Proteomika w mikrobiologii

Question 1

• Proteomika

Answer 1

gałąź nauki zajmująca się badaniem białek – ich struktury, sprawowanych przez nie funkcji i zależności między nimi

Question 2

• Proteom

Answer 2

całość białek obecnych w organizmie podczas kompletnego cyklu życiowego

Question 3

• Białka (proteiny, gr. proteosis)

Answer 3

zajmujący pierwsze miejsce biopolimery zbudowane z reszt aminokwasów połączonych wiązaniem peptydowym występujące we wszystkich organizmach

Question 4

• Peptydy (gr. pepto – trawię)

Answer 4

związki organiczne zbudowane z reszt aminokwasów połączonych wiązaniem peptydowym
• Peptydy o cząsteczkach zawierających
o oligopeptydy - mniej niż 10 reszt aminokwasowych
o polipeptydy - do ok 100 reszt aminokwasowych
o białka - ponad 100 reszt aminokwasowych

Question 5

Funkcje białek

Answer 5

• strukturalne, konstrukcyjne – kolagen, keratyna, flagellina, fimbrie, S-layer
• Enzymatyczne – trypsyna, lecytynaza, koagulaza, laktazy
• Obronne/ochronne – przeciwciała, białko A, S-layer, MurJ
• Transportowe – hemoglobina, flipazy, kanały jonowe MurJ
• Komunikacyjne – quorum sensing (peptydy)
• Zapasowe – kazeina, owalbumina, kalmodulina, bakterioferrytyny
• Regulatorowe - hormony

Question 6

Aminokwasy

Answer 6

• Grupa aminowa NH3+, grupa karboksylowa COO-, łańcuch boczny, węgiel α
• Aminokwasy mają strukturę tetraedryczną
• W formie L aminokwasy są łatwo wchłaniane, w formie D są nawet toksyczne. Określona liczba węgli i grupa aminowa i karboksylowa. Zjonizowana lub nie zjonizowana.

Question 7

Tworzenie wiązania peptydowego

Answer 7

• grupa karboksylowa + grupa aminowa → wiązanie peptydowe → peptyd z N i C końcem

Question 8

Łańcuch peptydowy

Answer 8

• Sekwencję peptydów zwyczajowo zapisuje się od N do C-końca, można stosować trójliterowe lub jednoliterowe skróty
• Kolejność reszt aminokwasowych w łańcuchu peptyd decyduje o jego właściwościach i funkcjach

Question 9

Strukturę białka można rozpatrywać na 4 poziomach:

Answer 9

• Struktura pierwszorzędowa białek – kolejność aa w łańcuchu polipeptydowym
• Struktura drugorzędowa białek – przestrzenne ułożenie fragmentów łańcuchów polipeptydowych (α-helisa , β-harmonijka)
• Struktura trzeciorzędowa białek – wzajemne położenie elementów struktury II-rzędowej (warunkują ją różne wiązania chemiczne oraz oddziaływania międzycząsteczkowe: wiązania dwusiarczkowe, oddziaływania jonowe, oddziaływania hydrofobowe, oddziaływania van der Waalsa) - poryna
• Struktura czwartorzędowa białek – wzajemnie położenie łańcuchów polipeptydowych oraz ewentualnie struktur niebiałkowych (mostek disiarczkowy, mostek solny, oddziaływania wodorowe, hydrofobowe) – kinaza pirogronianowa
• B KARTKA ATYROWNOLEGŁA →,

Question 10

Metody proteomiki

• Polegają na:

Answer 10

1. Oczyszczeniu i separacji próbek wieloskładnikowych – materiał biologiczny
2. Identyfikacja próbek
3. Analiza i interpretacja wyników
4. Weryfikacja przydatności potencjalnych biomarkerów za pomocą innych technik

Question 11

Wybór materiału biologicznego

Answer 11

• Analizę przeprowadzano już na wszystkich możliwych rodzajach próbek, np. mięsień serca, struktury mózgowe, wątroba, mleko, grzyby, mięso, hodowle komórkowe
• Z klinicznego punktu widzenia najlepszym źródłem materiału analitycznego są płyny ustrojowe:
o Surowica lub plazma krwi
o Mocz
o Ślina
o Płyn mózgowo-rdzeniowy

Question 12

Strategie proteomiczne

Answer 12

Metoda bottom-up
Metoda shotgun
Metoda top-down

Question 13

Metoda bottom-up

Answer 13

• Polega na rozdziale mieszaniny białek za pomocą elektroforezy dwuwymiarowej
• Analizuje peptydy uzyskane w wyniku enzymatycznego trawienia białka
• Podstawą identyfikacji białek są sekwencje peptydowe uzyskane metodą tandemowej spektrometrii mas (MS/MS) lub mapą peptydową (PMF)

o częściowa informacja o identyfikowanym białku i jego modyfikacjach
o niska powtarzalność
o duża czasochłonność
o obecność izoform (forma strukturalna białka) można wykryć tylko przez wstępną preseparację – np. przy użyciu 2D-PAGE
o mieszanina białek musi być każdorazowo rozdzielona przed rozpoczęciem analizy

Question 14

Metoda shotgun

Answer 14

• pomija wstępną separację białek
• polega na bezpośrednim trawieniu całej mieszaniny za pomocą enzymów proteolitycznych
• ze względu na ogromną liczbę możliwych fragmentów wykorzystuje się wielowymiarową kapilarną chromatografię cieczową
• identyfikacja białek za pomocą spektrometrii mas
• wada – nie pozwala na identyfikację izoform białek

Question 15

Metoda top-down

Answer 15

• polega na fragmentacji całych białek, bez konieczności ich trawienia
• analizuje białka natywne, bez ich uprzedniej proteolizy
• wykorzystuje jonizację ESI – używająca wielokrotną jonizację, a poszczególne jony poddawane są fragmentacji
• zaleta – identyfikacja modyfikacji potranslacyjnych
• wady
o fragmentacja wielokrotnie zjonizowanych jonów powoduje utratę przyłączonych ładunków i stąd jon fragmentacyjny może mieć większą wartość m/z (stosunek masy do ładunku) niż jon macierzysty
o trudności interpretacji złożonych widm fragmentacyjnych dużych cząsteczek
o interpretacja limitowana zakresem m/z analizatora

Question 16

Metabolomika

Answer 16

gałąź nauki obejmująca analizę jakościową i ilościową oraz identyfikację edogennych, drobnocząsteczkowych związków – metabolitów. W tym celu wykorzystuje techniki analityczne, odmienne od stosowanych w analizie proteomu

Question 17

Metabolom

Answer 17

zbiór substancji drobnocząsteczkowych o różnych własnościach fizykochemicznych, będących elementami szlaków metabolitycznych w badanym systemie (organizmie, tkankach, komórkach)

Question 18

Strategie stosowane w analizie metabolomu

Answer 18

• Analiza określonego metabolitu lub grupy metabolitów
o Umożliwia analizę z największą czułością
o Wykorzystuje najbardziej ukierunkowane metody, np. do identyfikacji disacharydów
• Analiza ilościowa grupy metabolitów
o Np. wyselekcjonowanego szlaku metabolicznego
• Metabolomika
o Całościowa analiza ilościowa badanego organizmu, komórki
• Analiza „odcisku palca” metabolitów
o Umożliwia klasyfikację badanej próbki na podstawie całego profilu, a nie pojedynczych związków

Question 19

• Proces przygotowania próbki ma za zadanie

Answer 19

zredukowanie jej objętości, eliminację zanieczyszczeń i usunięcie niepożądanych składników (np. części białek surowicy, lipidów itp.), w celu uzyskania jednorodnego homogennego i stabilnego materiału do analizy
• Obecnie brak jednej i uniwersalnej metody przygotowania próbki

