Semaine 5-2/6-1 : Sélection thymique

Question 1

Nommez les 4 sous-populations de thymocytes.

Answer 1

1. DN (précurseurs) : CD4-CD8- CD3- (les plus immatures, précurseurs de tous les autres thymocytes)
2. DP (immatures) : CD4+CD8+CD3 (faible, int, fort) : À cette étape, on commence à tester le TCR pour sa spécificité et sa réactivité. S’il répond adéquatement, il peut continuer sa différenciation vers le prochain stade.
3. CD4SP (matures) : CD4+ CD8- CD3+
4. CD8SP (matures) : CD8+ CD4- CD3+
   Il devient CD4 ou CD8 en fonction de sa restriction au CMH.

Question 2

Quelle population de thymocyte représentent les précurseurs

Answer 2

DN. Ce sont les précurseurs de tous les autres thymocytes.

Question 3

Quelle population de thymocytes sont considérées immatures?

Answer 3

DP.

Question 4

Quelle population de thymocytes sont considérées matures?

Answer 4

CD4SP, CD8SP

Question 5

Nommez les différents points de contrôle et des étapes du développement des lymphocytes T dans le thymus. Dites aussi s’il y a des particularités aux différents points de contrôles ou étapes.

Answer 5

1. Choix T/B : Stade DN1. De plus, au stade DN1 et DN2: Grand nombre de divisions pour augmenter le nombre de précurseurs lymphoïdes qui vont coloniser le thymus.
2. Choix alphabéta ou gammadelta : entre stade DN2 et DN3. Au stade DN2, il y a les réarrangements béta, delta, gamma. Les cellules alphabéta subissent ensuite la béta-sélection, alors que les cellules gamma delta ont d’autres rôles et ne passent pas par la béta-sélection.
3. Béta sélection. On a alors un pré-TCR.
4. Les DN4 vont proliférer et donner des cellules au stade DP.
5. Le cellules au stade DP subissent la sélection + et -, et possèdent un TCR complet, après avoir réarrangé leur chaîne alpha.
6. Choix 4/8. Vers un CD4SP ou un CD8SP.

Question 6

Vrai ou faux. Environ 50% des DP poursuivent leur maturation et vont coloniser les organes lymphoïdes secondaires en tant que cellules T SP.

Answer 6

Faux!!! Seulement 2%. Il y a une grande perte de thymocytes.

Question 7

Quels thymocytes vont mourir pendant la sélection du répertoire des lymphocytes T?

Answer 7

Les lymphocytes T qui expriment un TCR auto-réactif, et les lymphocytes inutiles, donc incapables d’interagir avec les CMHI ou II.

Question 8

Où se produit le développement des LT?

Answer 8

Dans le thymus.

Question 9

Quels progéniteurs peuvent coloniser le thymus et lequel forme les TSP?

Answer 9

Les LMPP et les PLC peuvent coloniser le thymus car ils possèdent les bons récepteurs de chimiokines qui les attirent dans le thymus. On ne sait pas si ce sont les deux qui forment le TSP ou juste un des deux.

Question 10

Vrai ou faux. Les TSP dans le thymus peuvent se différencier en LT seulement.

Answer 10

Faux. Ils peuvent se différencier en LT et LB. Ils ont la capacité de faire les deux, mais on ne voit que des LT dans le thymus.

Question 11

Comment fonctionne Notch au niveau moléculaire? Expliquez ce qui se passe s’il y a un signal Notch, et s’il n’y en a pas.

Answer 11

L’engagement de Notch avec son ligand mène à un clivage de la portion intracellulaire de Notch (Notch-IC) qui va migrer au noyau et s’associer avec RBPJ-kappa, un répresseur transcriptionnel. Il peut donc y avoir transcription des gènes impliqués dans le choix de différenciation.

Si pas de signal Notch : RBPJ-kappa est lié à l’ADN et empêche la traduction des gènes cibles.

Question 12

Notch: membranaire ou cytoplasmique?

Answer 12

Membranaire à la surface.

Question 13

Notch : Conservé ou pas?

Answer 13

Conservé de l’oursin de mer à l’humain

Question 14

Notch: Qu’est ce qu’il influence?

