Sélection thymique Flashcards
1
Q
Reconnaissance cellule T et CPA
A
- réarrangement aléatoire des segments du gènes du RCT crée une très grande diversité de RCT
- mode de reconnaissance: fragment peptidique d’un antigène protéique en association avec une molécule de classe I ou II du CMH: RESTRICTION par le CMH
- chaque individu exprime certains allèles du CMH
- la cellule T doit simultanément engager le RCT et le co-récepteur (CD4 ou CD8) avec le complexe peptide-CMH
- les peptides du soi sont aussi chargés sur les molécules de classe I ou II du CMH
- peptides du soi ou dérivés de l’agent infectieux
2
Q
Sélection thymique : schéma simplifié
A
- restriction par le CMH de la reconnaissance antigénique
- reconnaissance du non soi dans le contexte du soi
- risque d’auto-réactivité (maladies auto-immunes)
- risque d’inutilité (réarrangement non productif donne protéine non fonctionnelle donc pas de RCT)
- éducation thymique
- répertoire de cellules T utiles et non auto-réactives
3
Q
Sélection du répertoire
A
- lors du développement des lymphocytes T dans le thymus
- élimination des lymphocytes T exprimant un RCT auto-réactif
- survie des lymphocytes T exprimant un RCT capable d’interagir faiblement avec les molécules de classe I ou II du CMH du soi (restriction au CMH)
- mort des lymphocytes T ayant un RCT incapable d’interagir avec les molécules de classe I ou II du CMH ou qui n’ont pas de RCT
4
Q
Développement des thymocytes
A
- 4 sous-populations principales de thymocytes
- DN : CD4-CD8-CD3-
- DP: CD4+CD8+CD3faible, int, fort
- CD4SP ou SD8SP (CD4+ ou CD8+, CD3+)
- quand on sort du thymus ce sont des lymphocytes T
5
Q
Points de contrôle du développement des lymphocytes T dans le thymus
A
- choix T ou B
- choix alpha beta ou gamma delta (fonction différente)
- sélection + ou -
- choix 4 ou 8
- les cellules DN1 et DN2 font environ 6 à 10 divisions, essentiel afin d’augmenter le nombre de précurseur lymphoïdes
- très peu de progéniteurs (précurseurs) colonisent le thymus et le développement T crée une grande perte de thymocytes
- DN2: présence de réarrangement gamma, delta et D-Jbeta
- les DPs peuvent aussi donner d’autres types cellulaires que les cellules T CD4 et CD8 conventionnels
- ceux-ci incluent les cellules NKT, les CD8alapha-alpha IEL, les CD8alpha-beta IEL et les CD4+CD25+ régulatrices
- ces étapes de différenciation prennent 3 semaines chez la souris
- seulement 2% des thymocytes DP vont poursuivre leur maturation et coloniser les organes lymphoïdes secondaires en tant que cellules T simple-positive.
6
Q
Points de contrôle du développement des lymphocytes T dans le thymus : schéma
A
- diapo 8
7
Q
Organisation cellulaire du thymus
A
- cortex: thymocytes DN et DP, cellules épithéliales corticales, macrophages (phagocyter les thymocytes qui N’ont pas survécus)
- jonction corticomédullaire: entrée des précurseurs hématopoïétiques, cellules dendritiques, thymocytes DP (en cours de devenir SP)
- médulla: thymocytes SP, cellules épithéliales corticales et cellules dendritiques, thymocytes CD4SP et CD8SP
- les cellules T matures quittent la médulla pour coloniser les organes lymphoïdes secondaires
- la zone corticale contient une plus grande densité de thymocytes que la médulla
- cellules d’origine hématopoïétiques: précurseurs, thymocytes, macrophages, cellules dendritiques
- les cellules épithéliales corticales et médullaires expriment les molécules de classe I et II du CMH (ainsi que les cellules dendritiques et les macrophages)
- les molécules de classe I et II du CMH sont chargées avec des peptides du soi.
8
Q
Les précurseurs lymphoïdes qui colonisent le thymus proviennent de la moelle osseuse
A
- les progéniteurs/précurseurs hématopoiétiques qui colonisent le thymus peuvent se différencier en lymphocytes T et B (et même en cellules de la lignée myéloide)
- le développement continu des cellules T dans le thymus nécessite une entrée continuelle des progéniteurs T dans le thymus (pas de cellules souches hématopoïétiques résidant dans le thymus)
- les progéniteurs qui colonisent le thymus (TSP) sont recrutés de la moelle vers le sang et du sang entre dans le thymus
- seulement les LMPP et les CLP sont capables de coloniser le thymus; par contre on ne sait pas lequel de ces progéniteurs représentent réellement les TSP.
- on estime à 10 le nombre de TSP qui entrent dans le thymus à tous les jours
- HSC devient MPP devient LMPP devient CLP dans la moelle osseuse
- va dans la circulation sanguine vers le thymus
9
Q
Pourquoi observons-nous-nous seulement du développement T dans le thymus?
