD et LOQ. nomme une autre façon de les déterminer.

Answer

A

-LOD et LOQ peut être obtenu à partir des données de calibration (y=mx+b)
LOD = 3,3 SDb / m
LOQ = 10 SDb / m

Question 39

Q

Nomme 5 modes de chromatographie.

Answer

A

-Adsorption (Phase normale)
-Partition (Phase inverse, Phase normale, HILIC)
-Échange d’ions
-Exclusion
-Affinité

Question 40

Q

Pour le mécanisme d’adsorption, décrit les types de chromatographie possible, la phase stationnaire, la phase mobile et le principe d’affinité de l’analyte.

Answer

A

Types: TLC,GC (colonne PLOT)
-Phases stationnaires solides et polaires (silice, oxyde d’aluminium, silicate de magnésium)
-Phases mobiles relativement non polaires (- polaire que phase stationnaire)
-Affinité de l’analyte pour la phase stationnaire est généralement en fonction des groupements polaires

Question 41

Q

Pour le mécanisme de partition (absorption), décrit les types de chromatographie possible, la phase stationnaire et le principe d’affinité de l’analyte.

Answer

A

-Types: HPLC, GC (WCOT)
-Phases stationnaires liquides (greffées sur support solide)
-Affinité de l’analyte pour la phase stationnaire est généralement en fonction de la distribution relative entre les deux liquides (généralement relié à l’hydrophobicité), les molécules rentrent dans la phase

Question 42

Q

Quelle est l’utilité de la méthode de gradient comme mécanisme de séparation?

Answer

A

-utilisé pour raccourcir le chromatogramme
-diminuer la diffusion longitudinale (↓ temps passé sur la colonne, pic plus fin)
-éliminer les substances qui seraient éluées tardivement

Question 43

Q

Quand est-il préférable d’utiliser la méthode de séparation par gradient?

Answer

A

-Faire gradient quand impossible d’avoir une rétention acceptable (1 ≤ k ≤ 10) pour les substances d’un mélange
-prévoir un temps d’équilibration des phases entre les injections (désavantage p/r à isocratique)

Question 44

Q

Comment faire changer le k en RPC?

Answer

A

Changement du % de la phase mobile B.

Chaque changement de 10% de b fait varier k de 2.5X

Question 45

Q

Nomme 5 types de gradient.

Answer

A

-linéaire (plus fréquent)
-segmenté (souvent)
-délai de gradient (partir en isocratique et embarquer gradient plus tard)
-gradient avec étape (bon pour lavage et revenir isocratique)
-Convexe et concave (peut utilisé)

Question 46

Q

On peut utiliser le k’ pour décrire la rétention quand c’est impossible de calculer le N. Quelle est la relation de k’ avec le débit, le temps du gradient et la variation de %B?

Answer

A

k’ = k apparent lorsque la substance a parcouru 1/2 de la colonne
k’ = proportionnel au débit et temps du gradient (tG)
k’ = inversement proportionnel à la variation du %B (ΔΦ)

Question 47

Q

Quel est l’effet du %B initial et final sur le gradient?

Answer

A

Effet du %B initial (jouer sur un gradient en RPC)
- k’ maintenu constant en variant tG : (ΔΦ) / tG = constant
- quand on aime le pattern du chromatogramme, on veut garder ça constant (ex: 0-100% en 50min (100/50=2), 20-100% en 40min (80/40=2) ou 40-100% en 30min (60/30=2) )
- ↑ %B initial = ↓ temps d’analyse puisqu’élimine le vide au début du chromatogramme

Effet du % B final
- ↓ %B final = ↓ temps d’analyse puisqu’élimine le vide au début du chromatogramme (↓20 %B = ↓20% temps analyse)

Question 48

Q

Quel est l’avantage de faire un délai de gradient?

Answer

A

-Quand on a des mixtes de molécules (polaires et hydrophobe)
-Permet d’améliorer pics initiaux si pas possible de diminuer %B initial

Question 49

Q

Pour le mécanisme de partition en phase normale, décrit la phase stationnaire, la phase mobile et le principe de la méthode HILIC.