Answer 14

Le choix du lignage
L’apoptose
La prolifération

Chez les Lymphocytes, c’est surtout le choix du lignage.

Question 15

Quel est le rôle du signal Notch, et comment peut-il agir?

Answer 15

Affecte le choix de différenciation de progéniteurs bi-potents. Il peut agir par inhibition latérale ou induction.

Question 16

Pour la moelle osseuse et le thymus, dites si Notch est activé, si les ligands sont présents, et quel type de lymphocytes sont produits. Si Notch n’est pas activé, dites pourquoi.

Answer 16

Thymus :

• Notch Actif sur les précurseurs lymphoïde
• Ligands présents sur l’épithélium thymique
• LT produits.

Moelle osseuse :

• Notch inactif
• Ligands présents
• LB produits.
• Notch est inactifs probablement à cause de facteurs inhibiteurs de Notch ou précurseurs qui ne sont pas au même endroits que les ligands.

Question 17

Si on fait une expérience et qu’on exprime une forme constitutive de Notch , qu’est ce qu’on pourra observer?

Answer 17

Un gain de fonction, générant des LT et non des LB dans la moelle osseuse.

Question 18

Si on fait une expérience et qu’on fait un KO-Notch, qu’est ce qu’on pourra observer?

Answer 18

On pourra observer qu’il n’y a plus de LT dans le thymus, mais bien des LB.

Question 19

Si on a des souris transgéniques qui surexpriment des molécules inactivant Notch (Lunatic Fringe ou Deltex), qu’est ce qu’on pourra observer?

Answer 19

Une absence de LT.

Question 20

Après l’engagement dans la lignée T, quelle type de cellules deviens le LT, et qu’elles sont ses premières actions?

Answer 20

Elle deviens une cellules DN1, et va proliférer. Elle va aussi modifier son programme transcriptionnel pour devenir un thymocyte.

Question 21

Expliquez comment les cellules DN2 peuvent choisir entre l’expression d’un TCR gamma delta ou pré-TCR?

Answer 21

Tout d’abord, les réarrangements des différentes chaînes sont concomitants, et on peut ainsi voir des réarrangements béta dans les chaînes gamma delta et des réarrangements gammadelta dans le préTCR. Premièrement, on teste si les réarrangements produits sont fonctionnels. Le premier qui se forme, ou bien si ce sont les deux en même temps, gamma delta sera exprimé. Les signaux sont différents, et lorsqu’ils montent à la surface et se joignent à CD3, le signal sera différent, et la cellule saura que la cellule appartient à une lignée ou l’autre. Notamment, le signal intracellulaire est beaucoup plus fort dans le cas de gamma delta, et donc la voie MAPK-Erk est activée fortement, et la cellule sait qu’elle est dans la voie gamma-delta. À l’inverse, le signal pour le pré-TCR est beaucoup plus faible, et engendre une faible activation d’Erk, l’engageant dans la lignée alpha-béta. Il faut également noter que quand une cellule T s’engage dans une voie, elle arrête l’expression de l’autre. Donc, quand le TCR gamma delta émet un signal avec CD3, elle arrêtera l’expression de la chaîne béta du pré-TCR, et vice-versa. S’il y a un réarrangement de la chaîne alpha, le locus delta sera délété.

Question 22

Quels seront les destins des différents types de TCR (gamma delta ou pré-TCR) sélectionnés après le deuxième point de contrôle.

Answer 22

Gamma delta : se dirige en périphérie.

pré-TCR : subit la béta-sélection.

Question 23

Vrai ou faux. Les LT gamma delta subissent la béta-sélection.

Answer 23

faux.

Question 24

Discutez du développement séquentiel des différents types de cellules T gamma delta.

Answer 24

Durant le développement foetal, on exprime tout d’abord le gène Vgamma 5 dans le locus gamma delta. Ce sont des cellules monoclonales, et ils colonisent l’épiderme.
Par la suite, arrêt de la production de Vgamma5, et production de Vgamma 6. Même principe, toutes les cellules sont monoclonales et ont le même réarrangement. Ce sont des cellules T de l’épithélium reproductif.
Dès la naissance, les cellules deviennent polyclonales. En effet, il y a un développement concomitant des LT gamma delta et alpha beta. On produit donc encore des gamma delta, mais plus Vgamma5 ou 6. ce seront d’autres types qui vont coloniser l’épithélium intestinal surtout.