Question 20

Przechowywanie materiału

Answer 20

• Od momentu pobrania materiał biologiczny należy przechowywać w niskiej temperaturze (poniżej -80oC)
• Preparat należy podzielić na odpowiednie porcje, aby nie narażać go na wielokrotne rozmrażanie i zamrażanie

Question 21

Źródła próbek biologicznych w proteomice i metabolomice

Answer 21

• Podstawowe – narządy i tkanki zwierzęce, roślinne, hodowle komórkowe, płyny ustrojowe, chirurgiczne wycinki tkanek, bakterie, wirusy
• Mogą występować znaczne różnice w wynikach otrzymywanych po badaniu materiału ludzkiego, ze względu na trudność nadzoru etapu pobierania prób, jego transportu oraz przechowywania w tym czasie

Question 22

Przeszkody związane z analizą próbki biologicznej

Answer 22

• Ogromne różnice stężeń białek występujących w próbce
• Białka występujące w znacznej ilości i maskujące zmiany na poziomie znacznie mniejszych stężeń powinny być usunięte w dalszych badaniach. Można to osiągnąć za pomocą m.in. chromatografii powinowactwam odpowiednich technik separowania, frakcjonowania lub wzbogacania związków o małym stężeniu w próbce.
• Obecność oraz stężenie białek w komórce może się znacznie różnić w zależności od stanu i fazy jej rozwoju – jest to wynik różnicowania się komórek oraz odpowiedzi na bodźce zewnętrzne.

Question 23

Zanieczyszczenia próbki

Answer 23

• Zanieczyszczenia próbki powstają najczęściej podczas jej przygotowania do analizy
• Zanieczyszczenia materiału biologicznego pochodzącego z organizmów żywych:
o Elementy krwi
o Hemoglobina
o Keratyny (znajdują się praktycznie wszędzie w laboratorium, dlatego preparowanie powinno się odbywać w komorach laminarnych)
• Probówki

Question 24

Metody dezintegracji komórek

Answer 24

• Homogenizacja
• Nuberakuzacha
• Wirowanie
• Sonifikacja
• Rozcieranie

Question 25

Metody lizy komórek

Answer 25

• Szok osmotyczny
• Homogenizacja w roztworze powodującym lizę
• Metoda naprzemiennego zamrażania i rozmrażania

Question 26

Detergenty

Answer 26

• Ich zastosowanie powoduje zwiększenie rozpuszczalności białek w próbce i zerwanie oddziaływań między lipidami i białkami
• Dotyczy to głównie białek błonowych
• Najczęściej stosowane detergenty
o Substancje niejonowe:
 Triton X-100 – eter p-1,1,3,3-tetrametylobutylofenyl polietylenoglikolowy
 Nonidet P-40 – NP-40, PEG-40 nonylofenyloeter
 Tween 80 – polisorbinian monoolejanu
o Substancje amfoteryczne
 CHAPS – 3-[3-chloamidopropylo]dimetyloamonio-1-propanosulfonian
• Detergenty jonowe mogą powodować denaturację białek
o Jedynie słabsze związki jonowe takie jak cholan i deoksycholan sodu używane są do ekstrakcji białek w formie natywnej
• Detergenty wpływają znacząco na wynik analizy w spektrometrze masowym, powodując całkowity zanik sygnałów pochodzących od składników próbki, dlatego też po zastosowaniu detergentu konieczne jest dokładne oczyszczenie analizowanego materiału (nie zawsze możliwe, bo niektóre białka wytrącają się z roztworu pozbawionego detergentu)

Question 27

Naprzemienne zamrażanie i rozmrażanie tkanek

Answer 27

• Przydatna do izolacji białek o małym stężeniu
• Tkankę zanurza się w roztworze, po czym naprzemiennie kilkakrotnie zamraża (np. w ciekłym azocie lub w etanolu z dodatkiem suchego lodu), a następnie rozmraża – podczas zamrażania tworzą się kryształki lodu powodujące rozerwanie tkanek
• Najczęściej technika łączona z SDS-PAGE

Question 28

Elektroforeza dwuwymiarowa (2-DE)

Answer 28

• W niej złożone mieszaniny białek są rozdzielane ze względu na:
1. różnice punktu izoelektrycznego (pI) – ogniskowanie izoelektryczne
2. masę cząsteczkową – elektroforeza w warunkach denaturujących (SDS-PAGE)
• przed właściwym rozdziałem oprócz homogenizacji wykonuje się wstępne zabiegi przygotowawcze m.in. usunięcie substancji mogących interferować z analizowaną próbką i powodować np. smużenie białek
• na każdym etapie należy stosować odczynniki zapobiegające powstawaniu niekorzystnych kompleksów z rozdzielanymi białkami, mogące powodować nieodwracalne modyfikacje białek (np. utlenianie metioniny, formylacja w wyniku działania większych stężeń kwasu mrówkowego, proteoliza) lub obniżyć ich rozpuszczalność
• po rozdziale otrzymuje się dużą liczbę białek możliwych do bezpośredniej analizy i identyfikacji za pomocą spektrometrii mas

Question 29

Proces rozpuszczania białek

Answer 29

• niektóre białka wyizolowane w formie natywnej są słabo rozpuszczalne
o np. białka błon komórkowych
• wzrost rozpuszczalności białek uzyskuje się stosując roztwory zawierające m.in. czynniki chaotropowe
• dodatkowo w tych roztworach znajdują się
o czynniki redukujące - zerwanie mostków disulfidowych
o inhibitory proteaz – ochrona badanych białek przed niespecyficznym trawieniem

Question 30

Czynniki chaotropowe - Proces rozpuszczania białek

Answer 30

• np. mocznik, tiomocznik
• to związki zapobiegające tworzeniu się agregatów poprzez zrywanie wiązań wodorowych i oddziaływań hydrofilowych z rozpuszczalnikiem wszystkich jonowych grup aminokwasów bocznych

Question 31

detergenty - Proces rozpuszczania białek

Answer 31

• np. CHAPS, Triton X-100, sól sodowa siarczanu dodecylu (SDS), Tween 20
• stężenie detergentu w zakresie 1-4% powoduje usunięcie niekorzystnych odziaływań hydrofobowych
• ze względu na charakter części hydrofilowej detergenty można podzielić na:
o związki jonowe – SDS
o związki niejonowe – Triton X-100, NP-40
 stosowane w badaniach natywnych form białek
o związki amfoteryczne – CHAPS, CHAPSO, ASB-14

Question 32

Odczynniki redukujące - Proces rozpuszczania białek

Answer 32

• np. ditiotreitol (DTT), 1,4-ditioerytritol (DTE), 2-merkaptoetanol, tributylofosfina (TBP), tris(2-karboksyetylo)fosfina (TCEP)
• redukują mostki siarczkowe do grup sulfhydylowych, ułatwiając rozfałdowanie białka i bardziej efektywne jego trawienie
• powstałe grupy sulhydylowe są alkilowane co zapobiega oksydacji nowo powstałych grup tiolowych
o poprawia to wydajność procesu trawienia
o związki używane w tym celu to jodoacetamid i 2-winylopirydyna

Question 33

Inhibitory proteaz - Proces rozpuszczania białek

Answer 33

• kwas etylenodiaminotetraoctowy (EDTA),
• hamują działanie endogennych proteaz uwalnianych w trakcie naruszenia struktur komórkowych, których aktywność znacznie komplikuje profil białkowy