A
- l’environnement thymique fournit un signal instructif aux progénitures hématopoïétiques afin qu’ils se différencient en lymphocytes T
10
Q
Voie de signalisation Notch
A
- récepteurs et ligands de surface
- très conservée de l’oursin de mer à l’humain
- rrégule le développement d’un très grand nombre de types cellulaires
- iinfluence entre autres
- choix de différenciation de progéniteurs bipotents
- maintien des cellules souches
- apoptose
- prolifération
11
Q
Notch régule la transcription de gènes cibles
A
- l’interaction de Notch avec son ligand provoque le clivage de Notch, Notch clivé ou intracellulaire (Notch-IC) peut maintenant aller dans le noyau
- au noyau Notch-IC va se lier à un répresseur transcriptionnel RBP-Jk, ce nouveau complexe pourra maintenant induire l’expression de nouveaux gènes impliqués dans le programme de différenciation
- si il n’y a pas de signal Notch, il n’y aura pas de T
12
Q
L’activation de Notch dans les progénitures lymphoïdes communs contrôle le choix de différenciation T et B
A
- Notch et les ligands de Notch sont exprimés dans le thymus
- les progéniteurs lymphoïdes expriment Notch
- l’épithélium thymique expriment les ligands de Notch
- dans la moëlle osseuse les ligands de Notch sont présents, les progéniteurs lymphoides n’activent pourtant pas Notch
- probablement parce qu’il y a des facteurs régulant de façon négative Notch ou parce que les précurseurs ne sont pas localisés aux endroits ou les ligands de Notch sont présents
13
Q
Quelle approche expérimentale permettrait de démontrer le rôle de la voie de signalisation Notch dans l’engagement des progéniteurs lymphoïdes vers la lignée T?
A
- Notch knockout
- pas de souris
14
Q
La modulation de l’activité de Notch permet
le développement T dans la moelle osseuse ou
le développement B dans le thymus
A
- évidences expérimentales du rôle de Notch
- à gauche: expression d’une forme constitutivement active de Notch (NOTCH clivé ou intracellulaire), gain de fonction, on aperçoit le développement de cellules T et non de cellules B dans la moelle osseuse.
- à droite: inactivation conditionnelle de Notch, délétion de Notch dans les précurseurs lymphoïdes, provoque l’absence de développement T dans le thymus qui est accompagné par la présence de développement B dans le thymus.
- souris transgéniques qui surexpriment des molécules inactivant Notch (tel que Lunatic fringe ou Deltex) n’ont pas de développement de lymphocytes T, aussi accompagné par la présence de développement B dans le thymus
15
Q
Modèle de développement T in vitro
A
- depuis longtemps les immunologistes possédaient un modèle simple pour le développement B in vitro
- par contre, aucun modèle similaire n’existait pour le développement T, le développement T nécessitait toujours la présence d’une architecture thymique
- le modèle le plus simple était les FTOC (fetal thymic organ culture qui consiste à cultiver des lobes thymiques d’embryons) mais pas si facile…
- l’identification de Notch comme étant le joueur clé pour le choix de différenciation vers la lignée T au lieu de la lignée B a permis de développer un modèle simple d’étude du développement T in vitro
- la transfection du ligand de Notch, Delta-like 1, dans une lignée de cellules stromales (n’expriment pas Notch) de la moëlle osseuse (utilisée pour le développement B in vitro) a permis de récapituler le développement T in vitro en absence de thymus.
- CD19, identifie les cellules B
- NK1.1 identifie les cellules NK
- CD4/CD8 identifie les thymocytes
- ce modèle est aussi très efficace pour générer des progéniteurs T in vitro pour être utiliser afin de reconstituer le développement thymique in vivo lors de greffe de moëlle osseuse
- dans le thymus, ce sont les cellules épithéliales corticales qui fournissent le signal Notch via l’expression du ligand Delta-like 4
- les progéniteurs lymphoïdes expriment le récepteur Notch1
16
Q
Lymphocytes T gamma delta
A
- expriment un RCT composé d’une chaîne gamma et delta (associé au complexe CD3)
- les chaînes gamma et delta sont générées suite la recombinaison V-D-J au locus g et d
- absence de restriction au CMH (peuvent reconnaitre d’autres ligands comme des molécules de stress)
- colonisent principalement les épithelium
- les réarrangements de la chaine b, g et d ont lieu simultanément au stade DN3
RCT, récepteur spécifique des cellules T (aussi abbrévié TCR) - les segments de gènes Valpha et Vgamma sont inter-dispérsés au sein de la même région chromosomique
- fonctions des LT gd
- surveillance de l’environnement des épithélium
- empêcher la dissémination des agents infectieux et des cellules tumorales
- réparation tissulaire suite à une infection
17
Q
Choix de devenir un lymphocyte T alpha beta ou gama delta se fait au stade DN à partir d’un précurseur commun
A
- présence de réarrangement b dans les lymphocytes T gd
- présence de réarrangement g dans les lymphocytes T ab (80% sont hors phase)
- se fait simultanément
- s’accompagne de la délétion du locus delta du RCT
- la signalisation via le RCT gamma-delta va arrêter l’expression de la chaîne beta du RCT ainsi que les autres réarrangements
- la signalisation via le pré-RCT arrête l’expression du RCT gamma-delta et permet le réarrangement de la chaîne alpha du RCT
- le réarrangement de la chaîne alpha du RCT provoque la délétion du locus delta du RCT (puisqu’il est situé entre les segments de gènes V et J du locus alpha du RCT)
- le développement gamma-delta est indépendant de Notch à ce stade tandis que le signal Notch est requis pour la différenciation des DN3 vers la lignée alpha-beta (génération de DP)
- la signalisation via le pré-RCT mène à la beta-sélection.