Answer

A

-phases stationnaires polaires (cyano, Diol, amino)
-phase mobile hydrophobe sans eau (hexane, dichlorométhane et tétrahydrofurane)
-HILIC (Hydrophilic interaction chromatography):
–Chromatographie en phase normale (silice) avec phase mobile aqueuse-organique (polaire)
–Rétention : Plus %B est élevé et plus les composés sont retenus sur la colonne (interactions hydrophiles avec une couche d’eau qui se forme sur la phase stationnaire)

Question 50

Q

Pour la chromatographie d’affinité, décrit la phase stationnaire, la phase mobile et le principe d’affinité.

Answer

A

-Phase stationnaire recouverte d’un ligand spécifique: enzymes/substrat, antigène/anticorps, biotine/avidine, hormone/récepteur, lectines/sucres
-Phases mobile aqueuse compatible avec les analytes à séparer
-Principe : reconnaissance spécifique du ligand immobilisé et élution par ajout de ligand libre dans la phase mobile (gradient)

Question 51

Q

Pour la chromatographie par échange d’ions, décrit la phase stationnaire et la phase mobile.

Answer

A

Phases stationnaires chargées dans lequel il va y avoir compétition pour les sites de liaison entre les analytes chargés et les contre-ions de la phase mobile (analyte compétitionne avec le contre ion pour lier la phase)
-Échanges d’anions :
–WAX (weak anion exchanger, -NH3+
–SAX (strong cation exchanger, -N(CH3)3+
–strong: reste ionisé dans une plage plus grande de pH que weak
-Échanges de cations (entre le contre ion et analyte) :
–WCX (weak cation exchanger –COO-)
–SCX (strong cation exchanger, -SO3-)

Phase mobile aqueuse
tamponné pour contrôler le pH
contient un contre-ion (Na+, K+,cl-,etc..) sous forme de sel

Question 52

Q

Quelles sont les application cliniques de la chromatographie par échange d’ions?

Answer

A

pour regarder:
-acides aminés
-peptides
-protéines
-nucléotides et oligonucléotides
-Peut aussi aider la purification d’eau (déionisation)

Question 53

Q

Pour la chromatographie d’exclusion, décrit la phase stationnaire, la phase mobile, le principe de rétention et l’utilité.

Answer

A

-Phases stationnaire poreuses (dextran, agarose, polyacrylamide, polystyrène-divinylbenzène)
-Phase mobile aqueuse (compatible avec les analytes à séparer)
-Principe de rétention: Rétention seulement fonction de la capacité des molécules à pénétrer dans les pores de la phase stationnaire (taille de la molécule (grosse molécules sont éluées rapidement), Forme de la molécule, Hydratation)
ex: petite molécule se perdre dans les trous, pas les grosses
-Utilité : Chromatographie préparation pour purification de protéines ou pour déterminer poids moléculaire de protéines (structure quaternaire, multimères)

Question 54

Q

Pour la chromatographie de partition en phase inverse (RPC), décrit la phase stationnaire, la phase mobile et le principe de rétention.

Answer

A

-Phase stationnaire non polaire (rétention basé sur l’affinité hydrophobique des molécules)
–C8, C18
–end-capped C18 (C18 avec autre réactif pour bloquer silanols libres)
–phényl
–PFP: Pentafluorophenyl
-Phase mobile hydrophile (p/r à phase stationnaire)
–eau + solvant organique polaire (méthanol, acétonitrile)
–par définition : A = phase aqueuse et B = phase organique
-Principe de rétention en RPC : rétention en fonction de l’hydrophobicité avec une ordre élution du plus polaire au moins polaire

Question 55

Q

Question possible d’exam: mettre en ordre sur chromatogramme des molécules hydrophobes.

Answer

A

plus c’est hydrophobe plus ca colle
1-benzène-CN
2-benzène-OCH3
3-benzène-CH3
note: métabolite des drogues est à gauche/avant, car métabolite = toujours plus polaire

Question 56

Q

Quel est l’effet de %B (phase organique/solvant) sur la rétention en RPC?

Answer

A

- %B est élevé et moins les substances sont retenues, molécules sortent + vite
Optimisation de k: Un changement de 10% de B apporte à varier de 2,5x k. Ceci permet d’orienter le développement des méthodes
–aller vers la droite = baisser %
–aller vers la gauche = augmenter %

Question 57

Q

Quel est l’effet de la température sur la rétention en RPC?