Question 34

Oczyszczanie białek

Answer 34

• wykorzystuje się właściwości fizykochemiczne białek takie jak: ładunek, hydrofobowość, kształt cząsteczek, masa molowa, rozpuszczalność
• dobra strategia oczyszczania białek to taka, która w stosunkowo krótkim czasie, przy dużej wydajności i zachowaniu aktywności białka, prowadzi do efektywnego usunięcia zanieczyszczających składników
• identyfikacja białka metodami proteomicznymi nie wymaga zachowania jego aktywności biologicznej

Question 35

Proces zagęszczania

Answer 35

•	proces zagęszczania umożliwia identyfikację substancji o małym stężeniu, które bardzo często zawierają istotne informacje diagnostyczne o stanie komórki. Wynika to z tego, że detektory stosowane w proteomice i metabolomice są zależne od stężenia próbki w jednostce objętości (spektrofotometria, spektometria mas), dlatego ważne jest aby maksymalnie zredukować objętość próbki
•	najczęściej stosowane metody to
o	wytrącanie
o	wysalanie
o	wirowanie
o	elektoforeza
o	metody chromatograficzne
o	ekstrakcja do fazy stałej
o	ultrawirowanie

Question 36

Wirowanie

Answer 36

• polega na zastosowaniu wirowania różnicowego lub na wirowaniu w gradiencie gęstości roztworu
• pozwala to m.in. na skuteczne rozdzielenie organelli komórkowych
• bardzo często stosowane do zagęszczania białek błonowych i w proteomice organelli

Question 37

Ultrawirowanie z wykorzystaniem selektywnie przepuszczalnej membrany

Answer 37

• próbka zostaje zagęszczona przy minimalnej utracie materiału
• metoda pozwala na odsolenie próbki
• anizotropowa membrana celulozowa działa jak sito molekularne, przepuszczając podczas wirowania substancje o masie cząsteczkowej mniejszej niż podana dla danej mebrany (cut-off) i powodując przeniesienie składników o małej masie cząsteczkowej (np. soli) do dolnej części koncentratora

Question 38

• Umożliwiają jednocześnie zagęszczenie interesujących nas białek oraz analizę poprzez rozdział na żelu składników próbki ze względu na rozmiar i ładunek

Answer 38

• Jedno- i dwukierunkowa elektroforeza (1-DE i 2-DE)

Question 39

• chromatografia powinowactwa

Answer 39

o metoda przydatna do usuwania białek o największych stężeniach (surowica, osocze, płyn mózgowo-rdzeniowym), maskujących pozostałe składniki
o wada podczas badań osocza
 usunięcie (szczególnie albuminy) powoduje jednocześnie eliminację kilku innych składników krwi (białka, peptydy, kwasy tłuszczowe), które wiążą się naturalnie z albuminą, co może zaburzyć ilościowe proporcje pomiędzy poszczególnymi elementami próbki

Question 40

Wyrównanie stężeń

Answer 40

• metoda tzw. „demokratycznego” proteomu, gdzie wszystkie białka są w tych samych stężeniach
• polega na wykorzystaniu adsorpcji składników próbki na nośniku o tej samej pojemności względem wszystkich elementów
• technika ta nie pozwala zatem na oznaczenia ilościowe

Question 41

Ekstrakcja do fazy stałej (SPE)

Answer 41

• w metodzie tej wykorzystuje się mikrokolumienki wypełnione fazą stacjonarną, która służy również do wypełnienia kolumn chromatograficznych (HPLC)
• SPE stosuje się do
o Zatężania
o Oczyszczania materiału z soli, detergentów i innych zanieczyszczeń
• Produkty rozdziału charakteryzują się wysokim stopniem czystości oraz stężeniem, umożliwiającym identyfikację produktów oczyszczania technikami takimi jak spektrometria mas
• Objętość próbki może być zminimalizowana do nawet kilku mikrolitrów

Question 42

Mikroekstrakcja do fazy stacjonarnej

Answer 42

• Umożliwia zagęszczanie, odsalanie i wstępną separację zarówno próbek ciekłych jak i gazowych w bardzo małych objętościach
• Obejmuje dwa etapy:
o Adsorpcja substancji obecnej w analizowanej próbce do warstwy adsorbentu – np. wymieniacz jonowy lub układ odwróconych faz
o Przeniesienie analizowanej substancji do odpowiedniego systemu wprowadzania próbki (gazowy lub ciekły), w którym następuje desorpcja substancji bezpośrednio do stanu gazowego lub ciekłego

Question 43

Kolumny micro-spin

Answer 43

• służą do oczyszczania, odsalania i zatężania bardzo małych ilości próbek (do 200 μl)
• w kolumience znajduje się odpowiednia faza stacjonarna, na którą nanosi się próbkę, po czym kolumnę poddaje się kilkukrotnemu wirowaniu
• zanieczyszczenia mechaniczne w próbce nie są przepuszczalne przez złoże
• podczas kolejnych wirowań eluuje się pożądane białka
• próbkę można wstępnie rozdzielić za pomocą ogniskowania do punktu izoelektrycznego w roztworze

Question 44

Ograniczenia CHROMATOGRAFIA GAZOWA W POŁĄCZENIU ZE SPEKTROMETRIĄ MAS (GC-MS)

Answer 44

• niski zakres pomiarowy
• wiele związków (np. witaminy, sacharydy, hormony) należy poddać derywatyzacji – dodatkowej reakcji chemicznej, zwiększającej lotność związku

Question 45

Zalety CHROMATOGRAFIA GAZOWA W POŁĄCZENIU ZE SPEKTROMETRIĄ MAS (GC-MS)

Answer 45

• prostota
• bardzo dobra zdolność rozdzielcza i powtarzalność
• spektrometr masowy zapewnia specyficzność strukturalną
• powtarzalność uzyskanych widm masowych
o możliwość posługiwania się bibliotekami widm znacząco zwiększa identyfikację związków endogennych
• szybkość rozdziału
• niewielkie koszty
• dodatkowe usprawnienia takie jak wielowymiarowa GC x GC-MS czy GC w połączeniu z wysokorozdzielczymi analizatorami np. analizatorem czasu przelotu, znacząco wpływają na niezawodność identyfikacji metabolitów

Question 46

Zastosowanie CHROMATOGRAFIA GAZOWA W POŁĄCZENIU ZE SPEKTROMETRIĄ MAS (GC-MS)

Answer 46

• identyfikacja metabolizmu leków – farmakokinetyka
• identyfikacja wpływu leków na funkcjonowanie organizmów – farmakologia
• odkrywanie nowych bioaktywnych metabolitów
• identyfikacja cukrów, amin, alkoholi, narkotyków, substancji dopingujących, pestycydów, dioksyn
• identyfikacja kwasów organicznych we krwi, płynie mózgowo-rdzeniowym, moczu – badanie metabolomu ssaków
• zastosowanie w chemii klinicznej i profilowaniu metabolitów
• ilościowe oznaczenie składników złożonych próbek

Question 47

CHROMATOGRAFIA GAZOWA W POŁĄCZENIU ZE SPEKTROMETRIĄ MAS (GC-MS) Zasada działania

Answer 47

• wykorzystuje się kolumny kapilarne (o przekroju 300 μm) o długości około 30m
• kolumny nie są wypełnione w całej objętości fazą stacjonarną, która przylega do ścianek kapilary w postaci cienkiej warstwy, której właściwości decydują o charakterze związków rozdzielanych na danej kolumnie
• wykorzystuje się różnice we właściwościach fizykochemicznych poszczególnych składników, decydujących o czasie retencji (czasie po którym składnik trafi do detektora – np. spektrometr masowy z jonizacją elektronami (EI))

Question 48

Dwuwymiarowa (dwukierunkowa) separacja GCxGC, w połączeniu z detekcją za pomocą spektrometrii mas (GCxGC-MS)