18
Q
Choix alpha beta versus gamma delta : force du signal : évidences expérimentales
A
- variation de la quantité de ligand pour le RCT gd
- diminution de la force du signal transmis par le RCT gd (mutation molécules de signalisation)
- plus de pERK, pZAP-70 et CD5 dans DN-gd vs DN-pré-RCT
- le RCT gd est plus fortement exprimé que le pré-RCT
- l’expression d’un RCT gd par les thymocytes va mener à la transmission d’un signal intracellulaire fort par le RCT gd
- ce signal fort mène à une forte activation de la voie de signalisation MAPK-Erk
- ceci permet au thymocyte de savoir qu’il doit se différencier en lymphocytes T gd
- l’expression du pré-RCT mène à la transmission d’un signal faible (faible activation de Erk) qui dirige le thymocyte vers la lignée ab et l’amène à se différencier en thymocyte DP.
19
Q
Développement séquentiel des différents types de cellules T gamma delta
A
- cellules T dendritiques de l’épidermme (Vgamma5), monoclonales
- cellules T de l’épithélium reproductif (Vgamma6), monoclonales
- polyclonales
- vagues de différenciation (Vgamma5, puis Vgamma6, etc)
20
Q
B-sélection : conséquence du choix de différenciation alpha beta des thymocytes DN3
A
- la beta-sélection est la conséquence du choix de différenciation alpha/beta versus gamma/delta lorsque le thymocyte exprime un pré-RCT (chaine beta du RCT associé à la chaine invariable pré-Talpha)
21
Q
Réarrangement alphabeta et développement des lymphocytes T
A
- pré- RCT -> phosphorylation et dégradation de RAG-2, diminution de la transcription Rag1 et Rag-2 -> exclusion allélique et prolifération ->chaine beta s’associera avec différentes chaines alpha
- si le premier réarrangement de la chaine beta n’est pas productif (en phase de lecture sans codon stop), il peut y avoir un deuxième réarrangement au même locus puisque les segments D, J et C sont dupliqués
- la résultante de la beta-sélection est la génération d’une grande quantité de thymocytes DP possédant un réarrangement en phase de la chaine beta du RCT (codant pour une protéine fonctionnelle)
- à ce stade la chaine pré-Talpha n’est plus exprimée
- les DP qui sont produits suite à la beta-sélection ont un réarrangement productif de la chaine beta du RCT, n’exprime plus le pré-RCT et ne prolifèrent plus.
22
Q
Beta-sélection : conséquence de la signalisation ligand-indépendante du pré-RCT
A
- la transmission des signaux via le pré-RCT s’effectue suite à l’oligomérisation spontanée du récepteur à la surface des thymocytes et ce en absence de ligand
- ceci provoque l’internalisation du pré-RCT
- l’oligomérisation (agrégation) du pré-RCT mène à la transmission des signaux intracellulaires via les chaines du complexe CD3
- le pré-RCT est composé de la chaine beta du RCT, de la chaine invariable pré-Talpha et du complexe CD3
- toutes les chaines doivent être présentes afin que le pré-RCT puisse être exprimé à la surface cellulaire et transmettre un signal.
