Recombinaison VDJ Flashcards
1
Q
Immunorécepteurs
A
- molécules effectrices de l’immunité adaptative.
- immunoglobulines: chaînes légères k et g chaîne
lourde H. - récepteurs T: a/b et g/f (combinaisons
mutuellement exclusives) - molécules qui reconnaissent l’antigène soit directement (anticorps), soit complexé aux molécules du CMH
- les structures de reconnaissance doivent être variables (« DIVERSITÉ »), car les antigènes le sont.
2
Q
Structure de la mIgM vs RcT ab
A
- mIGM d’une cellule B = hétététramère, va chercher Ag soluble
- récepteur d’une cellule T ab = digère, rencontre son Ag grâce à CPA, relation de surface
3
Q
RcT ab
A
- a un domaine variable et un domaine constant
4
Q
Complexe CMH 1 peptide RcT ab
A
- « complementarity determining regions » (CDR) = CDR3 encodé par la jonction V(D)J
- CDR3 sont les plus collés avec leur peptide antigénique (directement encodé dans la portion VDJ)
5
Q
Localisations chromosomiques
A
- le locus TCRB (chaîne b du TCR) et le locus TCRG (chaîne g) sont sur le même chromosome, mais sur des bras différents et dans une orientation opposée.
- le locus TCRD (chaîne g) est inclus (« interspersed ») au sein même du locus TCRA (chaîne a)
- proximité chromosomique ont évolué par duplication (un seul gène ancestral)
6
Q
Organisation schématique : loi d et g
A
- certaines régions J sont utilisées également par la chaîne a et la chaîne b
- le réarrangement de la chaîne a entraîne une délétion du locus d
- ainsi, ces deux chaînes sont exprimées d’une façon exclusive.
- comme le locus TCRB, le locus TCRG
possède deux modules « J-C » qui sont fonctionnellement équivalents, probablement issus d’une duplication ancestrale. - chaine g est similaire a b (fonctionnellement équivalente)
7
Q
Organisation régionale : loci a et d
A
- régions sont bien conservés entre l’humain et les souris
- régions variable sont les partie les plus importantes
- gènes autour de la partie variables sont plus ou moins les mêmes entre l’humain et la souris
- pas juste le locus alpha qui est conservé mais toute la région
8
Q
Organisation régional : loci b et g
A
- Gama est un peu différent
- mais pour b, l’organisation chromosomique ne change pas vraiment
9
Q
Composition des loci du RCT
A
- relativement plus d’ADN répétitif (i.e. éléments mobiles) dans les loci RCT que la moyenne du génome complet.
- moins d’ADN répétitif dans les régions D-J-C des loci
- contiennent beaucoup d’ADN répétitif (plus que la moyenne dans le génome)
- n’encode pas vraiment des trucs fonctionnels, plus là pour la structure et important pour les parties variables car favorise la diversification (polymorphisme)
- diminution soudaine car protéines sont importantes pour transduction du signal et de la structure du récepteur
10
Q
Diversité des immunorécepteurs
A
DIVERSITÉ GERMINALE
- multiples copies de chacun des différents gènes rassemblées au sein de locus complexes, le polymorphisme de ces gènes est élevé.
DIVERSITÉ COMBINATOIRE
- les immunorécepteurs sont des hétérodimères
- chacune des chaînes contribue à la reconnaissance de l’antigène.
- bien qu’il existe des préférences au niveau de l’appariement, cette propriété augmente le potentiel de reconnaissance de manière significative.
MODIFICATIONS SOMATIQUES
- les régions hypervariables des immunorécepteurs
(« complementarity-determining regions-CDR ») sont directement impliquées dans la reconnaissance de l’antigène.
- les plus variables de ces zones correspondent aux régions touchées par les modifications somatiques.
11
Q
4 types de modifications somatiques
A
- réarrangement génique (recombinaison somatique, recombinaison VDJ, commun à tous les immunorécepteurs
- commutation de classe (immunoglobulines)
- hypermutation somatique (immunoglobulines)
- conversion génique (diversification des Ig chez le poulet)
12
Q
Recombinaison somatique
A
- sondes correspondant aux régions V et C de la chaîne légère k des Ig révèlent des fragments d’ADN de tailles différentes sur les cellules B matures que dans l’ADN germinal.
- il y a eu un réarrangement de l’ADN et il a eu lieu au niveau somatique
- le mécanisme qui permet la fusion des gènes V et C reste obscur
- démontre sur led régions V et C se sont déplacés de l’ADN donc il y a eu un réarrangement de l’ADN
13
Q
Identification de la recombinase
A
- RAG-1 1000x plus active en présence de RAG-2
14
Q
RAG-1 et RAG-2
A
- interagissent avec l’ADN au RSS sous forme d’un complexe multimérique composé d’un dimère de RAG-1 et d’un dimère de RAG- 2
- structure très conservée à travers l’évolution.