Answer 48

• Służy do rozdziału i identyfikacji złożonych mieszanin biologicznych
• w tej metodzie używa się dwóch kolumn, z różnymi typami fazy stacjonarnej, a więc wykorzystującymi różne właściwości fizykochemiczne cząsteczek w czasie rozdziału
• proces separacji zachodzący w kolumnie pierwszej jest odmienny od mechanizmu rozdziału w drugiej kolumnie

Question 49

Derywatyzacja

Answer 49

• dodatkowa reakcja chemiczna, zwiększająca lotność związku
• w zależności od obecności różnych grup funkcjonalnych, w analizowanych związkach stosuje się odpowiednie reakcje derywatyzacji - sililacja, acylacja, alkilacja

Question 50

Elektroforeza

Answer 50

to zjawisko rozdziału elektrokinetycznego wykorzystujące migrację cząsteczek naładowanych niezrównoważonym ładunkiem, pod wpływem przyłożonego pola elektrycznego. Służy do izolacji makrocząsteczek w układach biologicznych, jako narzędzie dostarczające informacje na temat masy cząsteczkowej, modyfikacji struktury, ładunku, czystości preparatu, a także do wykrywania peptydów, białek i kwasów nukleinowych.

Question 51

Rozdział elektroforetyczny – zasada działania

Answer 51

• przyłożenie pola elektrycznego wymusza ruch cząsteczek nałożonych na żel, a odległość jaką są one w stanie pokonać, zależy od wielkości porów układu rozdzielającego, masy cząsteczkowej rozdzielanych substancji i ich wypadkowego ładunku
• ruch dużych cząsteczek jest spowalniany poprzez regulację wielkości porów i w efekcie są one zlokalizowane w górnym fragmencie żelu
• tempo migracji cząsteczek jest wartością stałą, zależną od natężenia pola elektrycznego, rozmiaru i kształtu cząsteczki, hydrofobowości, siły jonowej, lepkości i temperatury
• Układ zasilający jest skonstruowany tak aby utrzymać stałą wartość jednego z parametrów: natężenia prądu, napięcia lub mocy
• W trakcie rozdziału oporność elektrolitu ulega zmianom
o Obniża się ze wzrostem temperatury
o Rośnie wraz z ubytkiem jonów oraz ich uporządkowaniem w układzie
• Wraz ze wzrostem temperatury wydłuża się czas rozdziału, a tym samym pojawia się wzmożona dyfuzja cząsteczek i utrata ich aktywności biologicznej
• Elektroforezę
o Białek prowadzi się przy stałej wartości natężenia prądu
o Kwasów nukleinowych prowadzi się przy stałej wartości napięcia prądu

Question 52

Polimeryzacja żelu poliakrylamidowego (PAGE, ang. polyacrylamide gel electrophoresis)

Answer 52

• Żel poliakrylamidowy powstaje wskutek polimeryzacji dwóch toksycznych składowych: akrylamidu i N,N1-metylenobisakrylamidu (bisakrylamidu, odpowiedzialnego za usieciowanie układu)
• Polimeryzacja rozpoczyna się po podaniu APS (nadsiarczan amonu) w obecności katalizatora DMAP (β-dimetyloaminopropionitryl) lub TEMED (N,N,N1,N1-tetrametyletylenoamina)
• Rozdział cząsteczek jest uwarunkowany wielkością porów uformowanych wewnątrz żelu, która może być modyfikowana przez zmianę proporcji akrylamidu do bisakrylamidu
• Wzrost ilości akrylamidu powoduje zmniejszenie wielkości porów
• Proces polimeryzacji zależy od stężenia żelu i obecności katalizatora
• W temperaturze pokojowej polimeryzacja trwa 20-30 min, natomiast utworzenie kompletnego usieciowania około 12 godzin
• Inhibitorem polimeryzacji jest tlen

Question 53

• W żelu zagęszczającym następuje

Answer 53

skupienie analizowanej substancji w wąskim pasie startowym, co sprawia że wszystkie białka rozpoczynają rozdział od tego samego punktu – powodując wzrost rozdzielczości

Question 54

Przygotowanie próbki - elektroforeza

Answer 54

• Usunięcie mostków disiarczkowych
o Prowadzi do rozfałdowania łańcuchów białek
o Ułatwia kontakt enzymów proteolitycznych (trypsyna, chymotrypsyna, pepsyna, karboksypeptydazy) z miejscami trawienia
o Czynniki redukujące: DTT, BME, DTE, TBP, TCEP
o Przed ponownym tworzeniem się mostków disiarczkowych zabezpiecza jodoacetamid lub winylopiridina, które powodują alkilację/zablokowanie grup tiolowych –SH
• Rozpuszczanie białek z użyciem detergentu powoduje zanik oddziaływań hydrofobowych między domenami białka, a tym samym chroni przed utratą materiału na skutek agregacji i precypitacji
• Duże stężenia soli w próbce bardzo często powodują zakłócenia analiz w skutek wysokiego napięcia podczas rozdziału elektroforetycznego, powodując smugi i niejednorodne prążki

Question 55

Elektroforeza w warunkach natywnych (niedenaturujących, ang. native PAGE)

Answer 55

• Powoduje rozdział aktywnych biologicznie kompleksów białkowych ze względu na gęstość ładunku na powierzchni cząsteczek
• Metoda ta pozwala na badanie interakcji białko-białko, śledzenie zmian ładunku wypadkowego cząsteczek i ich konformacji, obserwację agregatów i stabilności analizowanego materiału oraz rozdział białek o właściwościach silnie hydrofobowych np. białek błonowych
• Przygotowanie próbki – rozpuszczenie analizowanych białek w niejonowym detergencie (Triton X-100), a następnie dodaniu barwnika błękitu Coomassie tworzącego z białkami kompleksy anionowe, które w trakcie rozdziału będą zmierzały do anody

Question 56

Elektroforeza w warunkach denaturujących (SDS-PAGE, ang. sodium dodecyl sulfate-polycrylamide gel electrophoresis)

Answer 56

• Technika rozdziału białek i kwasów nukleinowych
• Szybka, łatwa do wykonania, powtarzalna,
• szeroki zakres masy cząsteczkowej rozdzielanych substancji
• umożliwia późniejszą identyfikację rozdzielanych białek z użyciem nie tylko spektrometrii mas, ale też western blottingu, bądź technik radiograficznych
• próbka migruje w żelu w obecności SDS, anoniowego detergentu powodującego denaturację białek, zanik oddziaływań między- i wewnątrzcząsteczkowych oraz utratę wpływu ładunku cząsteczki na rozdział. Nadaje cząsteczkom jednolity ładunek ujemny, co przyczynia się do poprawienia wskaźnika rozdzielczości techniki.

