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Immunologie > Recombinaison VDJ > Flashcards

Recombinaison VDJ Flashcards

1
Q

Immunorécepteurs

A
  • molécules effectrices de l’immunité adaptative.
  • immunoglobulines: chaînes légères k et g chaîne
    lourde H.
  • récepteurs T: a/b et g/f (combinaisons
    mutuellement exclusives)
  • molécules qui reconnaissent l’antigène soit directement (anticorps), soit complexé aux molécules du CMH
  • les structures de reconnaissance doivent être variables (« DIVERSITÉ »), car les antigènes le sont.
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Q

Structure de la mIgM vs RcT ab

A
  • mIGM d’une cellule B = hétététramère, va chercher Ag soluble
  • récepteur d’une cellule T ab = digère, rencontre son Ag grâce à CPA, relation de surface
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3
Q

RcT ab

A
  • a un domaine variable et un domaine constant
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4
Q

Complexe CMH 1 peptide RcT ab

A
  • « complementarity determining regions » (CDR) = CDR3 encodé par la jonction V(D)J
  • CDR3 sont les plus collés avec leur peptide antigénique (directement encodé dans la portion VDJ)
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5
Q

Localisations chromosomiques

A
  • le locus TCRB (chaîne b du TCR) et le locus TCRG (chaîne g) sont sur le même chromosome, mais sur des bras différents et dans une orientation opposée.
  • le locus TCRD (chaîne g) est inclus (« interspersed ») au sein même du locus TCRA (chaîne a)
  • proximité chromosomique ont évolué par duplication (un seul gène ancestral)
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6
Q

Organisation schématique : loi d et g

A
  • certaines régions J sont utilisées également par la chaîne a et la chaîne b
  • le réarrangement de la chaîne a entraîne une délétion du locus d
  • ainsi, ces deux chaînes sont exprimées d’une façon exclusive.
  • comme le locus TCRB, le locus TCRG
    possède deux modules « J-C » qui sont fonctionnellement équivalents, probablement issus d’une duplication ancestrale.
  • chaine g est similaire a b (fonctionnellement équivalente)
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7
Q

Organisation régionale : loci a et d

A
  • régions sont bien conservés entre l’humain et les souris
  • régions variable sont les partie les plus importantes
  • gènes autour de la partie variables sont plus ou moins les mêmes entre l’humain et la souris
  • pas juste le locus alpha qui est conservé mais toute la région
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8
Q

Organisation régional : loci b et g

A
  • Gama est un peu différent
  • mais pour b, l’organisation chromosomique ne change pas vraiment
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9
Q

Composition des loci du RCT

A
  • relativement plus d’ADN répétitif (i.e. éléments mobiles) dans les loci RCT que la moyenne du génome complet.
  • moins d’ADN répétitif dans les régions D-J-C des loci
  • contiennent beaucoup d’ADN répétitif (plus que la moyenne dans le génome)
  • n’encode pas vraiment des trucs fonctionnels, plus là pour la structure et important pour les parties variables car favorise la diversification (polymorphisme)
  • diminution soudaine car protéines sont importantes pour transduction du signal et de la structure du récepteur
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10
Q

Diversité des immunorécepteurs

A

DIVERSITÉ GERMINALE
- multiples copies de chacun des différents gènes rassemblées au sein de locus complexes, le polymorphisme de ces gènes est élevé.
DIVERSITÉ COMBINATOIRE
- les immunorécepteurs sont des hétérodimères
- chacune des chaînes contribue à la reconnaissance de l’antigène.
- bien qu’il existe des préférences au niveau de l’appariement, cette propriété augmente le potentiel de reconnaissance de manière significative.
MODIFICATIONS SOMATIQUES
- les régions hypervariables des immunorécepteurs
(« complementarity-determining regions-CDR ») sont directement impliquées dans la reconnaissance de l’antigène.
- les plus variables de ces zones correspondent aux régions touchées par les modifications somatiques.

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11
Q

4 types de modifications somatiques

A
  • réarrangement génique (recombinaison somatique, recombinaison VDJ, commun à tous les immunorécepteurs
  • commutation de classe (immunoglobulines)
  • hypermutation somatique (immunoglobulines)
  • conversion génique (diversification des Ig chez le poulet)
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12
Q

Recombinaison somatique

A
  • sondes correspondant aux régions V et C de la chaîne légère k des Ig révèlent des fragments d’ADN de tailles différentes sur les cellules B matures que dans l’ADN germinal.
  • il y a eu un réarrangement de l’ADN et il a eu lieu au niveau somatique
  • le mécanisme qui permet la fusion des gènes V et C reste obscur
  • démontre sur led régions V et C se sont déplacés de l’ADN donc il y a eu un réarrangement de l’ADN
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13
Q

Identification de la recombinase

A
  • RAG-1 1000x plus active en présence de RAG-2
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14
Q