- le signal via le pré-RCT provoque l’expression transitoire du facteur de transcription Egr3
- Egr3 induit l’expression du facteur de transcription Id3 qui induit la prolifération des thymocytes DN3
- Id3 inhibe l’expression de RORgammat
- suite à la diminution d’expression de Egr3, l’expression de RORgt est induite à nouveau
- l’expression de RORgt augmente l’expression de:
1) Cpeb4 qui provoque l’arrêt du cycle cellulaire
2) RAg-2 qui permet le réarrangement de la chaîne alpha du RCT
3) Bcl-Xl qui promeut la survie des thymocytes ayant subit la beta-sélection - la diminution de l’expression de Egr3 est provoquée par l’arrêt de la signalisation du pré-RCT qui résulte de l’arrêt de la transcription de la chaine pré-Talpha pendant la phase de prolifération
23
Q
Contribution possible des molécules du CMH en tant que ligand pour le pré-RCT
A
- permet d’interagir avec des molécules de CMHI
-pourrait influencer la différenciation
24
Q
Schéma résumé choiz alpha beta ou gamma delta
A
- diapo 30
25
Q
Locus RCT alpha
A
- subit de multiples réarrangements afin d’assurer la production d’une chaîne a fonctionnelle (en phase et «sélectionnable»)
- l’expression d’une deuxième chaine alpha n’est pas grave puisque la première n’avait pas permis la survie/différenciation
- si autoréactive sera éliminée lors de la sélection négative
- l’arrêt du réarrangement n’a lieu que lorsque le thymocyte reçoit un signal de sélection positive
- cette phase dure environ 3-4 jours
26
Q
Sélection positive : restriction par le CMH : expérience
A
- transfert de moëlle osseuse MHCaxb dans des souris receveuses irradiées de génotype MHCa ou MHCb
- les souris receveuses expriment donc soient le CMHa ou le CMHb sur leurs cellules épithéliales thymiques
- les lymphocytes T des souris receveuses MHCa vont seulement être capable de reconnaître les épitopes du virus LCMV ou d’autres agents infectieux seulement lorsque ces antigènes sont présentés par des CPA de CMHa
- les cellules T des receveuses MHCb répondront seulement aux CPA MHCb
- ces expériences ont démontré que la restriction par le CMH, sélection positive, s’opérait dans le thymus et ce par les cellules épithéliales thymiques
- il ne faut pas oublier que la moelle osseuse greffée MHCaxb contribuera à la reconstitution thymique des macrophages et des cellules dendritiques
- les thymocytes DP sont dans le cortex tant qu’ils ne reçoivent pas un signal de sélection positive
- suite à la sélection positive, le thymocyte recevra un signal de migration et traversera la jonction-corticomédullaire avant de rejoindre la médulla
- même si les cellules dendritiques qui seront reconstituées par le greffe de moelle osseuse expriment aussi bien le CMH A et B, ces cellules ne peuvent pas contribuer à la sélection positive (puisque les thymocytes qui n’ont pas encore subi la sélection positive sont dans le cortex et qu’il n’y a pas de cellules dendritiques dans le cortex)
27
Q
Identification des DP ayant reçues un signal de sélection positive
A
- gain de l’expression de CD69 (marqueur d’activation)
- augmentation du niveau d’expression du RCT
- augmentation de l’expression de CD5
- diminution de l’expression de CD8 (CD4+CD8int)
28
Q
Régions V des chaines alpha et beta du RCT possèdent une spécificité inhérente pour les molécules du CMH
A
- culture d’organe thymique
- lobe thymique jour 16 gestation (DN)
- souris CMH de classe I et II déficientes
- ajout Ac dirigés contre la chaine beta du RCT et contre le co-récepteur CD4 pour mimer la sélection positive
- sélection d’un répertoire non-restreint
- 5% des clones sélectionnés peuvent reconnaitre une des molécules de classe II du CMH
- permet d’augmenter l’efficacité de la sélection positive
- ici, l’absence d’expression des molécules de classe I et II du CMH par le lobe thymique fait en sorte qu’il n’y aura formation que de DP et qu’il n’y aura pas de sélection positive. - cela permet donc d’analyser la réactivité du répertoire de RCT envers le CMH avant l’introduction du biais de la sélection positive et négative.
- afin de générer des cellules T matures dans ce système, il faut transmettre un signal via le RCT à l’aide d’une astuce expérimentale
- ceci est possible en ajoutant un anticorps dirigé contre la portion constante de la chaine beta du RCT en combinaison avec un anticorps anti-CD4
- ceci imitera l’engagement du RCT par son ligand
- cela provoquera donc la génération de thymocytes CD4SP indépendamment de la reconnaissance d’un complexe peptide-CMH
- donc maturation de cellules T possédant un répertoire non-restreint au CMH.
- lorsque l’on analyse la spécificité de ce répertoire, on s’aperçoit que même si la sélection s’est faite en absence d’interaction avec les molécules de classe I ou II du CMH, qu’il y a environ 5% des clones de cellules T qui possèdent une réactivité intrinsèque envers une molécule de CMH donnée.
- ceci suggère une coévolution des régions V du RCT avec le CMH et ceci est probablement important pour maximiser l’efficacité de la sélection positive
29
Q
Sélection négative : expérience
A
- médié par les cellules hématopoiétiques
- élimine les thymocytes autoréactifs envers les Ag ubiquitaires, les Ag circulants, et exprimés par le thymus
- dans cette expérience, de la moëlle osseuse CMHaxb est greffée dans une souris CMHa irradiée de façon léthale
- dans ce cas, le thymus sera composé de cellules épithéliales CMHa et de cellules dendritiques CMHaXb
- les souris greffées (chimères hématopoiétiques) sont ensuite greffées avec de la peau d’une souris CMHb
- la greffe de peau n’est pas rejetée (alors qu’une souris CMHa rejettera la greffe, alloréponse)
- ceci indique que les cellules dendritiques CMHaxb ont permis l’élimination, sélection négative, des lymphocytes T exprimant un RCT alloréactif pour le CMHb.