Question 57

Żel agarozowy

Answer 57

• Nadaje się do rozdziału dużych cząsteczek
• Żele przygotowuje się z agarozy – wielocukru, który w temperaturze powyżej 40oC jest w stanie płynnym, a po ochłodzeniu zescala się do postaci żelu, którego usieciowanie zależy od stężenia wielocukru
• Zalety
o Szybkość przygotowania
o Możliwość separacji substancji wielkocząsteczkowych
• Wada – trudność utrwalania po rozdziale

Question 58

Tricyna/SDS-PAGE

Answer 58

• To technika, w której glicynę z SDS-PAGE zastąpiono tricyną
• Tricyna, która szybciej wędruje po polu elektrycznym pozwala na rozdzielenie peptydów o masie już od 500 Da

Question 59

• Zastosowanie Kwas octowy/mocznik PAGE umożliwia

Answer 59

identyfikowanie form tego samego białka

Question 60

Barwienie

Answer 60

• To proces wizualizacji pozwalający na dalszą analizę jakościową i ilościową
• Proces wizualizacji powinien być
o Nietoksyczny
o Szybki
o Tani
o Kompatybilny z MS
o Intensywność zabarwienia prążka powinna spełniać zależność liniową od stężenia białka w odpowiednio szerokim zakresie

Question 61

Błękit Coomassie (CBB)

Answer 61

• Barwnik organiczny
• Wykorzystywany do wykrywania białek na żelu, z czułością 8-10ng
• W środowisku kwasowym cząsteczki barwnika wiążą się do grup aminowych łańcucha polipeptydowego poprzez oddziaływania hydrofobowe
• Roztwór koloidalny CBB zapewnia lepszą powtarzalność i nie wymaga dodatkowego odbarwiania
• Zalety
o Pozwala na ilościowe wiązanie barwnika do białka
o Dobra powtarzalność
o Niski koszt
o Wybarwianie gwarantuje wykrywalność przy użyciu MS

Question 62

Sole srebra

Answer 62

• Wysoka czułość
• Detekcja opiera się na precypitacji srebra na powierzchni żelu w postaci ciemnobrunatnych plamek na jasnym tle
• Dwie techniki: barwienie w środowisku kwasowym i alkalicznym
• Wysoka powtarzalność i możliwość analizy ilościowej
• Wady
o Wieloetapowa i czasochłonna procedura
o Niski zakres liniowości co powoduje zakłamanie wyników przy dużych stężeniach

Question 63

Barwienie fluorescencyjne

Answer 63

• szeroki zakres liniowości oraz wysoka powtarzalność
• można je stosować przed i po rozdziale elektroforetycznym
• Jednoetapowy i łatwy proces, który można wykorzystać do wysokowydajnych analiz na wielką ska
• Barwienie białek przed ich rozdziałem elektroforetycznym, z użyciem jednocześnie kilku różnych barwników do każdej z próbek, umożliwia przeprowadzenie eksperymentu z porównaniem proteomów w identycznych warunkach, eliminując w ten sposób różnice pomiędzy obrazami

Question 64

Znakowanie radioaktywne izotopami

Answer 64

• Wykorzystywane izotopy: 125I, 131I, 14C, 35S, 1H
• Odbywa się przed rozdziałem elektroforetycznym
• Rzadko stosowane w proteomice
• Niska powtarzalność i zaostrzone wymogi BHP
• Wysoka czułość
• Metoda nie jest przystosowana do badań w MS, ponieważ stężenie wyrytych białek jest do dalszych analiz zbyt małe

Question 65

• Zastosowania 2-DE

Answer 65

o wizualizacja zmian potranslacyjnych (zmienia się wówczas masa i ładunek wypadkowy cząsteczek)
o oznaczanie profilu białkowego – próbkę biologiczną rozdziela się i obrazuje na żelu, a następnie poddaje analizie komputerowej; można wtedy zaobserwować pojawienie się lub zniknięcie niektórych prążków, lub zmianę ich lokalizacji, świadczącą o możliwych modyfikacjach lub zmianę intensywności zabarwienia sugerującą zmiany ilościowe

Question 66

Zalety i wady 2-DE

Answer 66

• Zalety
o Możliwość obserwacji m.in. modyfikacji potranslacyjnych, częściowej proteolizy, poziomu ekspresji białek
o Analiza przy użyciu MS
o Umożliwia rozdział nawet kilku tysięcy białek jednocześnie
o Umożliwia detekcję około 1 ng substancji w pojedynczym prążku
• Wady
o Ograniczona ilość nakładanej próbki
o Czasochłonność
o Brak pełnej automatyzacji
o Mała powtarzalność
o Niezadowalająca rozdzielczość białek – zwłaszcza silnie kwasowych lub zasadowych

Question 67

Przygotowanie próbki do rozdziału 2-DE

Answer 67

• próbkę przed rozdziałem należy poddać homogenizacji, inaktywacji lub usunąć z niej interferujące substancje oraz rozpuścić
• modyfikacje analizowanych substancji powinny być ograniczone do minimum, ze względu na powstawanie artefaktów w obrazie żelu
• enzymy powinny być inaktywowane, a próbek zawierających mocznik nie należy podgrzewać
• większość białek jest rozdzielanych w przedziale pH 4-7, dlatego aby polepszyć wyniki separacji należy zastosować prefrakcjowanie, w celu zredukowania złożoności próbki

• substancje chaotropowe pozwalają na rozprostowanie łańcuchów białek i eksponowanie ich końców hydrofobowych na skutek obniżenia energii wiązań wodorowych
o mocznik
 destabilizuje oddziaływania niekowalencyjne i jonowe między resztami aminokwasowymi
o tiomocznik
 poprawia rozpuszczalność białek (także błonowych) w roztworze wodnym
• najczęściej stosowane surfaktanty: SDS lub detergenty niejonowe (NP-40, Triton X-100, CHAPS)
o zapobiegają precypitacji białek w żelu
• często stosowane czynniki redukujące mostki disiarczkowe to: DTT, DTE,
2-merkaptoetanol, TCEP, TBT
• należy pamiętać o ograniczeniu stężenia soli w próbce, ponieważ zakłócają one migrację cząsteczek, przez co powstają na żelu smugi i niejednorodne prążki

Question 68

• sposoby prefrakcjonowania próbki

Answer 68

o izolacja tylko określonych komórek z tkanki za pomocą LCM
o rozdział organelli przez wirowanie w gradiencie sacharozy
o selektywna precypitacja, np. TCA/aceton do białek rybosomalnych
o sekwencyjna ekstrakcja w rozpuszczalnikach organicznych
o ekstrakcja w roztworach detergentów
o metody chromatograficzne

Question 69

Pierwszy wymiar 2DE – ogniskowanie izoelektryczne (IEF)

Answer 69

• rozdział polega na skupianiu białek charakteryzujących się podobnym ładunkiem wypadkowym w utworzonym gradiencie pH
• separację prowadzi się na paskach żelowych IPG
• w celu bezpiecznego przechowywania paski występują w postaci liofilizowanej i należy je poddać dehydratacji tuż przed rozdziałem
o rehydratacja zachodzi w buforze: mocznik, tiomocznik, DTT, detergent niejonowy (najczęściej CHAPS)
• próbki można nakładać poprzez bezpośrednią rehydratację zliofilizowanych pasków, lub przez nakładanie na już zrehydrowane paski za pomocą buforu
• aby uniknąć precypitacji białek i zapobiec poziomemu smużeniu na obrazie żelu, zaleca się stosować mniejsze natężenie prądu na początku ogniskowania i zwiększać je do maksimum, gdy białka wnikną między pory żelu SDS-PAGE
• na początku ogniskowania najbardziej ruchliwe sole wędrują do elektrod, a próbka ulega odsoleniu

Question 70

Równoważenie pasków IPG

Answer 70

• proces przeprowadzany przed rozpoczęciem rozdziału w drugim kierunku 2-DE
• przebieg
o pierwszy etap
 prowadzi się w buforze zawierającym Tris-HCl, pH 8,8, 2% SDS, 1% DTT, 6M mocznik w obecności glicerolu (zapobiega elektroosmozie)
o Drugi etap
 prowadzi się w buforze zawierającym Tris-HCl, pH 8,8, 2% SDS, 1% jodoacetamid, 6M mocznik w obecności glicerolu
• Równoważenie powoduje odmycie białek, które nie wniknęły do żelu – utrata 20% materiału
• Proces cechuje się dużą powtarzalnością

Question 71

Umieszczanie pasków IPG na żelu SDS-PAGE

Answer 71

• Należy zapewnić bezpośredni kontakt pasków IPG z żelem na całej długości
• Unieruchomienie paska następuje poprzez jego zalanie agarozą, z jednoczesnym usuwaniem bąbelków powietrza