Question 25

Discutez des évènements moléculaires qui se produisent lors de la béta-sélection, jusqu’à la formation de molécules DP avec un TCR fonctionnel et complet.

Answer 25

1. La chaîne béta est réarrangée avant la béta-sélection, lors du point de contrôle précédent . La chaîne béta est réarrangée grâce à la phosphorylation et dégradation de RAG2, qui permet l’expression d’un seul allèle fonctionnel de Béta (exclusion allélique). Comme la chaîne béta a 2 locus, elle a deux chances d’obtenir un réarrangement productif, qui arrive dans 55% des cas. Lorsque le pré-TCR complet est exprimé à la surface, il s’oligomérise (aggrégation) de manière spontannée en absence de ligands. Il y a ensuite transmission des signaux intracellulaire via CD3, et internalisation de l’oligomère.
2. Ce signal du pré-TCR provoque l’expression transitoire du FT Egr3, qui induit l’expression du FT ID3, qui induit la prolifération des thymocytes. ID3 inhibe RORgammaT. Il y a donc changement des DN3 vers le stade DP.
3. Il y a une diminution de la signalisation pré-TCR, car arrêt de la transcription de préTalpha pendant la phase de prolifération. Il y a donc une diminution de Egr3, ce qui augmente RORgammaT. Cela a pour effet :
   - Augmenter l’expression de Cpeb4 ce qui arrête le cycle cellulaire
   - Augmente l’expression de Rag2 qui réarrange la chaîne alpha du TCR.
   - Augmente Bcl-Xl qui promeut la survie des thymocytes qui ont subit la béta-sélection.

La prolifération a pour but d’augmenter le nombre de TCR qui vont tester les chaînes alpha. Quand une chaîne alpha testée reçoit un signal de sélection +, il y a arrêt des processus de réarrangements et un TCR complet.

Question 26

De quoi est composé le pré-TCR? Est-ce que certaines d’entre elles sont facultatives?

Answer 26

Chaîne béta
Chaîne préT-alpha invariable
CD3

Toutes les chaînes doivent être présentes pour que le pré-TCR soit exprimé et puisse transmettre un signal.

Question 27

Vrai ou faux. Chaque locus alpha a une seule chance d’être réarrangé pour générer une chaîne alpha fonctionnelle.

Answer 27

Faux! Le locus peut subir de nombreux réarrangements pour assurer le production d’une chaîne alpha fonctionnelle. Au début, plus tendance à associer des 3’V et 5’J. Si il n’y a pas de sélection +, le locus peut recommencer le réarrangement avec ses autres gènes. Plus que 2 chances de réarrangements.

Question 28

Comment a-t-on pu démontrer la restriction par le CMH durant la sélection positive?
Est-ce que les cellules dendritiques contribuent à la sélection positive?

Answer 28

On fait un transfert de moelle osseuse CMHaxb dans des souris receveuses irradiées CMHa ou b sur l’épithélium thymique, qui n’est pas irradié car il n’est pas d’origine hématopoiétique. Donc, les LT des souris receveuses CMHa vont seulement être capables de reconnaître un Ag infectieux quand présenté par un CPA de CMHa. Même chose pour un CMHb. Donc, démonstration que la restriction par le CMH s’effecturait dans le thymus, par des cellules épithéliales.

La moelle osseuse greffée contribue à la reconstitution thymique des macrophages et DC, donc les DC sont de phénotype axb et même chose pour les macrophages. Les thymocytes DP restent dans le thymus tant qu’ils n’ont pas reçu un signal de sélection +. Après ce signal, il pourra interagir avec la jonction cortico-médullaire et atteindre la médulla. Les DC ne sont pas dans le cortex, et donc ne contribuent pas à la sélection positive.

Question 29

Comment peut-on identifier les DP ayant reçues un signal de sélection positive?