- le répertoire de RCT qui sera sélectionné (restreint) sur le CMHa possédera des RCT restreints au CMHa mais que parmi ceux-ci certains seront alloréactifs envers le CMHb
30
Q
Preuve expérimentale de la sélection négative
A
- souris transgéniques pour un RCT, le phénomène d’exclusion allélique fait en sorte que tous les lymphocytes T de cette souris expriment le RCT transgénique
- le RCT choisit est restreint par la molécule de classe I Db et reconnaît un Ag qui est seulement présent chez les souris males
- dans des souris femelles Db, il y aura sélection positive et donc présence de thymocytes CD8SP dans le thymus et de lymphocytes T CD8 en périphérie
- chez le male, aucun thymocytes CD8SP ne se développent puisqu’ils seront sélectionnés négativement par l’antigène mâle
31
Q
Qu’est-ce qui détermine si un thymocyte subira la sélection positive ou négative?
A
- si la sélection négative et positive utilisaient des critères identiques et répondaient aux mêmes signaux, elles seraient des activités futiles
- si la sélection positive choississait pour la survie une population de cellules T qui reconnaît le CMH du soi et si la sélection négative tuait toutes ces dernières, aucune cellules T ne parviendraient à maturité
- la sélection positive doit donc inclure plus de spécificités de RCT que la sélection négative
- les conséquences de l’interaction RCT-CMH qui mènent à la sélection positive ou négative doivent donc être différentes
32
Q
Problème central de la sélection thymique
A
- sélection positive: survie des thymocytes réactifs contre le CMH du soi
- sélection négative: élimination des cellules auto-réactives
- 2 mécanisme pour que la sélection négative n’élimine pas tout le répertoire sélectionné
- différence d’affinité et avidité menant à un signal différent
- utilisation de peptide différents
33
Q
Avidité
A
- modèle quantitatif, la force du signal recue par le thymocyte lors de l’interaction RCT-CMH détermine si il subira la sélection positive ou négative
- force: avidité de l’interaction RCT-CMH; dépend de l’affinité et de la densité de ligands
- forte avidité, signaux forts et donc sélection négative
- faible avidité, signaux faibles et donc sélection positive
- la force du signal est déterminée par l’avidité
- l’avidité dépend de l’affinité de l’interaction entre le RCT et le complexe peptide-CMH et de la densité des complexes peptide-CMH sur la cellule présentatrice d’antigène
TAP: transporteur de peptide du cytoplasme au réticulum endoplasmique. - TAP est nécessaire pour l’expression des molécules de classe I du CMH puisque l’association des molécules de classe I du CMH avec un peptide est requise pour l’expression stable à la surface cellulaire.
- par contre, en absence de TAP, les molécules vont quand même à la surface mais elles sont rapidement internalisées et dégradées
- on peut donc rétablir l’expression des molécules de classe I en ajoutant des peptides dans la culture. Le niveau d’expression des molécules de classe I à la surface sera proportionnel à la quantité de peptides ajoutée.
- FTOC, fetal thymique organ culture
- ce système de culture de lobe thymique fétal est un outil unique pour étudier les processus de sélection thymique.
- pour ce faire, on prélève des lobes thymiques d’embryon de souris au jour 16 de la gestation
- à ce stade le thymus ne contient que des thymocytes DN
- on peut donc suivre leur vague de différenciation
- pour faciliter le travail, on utilise des lobes thymiques de souris RCT transgéniques.
- donc tous les thymocytes qui se différencient portent le même RCT et on donc la même spécificité.
- l’ajout d’une petite quantité de peptides mènera à une interaction de faible avidité avec le RCT (signal faible): survie et sélection positive des thymocytes
- l’ajout d’une grande quantité de peptides mènera à une interaction de forte avidité (signal fort): mort par sélection négative
- donc la force du signal transmis par le RCT dicte le devenir du thymocyte
- seuls les thymocytes dont les RCT se lient faiblement aux complexes CMH-peptide subissent la sélection positive et évitent la sélection négative
- les mêmes résultats seront obtenus si on fait varier l’affinité du RCT pour le peptide lié au CMH
- si on charge la même quantité de peptides sur les molécules de classe I mais qu’on modifie le peptide pour augmenter l’affinité du RCT pour le complexe peptide CMH, on observera de la sélection positive avec le peptide qui confère une faible affinité au RCT tandis que le peptide de haute affinité provoquera la sélection négative.