Question 72

Drugi wymiar 2de- SDS-PAGE

Answer 72

• W drugim wymiarze zogniskowane wcześniej białka przenosi się na żel SDS-PAGE
• Próbka rozdzielona podczas IEF znajduje się na pasku IPG
• W celu wizualizacji rozdzielonych białek należy zastosować barwienie
o Dobór metody dostosowany do potrzeb eksperymentu
o Barwienie powinno charakteryzować się wysoką czułością, szerokim zakresem liniowości, powtarzalnością i kompatybilnością z MS

Question 73

Etapy analizy komputerowej skanów żeli za pomocą specjalistycznego oprogramowania

Answer 73

1. Otrzymanie cyfrowego obrazu żelu
2. Korekcja różnic w położeniu plamek, przez znalezienie regionów odpowiadających sobie (nakładających się) na wszystkich żelach pochodzących z eksperymentu
3. Stworzenie mapy proteomu na podstawie połączenia informacji ze wszystkich skanów – obraz połączony
4. Wykrycie i opisanie plamek na tak powstałym połączonym obrazie, przez opisanie ich granic i punktu centralnego – wzór rozmieszczenia plamek
5. Zastosowanie wzoru rozmieszczenia plamek do wszystkich żeli w eksperymencie w celu znalezienia i powiązania odpowiadających sobie plamek na wszystkich żelach. Przemodelowanie granic plamek ustalonych wstępnie na tak połączonym obrazie aby odpowiadały one oryginalnej intensywności zabarwienia na poszczególnych żelach
6. Analiza profilu ekspresji danego białka na poszczególnych żelach i wskazanie plamek różnicujących grupy żeli do dalszej identyfikacji

Question 74

Różnicowa elektroforeza żelowa (DIGE)

Answer 74

• Metoda ta pozwala na bezpośredni pomiar ilościowy intensywności plamek dla rozdzielanej pary próbek oraz wzrasta pewność, że wykryte różnice w intensywności plamek wynikają z przyczyn biologicznych, a nie są spowodowane błędami technicznymi
• Umożliwia rozdział kilku próbek na jednym żelu, zmniejszając ilość żeli koniecznych do przeprowadzenia eksperymentu. Umożliwia to szybszą i bardziej powtarzalną identyfikację różnic w ekspresji białka pod wpływem określonych czynników

Question 75

Barwniki fluorescencyjne stosowane w DIGE

Answer 75

• Barwniki fluorescencyjne stosowane w DIGE to barwniki cyjanowe CyDe: Cy2, Cy3, Cy5
o Barwniki fluorescencyjne są kompatybilne z metodami identyfikacji białek, w których wykorzystuje się spektrometrię mas

Question 76

Standard wewnętrzny DIGE

Answer 76

• Standard wewnętrzny pozwala na
o wyeliminowanie różnic w intensywnościach plamek, których przyczyną nie jest badany proces biologiczny, ale niedoskonałości metody rozdziału (2-DE)
o rozróżnienie zmienności wynikającej z działania procesu biologicznego od związanej z metodą rozdziału
• standard wewnętrzny to mieszanina takich samych ilości białka pochodzących ze wszystkich eksperymentalnych próbek biorących udział w rozdziale
• zastosowanie standardu ułatwia dopasowywanie żeli będących powtórzeniem danego eksperymentu

Question 77

Techniki znakowania stosowane w DIGE

Answer 77

Barwienie minimalne
• wykorzystuje się w nim wszystkie trzy barwniki przyłączone, odpowiednio do próbki kontrolnej, doświadczalnej i standardu wewnętrznego
• barwienie minimalne stosujemy gdy istnieje możliwość uzyskania około 50μg białka w próbce – analiza tkanek, gęsto rosnących komórek z hodowli komórkowych
• barwniki Cy2, Cy3, Cy5 łączą się przez reaktywną grupę estrową
N-hydroksysukcynyloimidylową, z grupą aminową lizyny
• stosunek ilości barwnika do próbki powinien być bardzo mały, tak aby barwnik wyznakował tylko 3-5% reszt lizyny zawartej w próbkach

Barwienie nasycone
• w metodzie tej wybarwiają się wszystkie cysteiny w próbce w określonych warunkach
• aby uzyskać wysoką wydajność znakowania, konieczny jest wysoki stosunek ilości barwnika do próbki
• wykorzystuje się fluorofory Cy3 i Cy5, które zawierają reaktywną grupę maleimidową, zaprojektowaną w taki sposób aby stworzyć wiązanie kowalencyjne z grupą tiolową cysteiny przez wiązanie tioestrowe
• analizowana próbka musi być zredukowana przez znakowaniem

Question 78

Ogniskowanie do punktu izoelektrycznego (IEF)

Answer 78

• Ogniskowanie do punktu izoelektrycznego to metoda rozdziału i zagęszczania cząsteczek amfoterycznych (białek i peptydów), które mają zdolność zachowywania się jak kwasy lub zasady w odpowiednim pH. IEF polega na koncentrowaniu białek w segmentach o ściśle określonym pH, odpowiadającym wartości pI (punkt izoelektryczny cząsteczek)
• Mechanizm zagęszczania opiera się na wykorzystaniu zmian ładunku wypadkowego cząsteczki białka, który jest determinowany przez boczne łańcuchy zasadowe lub kwasowe, grupy prostetyczne, modyfikacje potranslacyjne lub na skutek zmiennego pH środowiska otaczającego rozdzielane cząsteczki
• Całkowity ładunek określa kierunek migracji cząsteczki
o Białko porusza się w kierunku elektrody o przeciwnym ładunku
o W pH poniżej pI białko zmierza w kierunku katody (ujemnie naładowana elektroda)
• Cząsteczka zostaje zogniskowana w wąskim przedziale pH
• Rozdzielczość techniki IEF zależy od zakresu zastosowanego gradientu pH, czasu ogniskowania, rodzaju roztworu buforującego, amfolitu i aparatury
• IEF przeprowadza się przy stałej mocy prądu aby zapobiec przegrzaniu układu

Question 79

Możliwości zastosowań ogniskowania do punktu izoelektrycznego

Answer 79

• IEF jest pierwszym etapem elektroforezy dwuwymiarowej
o Połączenie techniki IEF z SDS-PAGE pozwala na obrazowanie ładunku i wielkości cząsteczki w pojedynczym eksperymencie
o Umożliwia to obserwację izoform białek powstałych na skutek modyfikacji potranslacyjnych
• Żel agarozowy w IEF stosuje się do frakcjonowania dużych białek
• IEF wykorzystywane jest przez komórki eukariotyczne do zapewnienia odpowiedniego środowiska reakcji, w celu uniknięcia dyfuzji reagentów i enzymów regulujących procesy biologiczne

Question 80

• W celu przeniesienia rozdzielonych elektroforetycznie substancji z żelu na membranę stosuje się dwa różne układy – transfer swobodny i elektrotransfer

Answer 80

• Transfer swobodny - odbywa się pod wpływem sił napięcia powierzchniowego buforu. Następuje wznoszenie kapilarne buforu przez warstwy bibuły, pomiędzy którymi znajdują się przylegające do siebie żel i membrana. To tani i najprostszy sposób, jednak czasochłonny i charakteryzujący się niską wydajnością transferu
• Elektrotransfer, transfer elektroforetyczny - przejście polipeptydów na membranę prowadzi się przez przyłożenie pola elektrycznego. Można wyróżnić dwie wersje elektrotransferu – mokrą lub półsuchą
o Elektrotransfer mokry
 Przeprowadza się w naczyniu wypełnionym buforem
 Zastosowanie przy żelach poliakrylamidowych używanych w zminiaturyzowanych aparatach
 Stosowany do przeniesienia białek natywnych
o Elektrotransfer półsuchy
 Polega na obłożeniu żelu i błony kilkoma warstwami bibuły nawilżonej buforem, którą umieszcza się pomiędzy dwiema płytowymi elektrodami o tych samych wymiarach
 Tańsza i krótsza metoda w porównaniu z elektrotransferem mokrym
 Możliwość zastosowania nieciągłego układu buforów – różnych buforów po stronie katody i anody