Answer

A

-Les températures élevées ont tendances à diminuer l’interaction des substances avec la phase mobile et la phase stationnaire
-↑ T’ = ↓ tR
-augmente la vitesse de chromato mais use les colonnes + vite

Question 58

Q

Quel est l’effet du solvant sur la rétention en RPC?

Answer

A

-Le type de solvant en B affecte la sélectivité (α) et la rétention (k)
-possible de faire des mélange de solvant

Question 59

Q

Quel est l’effet du pH sur la rétention en RPC?

Answer

A

-Substances ionisées interagissent peu avec la phase stationnaire hydrophobe, il faut donc changer le pH du tampon lorsque les molécules sont ionisées
-Acides : pH < PKa d’au moins 1-2 unité
-Bases : pH > PKa d’au moins 1-2 unité
-Jouer sur le pH = jouer seulement sur les molécules ionisables, seulement les molécules ionisables qui bougent sur chromato (pH bas = + à gauche, pH haut = + à droite)
-L’effet de petites variations dans le pH de la phase mobile (≈0,2, en log donc gros changement) doit être évalué durant le développement de la méthode

Question 60

Q

Comment bien choisir un tampon en RPC?

Answer

A

-On choisit donc le tampon en fonction du pH qu’on veut pour la phase mobile :
–pouvoir tampon est maximum au pKa (±1 unité)
–50% ionisation = pKa
–20% ionisation ≈ pKa - 1
–80% ionisation ≈ pKa + 1
-Acide phosphorique, diphosphate et monophosphate (pas volatile) sont les plus utilisés en HPLC sans MS (car solubilité limité et précipite) pendant qu’acide formique/acétique + utilisé en MS (volatile)

Question 61

Q

La capacité du tampon est meilleure quand?

Answer

A

-pH phase proche du pKa tampon (<1 unité)
-pH phase différent du pKa de l’analyte (> 1-2 unités)
-concentration du tampon + grande
-volume d’injection petit

Question 62

Q

Le type de colonne impacte quels paramètres?

Answer

A

le type de colonne change α et k

Question 63

Q

En résumé pour la chromatographie de partition en phase inverse (RPC), quels facteurs affectent α, k et N ?

Answer

A

-k : %B, pH de phase mobile
-α: B-solvent, type de colonne et pH de phase mobile
-N : longueur colonne, grosseur particules, débit

Question 64

Q

Quelles sont les stratégies de préparation de l’échantillon pour analyse HPLC,

Answer

A

-Dilution de l’échantillon
-précipitation des protéines (solvant organiques, acideS)
-extraction liquide-liquide
-extraction phase solides (SPE)
-autres (dérivation)

Answer 64

A

-Faible concentration de solvant organique en RPC
-faible concentration de sels en échange d’ions
-pH similaire à la phase mobile (possible de pré-acidifier l’échantillon)

Answer 65

A

Pré-traitement de l’échantillons sérique avec 1-ajout de standard interne, 2-précipitation des protéines avec méthanol et 3-centrifugation
Transfert du surnageant dans un vial HPLC et mise sur l’injecteur automatique
Conditionnement de la colonne (méthanol 100% pour 15mins) (tjrs faire pour reverse phase)
Équilibration de la colonne avec la phase mobile pour 10 mins (30% phosphate et 70%méthanol)
Injection des spécimens
Vérification/impression des chromatogrammes

Answer 66

A

-Préparation et filtration des phases mobiles
-Pré-traitement des échantillons
-Opération du système (Vérification des paramètres de la méthode: volume d’injection, débit, température, etc.)
-Résolution de problèmes mineurs (changer filtres, changer pré-colonne et/ou colonne, détecter cause d’un arrêt)
-Réviser l’intégration des pics (déceler pics anormaux, ex: trainées, épaulement, pics tardifs)
-Imprimer les résultats
-Discussion (coordonateur, biochimiste clinique)

Answer 67

A

-Tous rôles de l’opérateur plus
-Aide aux technologistes opérateurs
-Entretien du système : changement lampe, joints étanchéité de la pompe et valves à bille et correction de fuite
-Maintenir registre d’entretien du système (changement de colonne et pré-colonne)
-Contacter réparation lorsque nécessaire
-Évaluation/validation de nouvelles méthodes (sous supervision du biochimiste clinique)