- pas d’introns, (inhabituel; comme les transposases bactériennes)
- médient le clivage double-brin in vitro; déterminent la règle 12/23
- profil d’expression très restreint (i.e. thymocytes), principalement contrôlé par le promoteur de RAG2
- recombinases = coupe ADN
- RAG-1 : partie localisation nucléaire, dimérisation, interaction ADN et site actif (clivage, réaction catalytique)
- RAG-2 : partie PHD finger
15
Q
Phases recombinaison somatique
A
- initiation
- synapse
- clivage
- protection et apprêtement
- résolution
16
Q
Initiation
A
- HMG1 et HMG2 (« High Mobility Group Proteins »), deux protéines ubiquitaires qui sont capables de « plier » l’ADN (« pliases »), servent de cofacteurs.
- particulièrement importants pour le clivage au RSS-23.
17
Q
RSS
A
- les séquences de l’heptamère et du nonamère sont extrêmement bien conservées, mais pas celles des espaceurs, à part au niveau de la longueur (démontre que ce n’est pas les séquences de l’espacer qui sont importantes mais la longueur)
- se retrouve entre les cassettes (V, J)
18
Q
Interaction RAG-RSS
A
- RAG-1 interagit principalement avec l’espaceur et le nonamère.
- le recrutement de RAG-2 stabilise le complexe et étend les interactions protéine-ADN au niveau de l’heptamère
- le complexe RAG-1-RAG-2-RSS12 est plus stable que le complexe RAG-1-RAG-2-RSS23.
- l’interaction protéine-ADN se fait sur une seule face du RSS (d’où l’importance de la longueur de l’espaceur, soit 12 ou 23 nucléotides).
- amène heptamère et nonamère sont la même face de l’ADN
19
Q
Protéines HMG
A
- induction d’un repli dans la structure de la double hélice par HMG-1
- le pliage permet l’énergie thermodynamique pour la réaction de clivage
20
Q
Synapse
A
- RAGs doivent être amenés l’un proche de l’autre
21
Q
Clivage
A
- trans-estérification 3’ du brin codant avec 5’ du brin non-codant
- extrémités libres et séquence peut être très longue
- épingles à cheveu ferme les extrémités des régions codantes
22
Q
Épingles à cheveux
A
- s’accumulent dans le thymus de la souris SCID, une souris immunodéficiente qui est incapable de réarranger les gènes des Ig et du TCR
- indétectables dans des thymocytes normaux (demi-vie très courte).
- ne peuvent pas être ligasés directement in vitro (i.e. les extrémités sont « bloquées »).
- le blocage n’est pas protéique (i.e. l’extrémité est toujours bloquée après extraction ou protéolyse).
23
Q
Protection et apprêtement
A
- recouvrement les extrémités avec Ku
- s’assemble sur l’ADN pour le protéger (ex : par des nucléases)
- DNA-PKcs (sous-unité caralytique)
- endonucléase (Artemis) : ouverture épingle à cheveu
- exonucléase (non identifiée) : enlève nucléotides aléatoire
- TdT : ajoute nucléotides aléatoire (ajoute diversité)
24
Q
Facteur nucléaire Ku
A
- Ku80 (grosse sous-unité du facteur nucléaire Ku).
- aussi appelé XRCC5 (X-ray cross-complementation 5), un gène impliqué dans la résistance aux radiations ionisantes.
- hétérodimérise obligatoirement avec Ku70.
- interagit avec l’ADN de manière non-spécifique.
- protège (i.e. recouvre) près de 30 paires de bases.
- configuration en « collier de perles » sur l’ADN (microscopie électronique).
- le knock-out est létal chez la souris.
- recrute différentes protéines vers l’ADN à l’aide de la queue C- terminale de Ku80 (facteur de ciblage; « ciblase »).
- relations très proche entre Ku et l’ADN
25
Q
DNA-dependant protéines kinase
A
- DNA-PKcs, pour « Catalytic Subunit ».
- aussi appelée XRCC7, sa déficience entraînant une sensibilité accrue aux radiations ionisantes.
- gène défectueux chez la souris SCID.
- sérine-thréonine kinase, qui phosphoryle plusieurs substrats nucléaires (facteurs de transcription, RNA polymérase, Ku, Artemis, et peut être même RAG).
- « chef d’orchestre » de la phase de protection et d’apprêtement.
- fait la transition entre la phase précoce (cellule-spécifique) et les phases ultérieures (ubiquitaires) de la recombinaison V(D)J
- partie tête/couronne avec ça quelle phosphore le substrat et partie berceau où il y a la double hélice
26
Q
Artemis (DCLRE1C)
A
- protéine de 685 acides aminés, chromosome 10p,
- associée chez l’Humain à une immunodéficience combinée sévère (SCID) avec radiosensibilité
- famille des métallo-b-lactamases, mais structure incertaine.