RAG-1 et RAG-2

A
  • interagissent avec l’ADN au RSS sous forme d’un complexe multimérique composé d’un dimère de RAG-1 et d’un dimère de RAG- 2
  • structure très conservée à travers l’évolution.
  • pas d’introns, (inhabituel; comme les transposases bactériennes)
  • médient le clivage double-brin in vitro; déterminent la règle 12/23
  • profil d’expression très restreint (i.e. thymocytes), principalement contrôlé par le promoteur de RAG2
  • recombinases = coupe ADN
  • RAG-1 : partie localisation nucléaire, dimérisation, interaction ADN et site actif (clivage, réaction catalytique)
  • RAG-2 : partie PHD finger
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15
Q

Phases recombinaison somatique

A
  • initiation
  • synapse
  • clivage
  • protection et apprêtement
  • résolution
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16
Q

Initiation

A
  • HMG1 et HMG2 (« High Mobility Group Proteins »), deux protéines ubiquitaires qui sont capables de « plier » l’ADN (« pliases »), servent de cofacteurs.
  • particulièrement importants pour le clivage au RSS-23.
17
Q

RSS

A
  • les séquences de l’heptamère et du nonamère sont extrêmement bien conservées, mais pas celles des espaceurs, à part au niveau de la longueur (démontre que ce n’est pas les séquences de l’espacer qui sont importantes mais la longueur)
  • se retrouve entre les cassettes (V, J)
18
Q

Interaction RAG-RSS

A
  • RAG-1 interagit principalement avec l’espaceur et le nonamère.
  • le recrutement de RAG-2 stabilise le complexe et étend les interactions protéine-ADN au niveau de l’heptamère
  • le complexe RAG-1-RAG-2-RSS12 est plus stable que le complexe RAG-1-RAG-2-RSS23.
  • l’interaction protéine-ADN se fait sur une seule face du RSS (d’où l’importance de la longueur de l’espaceur, soit 12 ou 23 nucléotides).
  • amène heptamère et nonamère sont la même face de l’ADN
19
Q

Protéines HMG

A
  • induction d’un repli dans la structure de la double hélice par HMG-1
  • le pliage permet l’énergie thermodynamique pour la réaction de clivage
20
Q

Synapse

A
  • RAGs doivent être amenés l’un proche de l’autre
21
Q

Clivage

A
  • trans-estérification 3’ du brin codant avec 5’ du brin non-codant
  • extrémités libres et séquence peut être très longue
  • épingles à cheveu ferme les extrémités des régions codantes
22
Q

Épingles à cheveux

A
  • s’accumulent dans le thymus de la souris SCID, une souris immunodéficiente qui est incapable de réarranger les gènes des Ig et du TCR
  • indétectables dans des thymocytes normaux (demi-vie très courte).
  • ne peuvent pas être ligasés directement in vitro (i.e. les extrémités sont « bloquées »).
  • le blocage n’est pas protéique (i.e. l’extrémité est toujours bloquée après extraction ou protéolyse).
23
Q

Protection et apprêtement

A
  • recouvrement les extrémités avec Ku
  • s’assemble sur l’ADN pour le protéger (ex : par des nucléases)
  • DNA-PKcs (sous-unité caralytique)
  • endonucléase (Artemis) : ouverture épingle à cheveu
  • exonucléase (non identifiée) : enlève nucléotides aléatoire
  • TdT : ajoute nucléotides aléatoire (ajoute diversité)
24
Q

Facteur nucléaire Ku

A
  • Ku80 (grosse sous-unité du facteur nucléaire Ku).
  • aussi appelé XRCC5 (X-ray cross-complementation 5), un gène impliqué dans la résistance aux radiations ionisantes.
  • hétérodimérise obligatoirement avec Ku70.
  • interagit avec l’ADN de manière non-spécifique.
  • protège (i.e. recouvre) près de 30 paires de bases.
  • configuration en « collier de perles » sur l’ADN (microscopie électronique).
  • le knock-out est létal chez la souris.
  • recrute différentes protéines vers l’ADN à l’aide de la queue C- terminale de Ku80 (facteur de ciblage; « ciblase »).
  • relations très proche entre Ku et l’ADN
25
Q

DNA-dependant protéines kinase

A
  • DNA-PKcs, pour « Catalytic Subunit ».
  • aussi appelée XRCC7, sa déficience entraînant une sensibilité accrue aux radiations ionisantes.
  • gène défectueux chez la souris SCID.
  • sérine-thréonine kinase, qui phosphoryle plusieurs substrats nucléaires (facteurs de transcription, RNA polymérase, Ku, Artemis, et peut être même RAG).
  • « chef d’orchestre » de la phase de protection et d’apprêtement.
  • fait la transition entre la phase précoce (cellule-spécifique) et les phases ultérieures (ubiquitaires) de la recombinaison V(D)J
  • partie tête/couronne avec ça quelle phosphore le substrat et partie berceau où il y a la double hélice
26
Q

Artemis (DCLRE1C)