Answer 68

A

-Révision des résultats (chromatogramme)
-Validation des résultats
-Développement ou validation de nouvelles méthodes
-Préparation des protocoles d’opération normalisés

Answer 69

A

Avantages
-plusieurs analyses sur le même échantillon
-aucun réactif dispendieux
-adaptable rapidement à un nouveau dosage
Désavantages
-Procédé long (prétraitement et temps chromatographique)
-appareillage complexe et coûteux
-entraînement spécial des technologiste

Answer 70

A

-Réservoirs et phases mobiles
–Remplacer les phases et laver les réservoirs
—Phases aqueuses 1 fois par semaine (préférable par jour)
—Phases organiques 1 fois par mois
–Remplacer le filtre de verre fritté (frit) dans les réservoirs aux 6 mois
–Filtrer les phases mobiles à chaque nouvelle préparation

-Tuyauterie et connecteurs
–Inspecter 1 fois par semaine pour déceler des fuites

-Pompes
–Purger pour enlever les tampons après chaque utilisation
–Remplacer les joints d’étanchéité aux 6 mois (ou après 200–300 L de phase)
–Remplacer la valve à bille ou la passer au sonicateur au besoin
–Primer les tubulures avant la pompe avant chaque utilisation pour retirer les bulles

-Injecteur automatique
–Remplacer le joint de l’aiguille aux 6 mois
–Laver l’aiguille chaque jour avant utilisation
–Remplacer le « rotor seal » selon recommandations du manufacturier

-Régulateur de température de colonne (four à colonne)
–Inspecter à tous les jours pour déceler des fuites
–Vérifier la température du four 1 fois par année

-Détecteur
–Remplacer la lampe après 2 000–3 000 heures d’usure
–Inspecter pour déceler des fuites 1 fois par semaine

-Pré-colonnes HPLC
–Remplacer pré-colonne après 500 injections ou lorsque :
–Les pics sont déformés
–La pression est trop élevée

-Colonnes HPLC
–Remplacer colonne après 500–4 000 injections ou si la performance n’est plus acceptable (N ou allure des pics)

-Bacs d’évacuation
–Vider le ou les bacs d’évacuation

Answer 71

A

-Ligne de base qui varie
–Drift
—Colonne mal équilibrée
—Méthode par gradient (normal!)
–Bruit de fond élevé
—Lampe trop vieille
—Cellule du détecteur sale
—Problème de mélange des solvants lors de méthodes par gradient
—Pulsations de pression
—Bulles d’air au détecteur

-Pulsations de pression
–Air dans les lignes de solvant
–Problème d’atténuateur de pulsations
–Problème de valve à bille
–Joints d’étanchéité de la pompe à remplacer

-Pression élevée
–Colonne ou pré-colonne à remplacer
–Filtres bloqués (sortie de la pompe ou avant boucle d’injection)
–Tubulures bloquées

-Changement du tR durant l’analyse
–Tampon insuffisant
–Temps d’équilibration inadéquat entre les injections en gradient
–Mélange des solvants inadéquat
–Problème de la valve à bille
–Échantillon non compatible avec la phase mobile

-Pics larges
–Surcharge de la colonne (quantité ou volume)
–Cellule du détecteur trop grande
–Volume extra-colonne trop grand
–Mauvaise efficacité de la colonne
–Pics tardifs

-Pics fantômes
–Contamination
–Colonne
–Injecteur
–Phases mobiles
–Tubulures en PEEK avec solvants chlorés ou THF

-Pics négatifs
–Absorbance de l’analyte moins grande que la phase mobile à la longueur d’onde sélectionnée
–Au temps mort = fluctuation de l’indice de réfraction (normal)

-Pics dédoublés
–Filtres à l’entrée de la colonne ou pré-colonne bloqué
–Co-élution d’un contaminant
–Problème de phase stationnaire de la colonne (void / chanelling)
–Solvant d’injection incompatible

-Fronting
–Problème de phase stationnaire de la colonne (void / chanelling)
–Solvant d’injection incompatible
–Tampon insuffisant

-Tailing
–Interaction secondaire avec phase stationnaire (ex: silanols libres)
–Dégradation de la colonne
–Filtres bloqués (pompe, colonne, pré-colonne)

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Chromato liquide Flashcards

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