Question 81

Rodzaje membran stosowanych do transferu

Answer 81

• Najczęściej wykorzystuje się membrany nitrocelulozowe, poliwinylidenowe (PVDF) oraz nylonowe
• Adsorpcja białek do błony odbywa się głównie na skutek oddziaływań hydrofobowych oraz oddziaływań elektrostatycznych

• wybór membrany powinien uwzględniać takie parametry jak
o wielkość i ładunek przenoszonych białek
o pojemność wiązania
 białka o małej masie cząsteczkowej mogą łatwo dyfundować przez niektóre membrany, a inne z kolei mogą je silnie zatrzymywać
o natura białka
 białka takie jak haptoglobulina lub μ-glikoproteina lepiej wiążą się do membran nylonowych niż do błon PVDF

Question 82

• Wybór buforu do transferu białek zależy od

Answer 82

o Natury przenoszonych białek – ich wielkość, ładunek elektryczny, stopień potranslacyjnej modyfikacji
o Typu żelu – stężenie poliakrylamidu, rozmiary żelu
o dodatki różnych substancji mogą znacząco zwiększyć wydajność transferu
 metanol
• zapobiega pęcznieniu żelu
• wzmacnia adsorpcję białek na błonach nitrocelulozowych i PVDF,
 SDS
• Zwiększa prędkość przenoszenia białek z żelu na membranę
• Może osłabiać wiązanie białek do membrany
• Powoduje zwiększenie natężenia prądu, a przy tym również wzrost temperatury, a wtedy układ do transferu wymaga chłodzenia

Question 83

• wydajność transferu białek na membranę zależy od różnych czynników związanych z

Answer 83

o	naturą białek – wielkość, ładunek
o	stosowanym sprzętem – wersja transferu, napięcie elektryczne
o	rodzajem membrany
o	stosowanymi buforami
o	czasem trwania transferu

Question 84

Barwienie białek bezpośrednio na membranie blotting

Answer 84

• Niespecyficzne wybarwianie wszystkich prążków białkowych wykonuje się do oceny ogólnej efektywności transferu lub w celu odniesienia interesującego sygnału względem innych białek, np. markerów masy cząsteczkowej
• Jeśli ostateczna analiza będzie obejmować immunodetekcję, pożądane jest zastosowanie wstępnego barwienia odwracalnego
• Do trwałego wybarwiania membran nitrocelulozowych i PVDF nadają się takie barwniki organiczne jak CBB, czerń amidowa, tusz indyjski, złoto i srebro koloidalne, znaczniki fluorescencyjne

Question 85

Blokowanie i przemywanie błon

Answer 85

• Ważnym etapem w immunoblotingu jest blokowanie wolnej powierzchni na membranie, prowadzone po transferze, w celu zmniejszenia niespecyficznego wiązania przeciwciał do membrany
• Wybór odpowiedniej substancji blokującej może wzmacniać czułość metody poprzez redukcję tzw. tła
• Najczęściej stosowane substancje blokujące to odtłuszczone mleko 1-5% lub albumina surowicy bydlęcej 0,5-3%, rozpuszczone w buforowanych roztworach TBS lub PBS
• Idealny bufor blokujący zapełnia całą wolną powierzchnię membrany bez oddziaływania z innymi białkami
• Podczas analizy membranę należy kilkukrotnie przemywać w celu usunięcia nadmiaru niezwiązanych reagentów

Question 86

Immunodetekcja

Answer 86

• Zastosowanie immunodetekcji pozwala na jakościową i ilościową analizę specyficznych białek, przeniesionych po rozdziale elektroforetycznym na membranę
• Po usunięciu nadmiaru przeciwciał przeprowadza się kolejne etapy analizy, których ostatecznym celem jest wprowadzenie w miejsce w którym znajduje się wykrywane białko, znacznika umożliwiającego jego wizualizację i ewentualnie ilościowe oznaczenie
• Roztwory przeciwciał często przygotowuje się w buforze stosowanym do przemywania membrany, dodatkowo wzbogaconym w substancję blokującą oraz detergent, co pozwala na zminimalizowanie tła detekcji na membranie

Question 87

PRZYKŁADY ZASTOSOWANIA BLOTINGU BIAŁEK W PROTEOMICE

Answer 87

• identyfikacji aktywnego białka na membranie można dokonać posługując się ligandem podstawionym znacznikiem
• bloting powinowactwa - przyłączenie niezmodyfikowanego ligandu do białka wiążącego na membranie, a następnie przeprowadzenie detekcji ligandu, np. za pomocą specyficznego wobec niego, wyznakowanego przeciwciała
• wykorzystywane ligandy – GTP, jony wapnia, toksyny jadu węży, hormony, kwasy nukleinowe, wirusy, komórki
Wykrywanie białek wiążących różne ligandy

Analiza glikoprotein za pomocą lektyn – nakładka lektynowa
• lektyny, aglutynin to poliwalencyjne białka wiążące oligosacharydy, charakteryzujące się bardzo różną specyficznością wiązania
• wybierając odpowiedni zestaw lektyn można przeprowadzić prostą detekcję glikoprotein na membranach po blotingu, w celu uzyskania informacji o strukturze ich składników cukrowych

Detekcja ufosforylowanych białek
• najczęściej stosowana do specyficznej analizy miejsc fosforylacji w białkach
• zazwyczaj gdy białka poddaje się hydrolizie do dalszej analizy, ilość peptydów

Wielokrotna detekcja białek z użyciem Qdot western bloting
• pozwala na ilościową, jednoczesną analizę różnych białek
• przeciwciało drugorzędowe znakowane jest dzięku użyciu tzw. kropek kwantowych (Qdot – nanokryształ złożony z jądra (CdSe) i otoczki (ZnS))
• nanokryształ pochłania światło w szerokim zakresie spektralnym, natomiast emisja następuje przy specyficznych długościach fali, zależnie od jego rozmiaru i geometrii
• emitowane światło ma wyjątkową fotostabilność i wysoką intensywność
• ostateczną detekcję i analizę wykonuje się za pomocą elektronicznych systemów skanujących blot i analizujących jego fluorescencję

Wykrywanie aktywności enzymatycznych po blotingu
• renaturujący bloting katalityczny
o technika przydatna w badaniach enzymów zakotwiczonych w błonach komórkowych
o po transferze białek i zablokowaniu wolnych miejsc na membranie, enzymy poddawane są renaturacji poprzez ich inkubację w PBS w obecności różnych dodatków, np. albuminy
o w celu przeprowadzenia reakcji enzymatycznej, żel agarozowy umieszcza się bezpośrednio na membranie, a produkt reakcji enzymatycznej zostaje ulokowany na tym żelu
o membrana o transferze może być wykorzystana do dalszej analizy na zasadzie immunodetekcji

Question 88

Electrospray (elektrorozpraszanie, elektrorozpylanie, ESI)