Answer 29

• Gain de l’expression CD69 (marqueur d’activation)
• Augmentation du niveau d’expression du TCR
• Augmentation de l’expression de CD5
• Diminution de l’expression de CD8 (CD4+Cd8int)

Question 30

Par quoi est dicté le choix du co-récepteur CD4 ou CD8?

Answer 30

Par la sélection positive.

Question 31

Qui médie la sélection négative dans le thymus?

Answer 31

Les cellules dendritiques, ou les cellules hématopoïétiques.

Question 32

Vrai ou faux. La sélection négative a toujours lieu au stade DP, au niveau de la jonction cortico-médullaire.

Answer 32

Faux. Elle peut avoir lieu à ce niveau, mais aussi au stade SP, dans la médulla.

Question 33

Comment le processus de sélection négative n’élimine pas tout le répertoire sélectionné par la sélection +? Nommez les deux mécanismes, sans entrer dans les détails.

Answer 33

Il n’est pas possible qu’ils aient des critères identiques, sinon activité futile.

1. Différence d’avidité (quantitatif) menant à un signal différent
2. Utilisation de peptides différents.

Question 34

Comment est-ce qu’une différence d’avidité peut mener à un signal différent entre la sélection + et sélection -?

Answer 34

Lors d’une expérience, il a été remarqué qu’une faible quantité de peptide (faible affinité ou avidité) mène à la sélection positive, alors qu’une forte quantité de peptide (affinité ou avidité) mène à la sélection négative. Le TCR doit alors transmettre un signal à la cellule, qui doit le lire et savoir exactement si elle doit effectuer la sélection positive ou négative. La voie MAPK a un rôle important à jouer ici, principalement erk, qui contrôle les réponses des stimulis extracellulaires provenant du TCR. Dans le cas de la sélection positive, ERK est activé de manière lente et soutenue, alors que dans la sélection négative, erk est activé de manière transiante et forte.
Cela se fait car selon la quantité ou la qualité du ligand, la molécule adaptatrice LAT est phosphorylée partiellement (Sélection +) ou complètement (sélection -). La phosphorylation partielle de LAT mène à una activation lente et courte de la phospholicpase C, donc une accumulation lente et soutenue de DAG, qui recrute ras-GRP au Golgi, qui à son tour va activer erk de manière lente et soutenue, menant à un signal de survie à la cellule.
Si la phosphorylation est complète de LAT, cette dernière va recruter la PLC de façon stable, et ses résidus phosphorylées vont recruter Grb2/SOS, ce qui va provoquer l’activation forte et transiante de Erk et un signal de mort cellulaire ou apoptose

Question 35

Discutez des peptides utilisés lors de la sélection positive, pour les différencier des peptides utilisés lors de la sélection négative.

Answer 35

Les peptides exprimés lors de la sélection positive et négative sont différents, et peuvent ainsi contribuer à distinguer la sélection + et -. Les cellules épithéliales corticales du thymus expriment différentes protéases qui permettent de créer un répertoire différent de peptides spécifiques à la sélection positive. Ces protéases sont seulement exprimées par les cellules épithéliales corticales du thymus, et sont donc spécifiques à la sélection positive, car les cellules épithéliales de la médulla ou les DC médiant la sélection négative n’expriment pas ces protéases.

En ce qui concerne les CMH1, une nouvelle sous unité du protéasome a été découverte, et modifie la composition en peptides du CMH1 exprimé par les cellules épithéliales corticales du thymus : B5t. En inactivant ce dernier, on a un défaut de sélection positive et moins de CD8SP, suggérant que ce sont des peptides distincts qui sont exprimés par les cTEC pour avoir la sélection positive.

Dans le cas du CMH2, les cTEC expriment la cathepsine L au lieu de la cathepsine D, ce qui influence le répertoire de peptides retrouvé dans les CMH2. Il y a aussi expression spécifique de TSSP, qui contribue à la formation de peptides nécessaires pour la sélection positive des TCD4

Question 36

Quel facteur de transcription contrôle l’expression ectopique des Ag restreints aux tissus périphériques ?

Answer 36

AIRE.

Question 37

Quels sont les deux mécanismes de sélection négative?

Answer 37

Présentation directe par les cellules épithéliales de la médulla
Transfert d’Ag aux cellules dendritiques.