A
  • protéine de 685 acides aminés, chromosome 10p,
  • associée chez l’Humain à une immunodéficience combinée sévère (SCID) avec radiosensibilité
  • famille des métallo-b-lactamases, mais structure incertaine.
  • expression ubiquitaire mais à faible niveau.
  • activité hydrolase restreinte aux jonctions codantes (épingles à cheveux).
27
Q

TdT

A
  • ajoute des bases aléatoires aux extrémités des jonctions codantes.
  • contribue d’une façon disproportionnée à la génération de la diversité jonctionnelle.
  • lymphocytes de souris TdT knock-out ont des régions jonctionnelles invariantes.
28
Q

Résolution (du joint codant)

A
  • XRCC4 et DNA ligase IV
  • réparation du chromosome
29
Q

XRCC4 et DNA ligase IV

A
  • comme Ku, la DNA-PKcs et Artemis, ces deux protéines sont impliquées dans la réparation de bris double-brins (« non- homologous end-joining pathway-NHEJ »).
  • XRCC4 se complexe avec la DNA ligase IV avec très haute affinité et en augmente l’activité.
  • le complexe est ciblé par l’hétérodimère KU vers les bris double-brins.
  • onteractions non-spécifiques entre XRCC4 et l’ADN via sa portion N-terminale?
  • importance de XRCC4 pour le positionnement de la ligase IV au sein du complexe de réparation d’ADN NHEJ.
  • XRCC$ a espacement conservé à travers l’Évolution (fonction de la protéine n’est pas catalytique mais de placer un partenaire pour effectuer leur fonction)
30
Q

XLF/Cernunnos

A
  • similarité structurelle avec XRCC4, mais plus compacte.
  • interaction avec le complexe XRCC4-Ligase IV
  • formation d’un « filament » qui permet d’adapter différentes structures de bris double- brins
  • permet de donner souplesse à ADN
31
Q

PAXX

A
  • stabiliser tout le complexe
  • permet de garder toutes les protéines et molécules stables our que la réparation de l’ADN soit plus efficace
32
Q

Complexe synaptique NHEJ

A
  • l’atrium est accessible aux solvants.
  • permet la liberté de mouvement aux extrémités d’ADN, la relocalisation des brins et leur pairage pour que les doubles brins s’apparient (donne du jeu)
  • cavité a beaucoup plus d’espace que Ku
33
Q

Régulation de l’accessibilité

A
  • RAG 1/2 ne peuvent pas accéder aux RSS lorsque
    l’ADN de la cellule est fortement condensé (i.e. les
    RSS sont « inaccessibles »).
  • la condensation et l’accessibilité sont contrôlées en partie par les histone acétyl transférases et les histone désacétylases, qui modifient la queue des histones.
34
Q

RAG2 core

A
  • « 6-blade Kelch-like b- propeller domain »
  • associé à la multimérisation
35
Q

RAG2 PHD finger

A
  • « PHD » = « Plant HomeoDomain ».
  • dtructure coordonnée par des atomes de zinc interagissant avec des résidus cystéine et
    histidine hautement conservés.
  • se retrouve chez des protéines qui interagissent avec la chromatine
  • mutations des résidus critiques: SCID (i.e. pas de
    lymphocytes T ni de lymphocytes B)
36
Q

RAG2 PHD singer et H3K4me3

A
  • le « PHD finger » de RAG2 interagit spécifiquement avec l’histone H3 triméthylée sur la lysine 4 (H3K4me3).
  • mutations associées au SCID sont critiques pour cette interaction.
  • RAG2 module l’accessibilité des RSS.
  • lie la recombinaison V(D)J avec les histones et le « histone code »
37
Q

Comment se fait la synapse?

A
  • transcription germinale
  • acétylation et méthylation des histones
  • présence de nexus de recombinaison
  • recrutement des protéines RAG (RAG-RSS, RAG2-H3K4me3)
  • scanne RSS dans nexus pour la recombinaison
  • réorganisation de la chromatine à grande échelle
  • les régions V défilent dans le nexus et compétitionnent pour les protéines RAG (ce n’est pas RAG qui se déplace mais l’ADN)
  • une des régions V est capturée.
  • formation du complexe synaptique qui mènera au réarrangement.
38
Q

Récapitulation

A
  • le réarrangement des RcTs et des Igs est un processus ordonné et contrôlé à l’extrême (surveillance).
  • ce processus est initié par des molécules (RAG-1, RAG-2) dont les profils d’expression sont très étroits, et est régulé par la modulation de l’accessibilité des RSS.
  • par la suite, la résolution des jonctions codantes et jonctions signal est effectuée par un ensemble de protéines à expression ubiquitaire dont la fonction est de surveiller et de réparer les bris doubles-brins (NHEJ)
  • le processus de réarrangement somatique implique des interactions à longue distance et réorganisation à grande échelle au sein de la chromatine
  • malgré sa complexité, l’ensemble du processus est extrêmement rapide

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