34
Q
Expression de peptides distincts par les cellules épithéliales corticales du thymus : identification du thymoprotéasome
A
- nouvelle sous-unité catalytique du protéasome, b5t
- exprimée uniquement dans les cellules épithéliales corticales
- modifie l’activité catalytique du protéasome et donc du réservoir de peptides associés aux molécules de classe I du CMH
- change les séquences pour s’assurer de voir des peptides différents qui sont présentés durant la sélection positive et négative
35
Q
Expression de peptides distincts par les cellules épithéliales corticales du thymus : altération du développement thymqiue des ellules CD8+
A
- identifié une nouvelle sous unité du protéasome, b5t, qui est uniquement exprimée dans les cellules épithéliales corticales du thymus
- le protéasome est l’unité qui dégrade les protéines en fragments peptidiques qui seront par la suite présentés par les molécules de classe I du CMH
- l’unité b5t modifie l’activité catalytique du protéasome et change donc la composition des peptides liés aux molécules de classe I dans les cellules épithéliales corticales du thymus.
- l’inactivation du gène codant pour la sous-unité b5t du protéasome et donc de l’expression de cette sous-unité par les cellules épithéliales corticales du thymus provoque une perte de développement des thymocytes CD8SP due à un défaut de leur sélection positive
- ceci suggère que des peptides distincts doivent être exprimées par les cellules épithéliales corticales du thymus afin de permettre la sélection positive.
- l’absence de développement de CD8SP n’est pas du a l’abolition de l’expression des molécules de classe I à la surface des cellules épithéliales corticales du thymus
- un défaut d’expression de la sous-unité b5t du protéasome aurait pu abolir l’activité du protéasome et donc de l’expression des molécules de classe I puisque l’association avec un peptide est requise pour l’expression stable des molécules de classe I à la surface cellulaire
36
Q
Génération de peptides distincts par les cellules épithéliales corticales du thymus
A
- les cellules épithéliales thymiques corticales (cTEC) expriment la cathepsine L (au lieu de la cathepsine D retrouvée dans les cellules présentatrices d’antigène)
- l’expression de cette cathepsine influence le répertoire de peptides associés aux molécules de classe II du CMH
- l’absence de cathepsine L diminue sévèrement le nombre de cellules CD4SP produites dans le thymus
- les cTEC expriment aussi spécifiquement une protéase: Thymus specific serine protease, TSSP
- elle contribue à la formation de peptides nécessaires à la sélection positive des cellules T CD4+
37
Q
Signalisation via le RCT
A
- lck phosphoryle les chaînes du complexe CD3
- recrute ZAP-70 au complexe RCT/CD3
- ZAP phosphoryle différents adapteurs
adapteurs propagent le signal vers les 3 voies de signalisation principales
- ras-map kinase
- PLCg1 (calcineurine, PKC)
- PI-3K
38
Q
Modèle de la signalisation différencielle via le RCT permettant de distinguer la sélection positive et négative
A
- les MAP kinases jouent un rôle crucial dans la définition des réponses cellulaires suite à un stimuli
- 3 types de MAPK, erk, p38 et JNK
- classiquement erk contrôle les réponses envers les stimulis extracellulaires tandis que p38 et JNK participent dans les réponses de stress cellulaire.
- sélection positive, l’activation de erk est lente et soutenue.
- sélection négative, l’active de erk est transiente et forte.
- dans les deux cas p38 et JNK sont activés.
- comment la signalisation par le RCT peut mener à différent types d’activation de erk? - le modèle actuel suggère que selon la quantité ou la qualité du ligand, la molécule adaptatrice LAT sera phosphorylée partiellement (sel+) ou complètement (sél-). - la phosphorylation partiellle de LAT permettra seulement une faible et courte activation de la phospholipase C, ce qui entrainera une accumulation lente et soutenue du diacylglycerol (DAG), ce qui recruitera rasGRP (prot G) qui à son tour activera erk de facon lente , faible et soutenue.
- lors de la sélection négative, la phosphorylation complète de LAT recrutera de façon stable la PLC tandis que les résidus phosphorylés de LAT recruteront GRb2/sos ce qui provoquera l’activation forte de erk
- dans ce modèle, on peut aussi bien imaginer qu’une différence d’affinité/avidité pourrait mener à une signalisation différente
- ce modèle accommode aussi l’idée que ce sont des peptides antagonistes qui induisent la sélection positive en transmettant un signal qui diffère de celui de l’agoniste
39
Q
Est-ce que le thymus médie la tolérance aux Ag du soi périphériques?
A
- oui le thymus possède un mécanisme qui lui permet d’exprimer tous les Ag du soi
40
Q
Représentation du soi périphérique dans le thymus (cellules épithéliales corticales)
A
- jusqu’à 3000 gènes différents sont exprimées par les cellules épithliales médullaires. 5 à 10% de tous les gènes connus
- représentation du soi périphérique dans le thymus
- sous-populations de cellules épithéliales thymiques de la médulla expriment des gènes tissus-spécifiques
- que quelques cellules (en groupe) qui exprime un gène donné
délétion clonale?
sélection de T régulateurs?