Question 38

Comment le thymus peut médier la tolérance au soi périphérique? Discutez des 3 méthodes.

Answer 38

1- En plus de présenter les Ag ubiquitaires et circulant, Le soi périphérique est représenté dans le thymus par les cellules épithéliales médullaires et serait capable d’induire la sélection négative. En effet, on observe jusqu’à 3000 gènes différents exprimés dans ces cellules. Par contre, ce ne sont pas tous les Ag qui sont exprimés par toutes les cellules épithéliales; ils sont bien souvent regroupés en amas. Ainsi, on croit que les thymocytes balaient les cellules épithéliales, et doivent en voir environ 100 pour voir tous les Ag. Ils resteraient donc environ 1 semaine dans la médulla au stade SP et bougent beaucoup dans la médulla. Il y a aussi eu identification que ce serait le facteur de transcription AIRE qui médierait l’expression ectopique d’antigènes restreints aux tissus périphériques dans le thymus. Une absence de ce gène causerait la maladie APS-1, qui est une maladie auto-immune multi-organe. La sélection négative pourrait être faite par présentation directe des Ag du soi par les cellules épithéliales de la médulla, ou même par un transfert d’Ag aux cellules dendritiques. Par contre, AIRE ne peut pas récapituler ‘expression de tous les Ag. Il en fait une bonne partie, mais pas tous.

2- Il y a aussi un apport des Ag du soi au thymus par les DC plamocytoïdes périphériques. Ils vont induire la tolérance envers les Ag du soi dans le thymus. Cette fonction est perdue quand les DC s’activent, c’est à dire en condition d’infection, car on ne veut pas induire la tolérance envers des agents infectieux.

3- Le thymus, en plus de faire la sélection positive et négative, peut créer des Treg, qui sont capables d’empêcher la réponses des LT auto-réactifs en périphérie. Ces Treg expriment le FT FoxP3, qui les différencient. Ils sont restreins aux CMH2, et sont sélectionnés par des interactions de plus forte affinité que la sélection négative, mais plus faible que la sélection négative. C’est donc une force de signal intermédiaire.

Question 39

Expliquez comment se fait le choix entre le co-récepteur CD4 ou CD8?

Answer 39

On doit s’assurer que notre thymocyte qui sort des organes lymphoïdes secondaires avec un TCR réarrangé, restreint au CMH et non-autoréactif choisisse le bon co-récepteur à exprimer à la surface, selon la restriction au CMH du TCR. Après une interaction entre le TCR et le CMH, il y a toujours une diminution de l’expression de CD8. Selon la force du signal reçu, il va ainsi savoir à quel CMH il est restreint et quel co-récepteur il doit exprimer. Si le thymocyte est restreint au CMH, le signal qu’il reçoit va arrêter, et sera de courte durée. Ainsi, il va perdre l’expression de CD4 et gagner de manière permanente celle de CD8. Si le thymocyte est plutôt restreint au CMH2, le signal reçu sera pareil. Le thymocyte va alors perdre de manière définitive l’expression de CD8 et devenir un thymocyte Cd4SP.

Question 40

Quelles expériences ont permis de démontrer la présence de la sélection négative?