- expression ubiquitaire mais à faible niveau.
- activité hydrolase restreinte aux jonctions codantes (épingles à cheveux).
27
Q
TdT
A
- ajoute des bases aléatoires aux extrémités des jonctions codantes.
- contribue d’une façon disproportionnée à la génération de la diversité jonctionnelle.
- lymphocytes de souris TdT knock-out ont des régions jonctionnelles invariantes.
28
Q
Résolution (du joint codant)
A
- XRCC4 et DNA ligase IV
- réparation du chromosome
29
Q
XRCC4 et DNA ligase IV
A
- comme Ku, la DNA-PKcs et Artemis, ces deux protéines sont impliquées dans la réparation de bris double-brins (« non- homologous end-joining pathway-NHEJ »).
- XRCC4 se complexe avec la DNA ligase IV avec très haute affinité et en augmente l’activité.
- le complexe est ciblé par l’hétérodimère KU vers les bris double-brins.
- onteractions non-spécifiques entre XRCC4 et l’ADN via sa portion N-terminale?
- importance de XRCC4 pour le positionnement de la ligase IV au sein du complexe de réparation d’ADN NHEJ.
- XRCC$ a espacement conservé à travers l’Évolution (fonction de la protéine n’est pas catalytique mais de placer un partenaire pour effectuer leur fonction)
30
Q
XLF/Cernunnos
A
- similarité structurelle avec XRCC4, mais plus compacte.
- interaction avec le complexe XRCC4-Ligase IV
- formation d’un « filament » qui permet d’adapter différentes structures de bris double- brins
- permet de donner souplesse à ADN
31
Q
PAXX
A
- stabiliser tout le complexe
- permet de garder toutes les protéines et molécules stables our que la réparation de l’ADN soit plus efficace
32
Q
Complexe synaptique NHEJ
A
- l’atrium est accessible aux solvants.
- permet la liberté de mouvement aux extrémités d’ADN, la relocalisation des brins et leur pairage pour que les doubles brins s’apparient (donne du jeu)
- cavité a beaucoup plus d’espace que Ku
33
Q
Régulation de l’accessibilité
A
- RAG 1/2 ne peuvent pas accéder aux RSS lorsque
l’ADN de la cellule est fortement condensé (i.e. les
RSS sont « inaccessibles »). - la condensation et l’accessibilité sont contrôlées en partie par les histone acétyl transférases et les histone désacétylases, qui modifient la queue des histones.
34
Q
RAG2 core
A
- « 6-blade Kelch-like b- propeller domain »
- associé à la multimérisation
35
Q
RAG2 PHD finger
A
- « PHD » = « Plant HomeoDomain ».
- dtructure coordonnée par des atomes de zinc interagissant avec des résidus cystéine et
histidine hautement conservés. - se retrouve chez des protéines qui interagissent avec la chromatine
- mutations des résidus critiques: SCID (i.e. pas de
lymphocytes T ni de lymphocytes B)
36
Q
RAG2 PHD singer et H3K4me3
A
- le « PHD finger » de RAG2 interagit spécifiquement avec l’histone H3 triméthylée sur la lysine 4 (H3K4me3).
- mutations associées au SCID sont critiques pour cette interaction.
- RAG2 module l’accessibilité des RSS.
- lie la recombinaison V(D)J avec les histones et le « histone code »
37
Q
Comment se fait la synapse?
A
- transcription germinale
- acétylation et méthylation des histones
- présence de nexus de recombinaison
- recrutement des protéines RAG (RAG-RSS, RAG2-H3K4me3)
- scanne RSS dans nexus pour la recombinaison
- réorganisation de la chromatine à grande échelle
- les régions V défilent dans le nexus et compétitionnent pour les protéines RAG (ce n’est pas RAG qui se déplace mais l’ADN)
- une des régions V est capturée.
- formation du complexe synaptique qui mènera au réarrangement.
38
Q
Récapitulation
A
- le réarrangement des RcTs et des Igs est un processus ordonné et contrôlé à l’extrême (surveillance).
- ce processus est initié par des molécules (RAG-1, RAG-2) dont les profils d’expression sont très étroits, et est régulé par la modulation de l’accessibilité des RSS.
- par la suite, la résolution des jonctions codantes et jonctions signal est effectuée par un ensemble de protéines à expression ubiquitaire dont la fonction est de surveiller et de réparer les bris doubles-brins (NHEJ)
- le processus de réarrangement somatique implique des interactions à longue distance et réorganisation à grande échelle au sein de la chromatine
- malgré sa complexité, l’ensemble du processus est extrêmement rapide