- que quelques cellules (en groupe) qui exprime un gène donné
- par contre, ces anitgènes ne sont pas exprimés par toutes les cellules épithéliales, quelques milliers par thymus, souvent regroupés en amas vers l’extérieur de la médulla
- comment l’expression rare des ces antigènes peut induire la tolérance? 2 modèles proposés sélection négative ou sélection de cellules T régulatrices (qui inhibe la réponse des cellules T de même spécificité)
- pour la sélection négative cela est envisageable seulement si les thymocytes balaient les cellules épithéliales, aurait besoin d’en contacter 100 pour tout voir
- possible puisque les cellules T restent 7 jours dans la médulla au stade SP et que les thymocytes bougent beaucoup dans la médulla
- aussi possible que les Ags exprimées par les rares cellules épithéliales puissent se propager aux cellules environnantes
41
Q
APS-1 (syndrome autoimmun polyendocrinien de type 1)
A
- autoimmunité spontanée qui attaque: glande parathyroïde,
glande adrénale, ovaire, foie, pancréas… - maladie autosomale récessive
- perte de fonction d’un gène de susceptibilité: AIRE
42
Q
AIRE
A
- facteur de transcription (lie ADN, capable de transactivation)
- exprimé très fortement dans le thymus, plus particulièrement par les cellules épithéliales médullaires
43
Q
Phénotype AIRE KO souris
A
- souris déficientes pour l’expression de AIRE développent de l’auto-immunité dans plusieurs organes
- maladie autoimmune ressemblant à APS-1
- nécessite l’absence d’expression de AIRE par le stroma thymique (chimère: cellules hématopoiétiques AIRE+ greffées dans souris irradiées AIRE KO)
- abscence expression de AIRE par les cellules épithéliales thymiques provoque la perte d’expression des gènes ectopiques spécifiques aux tissus périphériques (micropuces d’ADN)
- importance de la tolérance centrale (thymique) afin d’éviter la reconnaissance des antigènes périphériques
44
Q
AIRE contrôle l’expression extopique d’Ag restreints aux tissus périphériques
A
- ici le transcriptome des cellules épithéliales thymiques de la médulla de type sauvage ou mutante (KO) pour AIRE a été comparé à l’aide d’une expérience de micropuce d’ADN. - dans le panneau B le niveau d’expression des gènes est indiqué
- chaque point représente un gène. Le niveau d’expression retrouvé dans l’échantillon KO est sur l’axe des Y et celui de la souris sauvage (non mutante pour le gène aire) est en axe des X
- tous les gènes exprimés au même niveau entre les deux groupes se retrouvent sur la diagonale
- ceci est le cas pour l’expression de la majorité des gènes
- par contre, on observe un sous groupe de gènes qui se retrouvent en bas de la diagonale, ce sont donc des gènes qui sont moins exprimés dans l’échantillon KO
- de façon très intéressante, ce sont les gènes qui codent pour des antigènes du soi périphériques (ceux qui ont préalablement été identifiés comme étant exprimés par les cellules épithéliales de la médulla)
- cette expérience démontre que le facteur de transcription aire contrôle l’expression du soi périphériques (génes tissus spécifiques) par les cellules épithéliales thymique de la médulla
45
Q
Mécanismes de sélection négative
A
- présentation directe par les cellules épithéliales de la médulla
- transfert d’antigène aux cellules dendritiques
- par contre, ces anitgènes ne sont pas exprimés par toutes les cellules épithéliales, quelques milliers par thymus, souvent regroupés en amas vers l’extérieur de la médulla
- comment l’expression rare des ces antigènes peut induire la tolérance?
- 2 modèles proposés sélection négative ou sélection de cellules T régulatrices (qui inhibe la réponse des cellules T de même spécificité)
- pour la sélection négative cela est envisageable seulement si les thymocytes balaient les cellules épithéliales, aurait besoin d’en contacter 100 pour tout voir
- possible puisque les cellules T restent 7 jours dans la médulla au stade SP et que les thymocytes bougent beaucoup dans la médulla
- aussi possible que les Ags exprimées par les rares cellules épithéliales puissent se propager aux cellules dendritiques environnantes
46
Q
Autres mécanismes de tolérance centrale (thymique)
A
- les cellules dendritiques, principalement de type plasmacytoides, sont capables de migrer au thymus afin d’induire la tolérance envers des antigènes du soi périphériques.
- cette fonction est heureusement perdue lors d’une infection, qui mène à l’activation de la cellules dendritique, afin de ne pas induire la tolérance envers les agents infectieux
- production de cellules mimant les cellules des organes périphériques
- apport des antigènes du soi au thymus par les cellules dendritiques périphériques
- production de cellules T régulatrices (Treg, CD4+FoxP3+, capables de supprimer la réponse immune)
47
Q
Production de cellules mimétiques
A
- diminue la réactivité du TCR contre Ag du soi
48
Q
Principales caractéristiques de la sélection des cellules T dans le thymus ( + et -)
A
- site : cortex ; jonction corticomédullaire et médulla
- cellules stromales impliqués : cellules épithéliales ; macrophages, DC et cellules épithéliales
- mécanisme de sélection : survie des thymocytes porteurs de RCT capables d’interagir avec le CMH du soi ; élimination des thymocytes porteurs de RCT de haute affinité pour le CMH du soi
- conséquences immunitaires : restriction au CMH du soi ; autotolérance
49
Q
Sélection thymique de cellules T régulatrices
A
- le thymus permet aussi la sélection de cellules T CD4+ régulatrices qui expriment le facteur de transcription Foxp3
- ces cellules T régulatrices ont la capacité d’inhiber les réponses T autoimmunes.