Answer 40

1- La première expérience démontre que ce sont les cellules hématopoïétiques comme les DC dans la médulla ou la jonction cortico-médullaire qui médient la sélection négative, et non pas les cellules épithéliales du cortex comme la sélection positive. Donc, premièrement, de la moelle d’une souris CMH axb a été greffée dans une souris CMHa irradiée. Les cellules épithéliales du thymus demeurent CMHa, puisque ce ne sont pas des cellules hématopoïétiques et elles ne sont donc pas irradiées. Les cellules DC par contre elles ont des CMH axb, provenant de la greffe de moelle osseuse. On greffe ensuite à cette même souris un morceau de peau CMHb. On observe que la greffe n’est pas rejetée, alors qu’une souris de type CMHa rejetterait normalement la greffe par une allo-réponse. Ceci nous indique donc que ce sont les DC CMH axb qui ont permis l’élimination par sélection négative des LT exprimant un LT exprimant un TCR allo-réactif pour CMHb. Il faut toutefois bien comprendre que le répertoire de cellules T sélectionnée sera restreint au CMHa, car la sélection positive a lieu dans le cortex par les cellules épithéliales thymique CMHa. Par contre, il se peut que certains LT soient allo-réactifs envers le CMHb. Dans ce cas, les DC s’occuperont de les éliminer. Le répertoire est donc non-autoréactif envers les CMHa et b.
2- La deuxième expérience démontre l’existence de la sélection négative. On utilise des souris transgéniques pour un TCR, et donc toutes les souris vont exprimer le même TCR. Ce TCR choisi est restreint par le CMH I Db et reconnaît l’Ag HY, présent comme Ag du soi chez les souris mâles. Les souris femelles ne possèdent par cet Ag. La production de cellules DN semble normale, et celle de DP aussi. De plus, ils vont former quelques cellules SPCD4, et beaucoup de SPCD8. Par contre, chez les mâles, il n’y a pas de formation de SPCD8, car ils ont une forte affinité pour leur ligand qui est un Ag du soi, et vont donc être sélectionnés négativement. De plus, on peut remarquer qu’il y a moins de cellules DP chez les souris mâles que femelles, témoignant que les thymocytes commencent déjà à mourir à ce stade.

Question 41

Comment peut-on suivre le développement des thymocytes?

Answer 41

Grâce à l’expression de molécules de surface aux différents stades de leur développement (DN, DP, SPCD8 ou SPCD4). On peut le suivre par cytométrie de flux.

Question 42

Expliquez comment le répertoire de LT est sélectionné (brièvement)

Answer 42

Le répertoire est sélectionné lors du développement des lymphocytes T dans le thymus. Une élimination des T exprimant un TCR auto-réactif et la survie des T exprimant un TCR capable d’interagir avec le CMH du soi permet de sélectionner le bon répertoire. Les cellules auto-réactives ou incapables d’interagir avec un CMH du soi meurent par apoptose.

Question 43

Expliquez comment entrent les progéniteurs hématopoïétiques qui colonisent le thymus, ainsi que leur provenance. Indiquez si ces progéniteurs sont capables de faire des LB ou des LT, et ce que nous observons.

Answer 43

Il n’y a pas de résidents permanents de progéniteurs dans le thymus. Il faut donc un influx constant de ces progéniteurs dans le thymus, et on estime ce nombre à environ 10 par jour. Les progéniteurs qui colonisent le thymus se nomment TSP, et ils sont recrutés de la moelle vers le sang, pour ensuite entrer dans le thymus. Dans le moelle osseuse, les CSH forment des MPP, qui forment ensuite des LMPP ainsi que des PLC. Ce sont seulement les LMPP et les PLC qui peuvent devenir des TSP dans le thymus. Ils possèdent notamment les bons récepteurs aux chémokines qui vont les attirer vers le thymus. On ne sait pas lequel des deux compose les TSP, ou si ce sont les deux.

Les TSP ont la capacité de devenir des LB ou des LT. Par contre, ils ne deviennent que des LT dans le thymus. La production de LB est réservée à la moelle osseuse.

Question 44

Décrivez une expérience qui permettrait de démontrer le rôle de Notch dans le choix LT/LB.

Answer 44

On peut moduler l’activité de Notch.
En exprimant constitutivement Notch sur les PLC, on a un gain de fonction et un développement de cellules T et pas de cellules B dans la moelle osseuse.
Par contre, si on inactive complètement Notch, on a une délétion de Notch sur les PLC et donc pas de LT dans le thymus mais bien des LB.

Certaines souris transgéniques qui surexpriment des molécules inactivant Notch (Lunatic Fringe ou Deltex) ne forment pas de lymphocytes B dans le thymus.

Question 45

Comment les immunologistes ont-ils créés un modèle de développement T in vitro?

Answer 45

L’identification de Notch a permis de développer un modèle simple d’étude des LT in vitro. On a simplement a transfecter le ligand Notch DL-1 dans une lignée de cellules stromales de la moelle osseuse, et on peut récapituler le développement T in vitro en absence de thymus. On peut aussi utiliser ces progéniteurs T in vitro pour reconstituer le développement thymique in vitro lors de la greffe de moelle osseuse.