- ces cellules sont restreintes au CMHII et sont sélectionnés grâce à des interactions de plus forte affinité avec le complexe peptide du soi-CMH que la sélection positive
- par contre, l’affinité de cette interaction doit être plus faible que lors de la sélection négative
50
Q
Développement de cellules T non-conventionnelles
A
- ces cellules reconnaissent des ligands non protéiques qui sont présentés par les molécules du CMH non-classique et non poilymorphique
- glycolipide a-GalCer présenté par CMH non classique CD1d pour les NKT
- métabolite de la vitamine B 5-OP-RU présenté par CMH non classique MR1 pour MAIT
- elles ont des fonctions effectrices immédiates
- répertoire de TCR très limité. Utilisation d’une chaine alpha invariable en association avec un nombre limité de chaine beta (segment V)
- MAIT représente 1% des cellules T dans tissus
- réponse contre les bactéries et les levures (pas virus)
- NKT 1 à 3% des cellules T dans tossus et 50% des cellules T dans le foie
- elles répondent en quelques minutes suite à leur activation
- elles produisent différentes cytokines, chémokines, facteurs de croissance et molécules cytotoxiques.
- ceci influence la qualité et la magnitude de la réponse immune.
- ces cellules font le pont entre lù,immunité innée et adaptive
51
Q
Sélection thymique des cellules T non-conventionnelles
A
- les cellules T non-coventionnelles (NKT, MAIT CD8inné) se développent à partir des thymocytes DP exprimant un RCT capables de reconnaître leur ligand
- contrairement au développement des cellules T conventionnelles dont la sélection positive a lieu suite à la reconnaissance d’un peptide du soi présenté par une molécule de classe I ou II du CMH à la surface d’une cellule épithéliale thymique, la sélection des cellules T non-conventionnelles a lieu suite à la reconnaissance via leur RCT de leur ligand à la surface d’autres thymocytes DP.
- suite à leur différenciation, ces cellules acquièrent des propriétés mémoires et migrent dans les tissus périphériques pour y établir résidence où elles jouent un rôle important dans l’immunité locale
- elles acquièrent des fonctions spécifiques et prédéterminées pendant le développement thymique
- IEL sont sélectionnées par MHC-I en absence de costimulation
52
Q
Choix du co-récepteur
A
- l’expression de la molécule CD8 est toujours diminué suite à l’engagement du RCT
- toutes les cellules DP qui poursuivre leur maturation passent donc par un stade transitionel dit CD4+CD8faible.
- le choix de différenciation CD4/CD8 n’est probablement ni instructif ni stochastique mais résulterait plutôt de la quantité/durée du signal RCT.
53
Q
Modèle actuel du choix du co-récepteur
A
- suite à l’interaction RCT-CMH, l’expression de CD8 sera diminuée ce qui permettra à la cellule de savoir si elle interagit avec une molécule de classe I ou II du CMH, ceci résidera dans le fait que si le RCT est restreint aux molécules de classe I du CMH, le signal via le RCT s’arrêtera (sera donc de courte durée) la cellule deviendra donc CD8. - par contre si le thymocyte DP a un RCT qui interagit avec une molécule de classe II du CMH, le signal RCT continuera et la cellule se différenciera en CD4SP.
- ce modèle a été validé expérimentalement. - le restriction de l’expression de ZAP-70 (molécule essentielle à la signalisation du RCT) dans les cellules DP (limitant donc la durée du signal RCT) permet la différenciation vers la lignée CD8 mais prévient la différenciation vers la lignée CD4
- dans cette expérience, les thymocytes restreints par les classe II ont été redirigées vers la voie de différenciation CD8.
54
Q
Choix CD4 ou CD8
A
- les cellules qui continuent à recevoir un signal RCT après la diminution de l’expression de CD8, gagne l’expression du facteur de transcription gata-3
- gata-3 induit l’expression d’un autre facteur de transcription Thpok (ZBTB7B).
- Thpok permet la différenciation vers la lignée CD4 et l’acquisition du programme génique requis pour la fonction des cellules T CD4 en périphérie.
- les cellules classe I restreintes arrêteront de recevoir un signal via le RCT suite à la diminution de l’expression de CD8
- ceci ne mènera pas à l’expression de gatat-3
- par contre le facteur de transcription Runx3 sera exprimé (pas induit par le signal RCT mais par IL-7) et provoquera le choix de différentiation vers la lignée CD8.
- de plus Runx3 inhibe l’expression de thpok et vice-versa