Answer 88

• źródło jonów służące do jonizacji cząsteczek, makrocząsteczek oraz kompleksów niekowalencyjnych
o analiza cząsteczek o stosunkowo dużej masie - próbki biologiczne
o analiza substacji o niewielkiej masie cząsteczkowej – np. cząsteczek charakteryzujących się niewielką trwałością podczas jonizacji innymi technikami (łatwo rozpada się w sposób niekontrolowany)
o obserwacja intensywnych jonów pseudomolekularnych – np. niekowalencyjnych połączeń między cząsteczkami
o przeprowadzenie fragmentacji jonów
o projektowanie eksperymentów metabolicznych

Question 89

Cechy techniki electrospray decydujące o unikalności metody

Answer 89

• jonizacja pod ciśnieniem atmosferycznym
o analizie podlegają substancje znajdujące się w roztworach
• wielokrotna jonizacja
o jonizacja cząsteczek wielokrotnym ładunkiem pozwala na obserwację pików na widmie masowym w obszarze odpowiednio niskich wartości m/z (cząsteczki o dużej masie są obserwowane w niskim zakresie m/z)
• łagodna jonizacja
o ESI jest jedną z najłagodniejszych metod jonizacji i praktycznie nie obserwuje się znaczącej fragmentacji badanej substancji

Question 90

• Proces jonizacji – przebieg

Answer 90

o Lekko zakwaszony roztwór próbki wprowadza się do pierwszej z kapilar źródła jonów
o Na skutek działania silnego pola elektrycznego w pierwszej kapilarze, roztwór opuszczający kapilarę wydłuża się w tzw. stożek Taylora, od które końca odrywają się niewielkie kropelki cieczy
 Dodatek kwasu sprzyja odrywaniu kropelek na skutek zwiększonej przewodności roztworu
 W kropelkach znajdują się cząsteczki rozpuszczalnika, wolne protony, obojętne cząsteczki substancji analizowanej
 Wolne protony na skutek działania pola elektrycznego, grupują się w przypowierzchniowej warstwie każdej kropelki
o W trakcie odparowywania rozpuszczalnika, protony zbliżają się do siebie, a siła oddziaływania pomiędzy ich ładunkami przeciwdziała sile napięcia powierzchniowego cieczy. W chwili gdy siły odpychania ładunków jednoimiennych zyskują wartość wyższą niż siła napięcia powierzchniowego, kropla rozrywa się
o Po rozpadzie mniejsze kropelki odzyskują warunek stabilności – tj. napięcie powierzchniowe przeważa nad odpychaniem elektrostatycznym jednoimiennych ładunków, aż do odparowania kolejnej porcji rozpuszczalnika
o Proces rozrywania kropli aerozolu powtarza się kilkakrotnie. W malejących kropelkach roztworu następuje zagęszczenie ładunków (protonów) i zbliżenie ich do grup nukleofilowych cząsteczek analizowanej substancji, co sprzyja utrzymaniu zasocjowanych ładunków w obrębie tych cząsteczek, a więc powstaniu jonów

Question 91

Rozpad w źródle jonów (ISD, ang. in source decay)

Answer 91

pozwala na
o przeprowadzenie fragmentacji w urządzeniach wyposażonych w jeden analizator nie będący pułapką jonów
o redukcję ilości sygnałów na widmie masowym pochodzących od adduktów sodowych i potasowych poprzez zwiększenie energii powstających w źródle jonów i destabilizację ich niekonwalencyjnych połączeń z adduktami

Question 92

Nanoelectrospray (nanoESI, nanospray)

Answer 92

• w technice tej używa się kapilar doprowadzających roztwór o znacznie mniejszych średnicach względem typowego źródła (rzędu ułamka do kilku mikrometrów średnicy wewnętrznej) – dzięki temu wzrasta efektywność jonizacji oraz czułość analiz
• na skutek bardzo niewielkich przepływów roztworu, ilość próbki zużytej do analizy jest bardzo niewielka – wykorzystując kilkadziesiąt nanolitrów próbki można uzyskać pełne widmo masowe oraz wykonać fragmentację wielu lub wszystkich składników próbki
• zwiększona czułość techniki jest spowodowana efektywniejszą jonizacją substancji znajdujących się w roztworze i wprowadzanych z bardzo małą prędkością
• technikę tę często wykorzystuje się do
o analiz w systemach połączonych typu kapilarna HPLC – nanoESI-MS
o tam gdzie klasyczny electrospray zawodzi
• zastosowanie techniki nanoESI-MS
o zastosowanie kapilarnego chromatografu cieczowego do wstępnej separacji próbki
o bardzo mała ilość materiału
o analizie podlegają składniki próbki występujące w bardzo małych stężeniach
o długotrwała analiza próbki o bardzo małej dostępności

Question 93

DESI (ang. desorption by electrospray)

Answer 93

• technika obrazowania powierzchni, wykorzystująca źródło jonów typu electrospray
• kapilara doprowadzająca ciecz jest skierowana na powierzchnię analizowaną, na którą napyla się jedynie odpowiednio dobrany roztwór
• zadaniem roztworu jest wyrwanie z badanej powierzchni cząsteczek, a następnie ich jonizacja, analogicznie jak w technice ESI
• odpowiednio przesuwając badany materiał można uzyskać dwuwymiarowy obraz rozkładu ilości substancji na jego powierzchni
• może działać pod ciśnieniem atmosferycznym i w bardzo ograniczonym stopniu uszkadza badany materiał

Question 94

Chromatografia cieczowa połączona ze spektrometrią mas (LC-MS)

Answer 94

• technika rozdziału złożonych próbek
• polega na rozdzieleniu składników próbki na złożu (fazie stacjonarnej, ang. stationary phase) z udziałem ciekłego medium (eluenta)
• złoże należy dobrać tak, aby składniki próbki oddziaływały z nim z różnym powinowactwem
• wymycie składników ze złoża odbywa się z udziałem fazy ruchomej w ten sposób, że składniki słabo oddziałujące z fazą stacjonarną eluowane są szybciej niż składniki oddziałujące mocniej

Question 95

RODZAJE POŁĄCZEŃ LC-ESI-MS

Połączenie typu on-line

Answer 95

• to bezpośrednie połączenie spektrometru masowego z wylotem kolumny chromatograficznej
• wprowadzenie kapilary z wylotu kolumny chromatograficznej i wprowadzenie jej do źródła jonów spektrometru masowego
• główne źródło jonów – electrospray, ze względu na możliwość bezpośredniej analizy roztworów i jonizacji pod ciśnieniem atmosferycznym

Połączenie typu on-line z podzielnikiem przepływu (trójnikiem, ang. splitter)
• Stosowane w przypadku gdy przepływ fazy ruchomej w kolumnie chromatograficznej jest zbyt szybki
• Podzielnik przepływu
o w postaci prostego trójnika lub urządzenia ze śrubą mikrometryczną, precyzyjnie regulujący przepływ
o pozwala na wzajemne dopasowanie przepływów
o montowany u wylotu kolumny chromatografii cieczowej
o rozdziela eluant na dwa strumienie

Question 96

RODZAJE POŁĄCZEŃ LC-ESI-MS

Połączenie typu off-line

Answer 96

• chromatograf cieczowy nie jest połączony ze spektrometrem mas
• składniki opuszczające kolumnę chromatograficzną są frakcjowane, a z każdej zebranej frakcji pobiera się niewielką objętość i wprowadza do źródła jonów
• brak ograniczeń związanych z rodzajem kolumny chromatograficznej, rodzajem lub prędkością przepływu, typem źródła jonów
• frakcje uzyskane w drodze rozdziału można łatwo przystosować do analizy MS
• każdą frakcję można odparować, dializować, odsalać, derywatyzować lub prowadzić inne zabiegi niezbędne do przeprowadzenia analizy
• można wykorzystać każde źródło jonów – ich dobór zależy od spodziewanych składników próbki

Question 97

LC-MALDI-MS

Answer 97

• zastosowanie MALDI daje wyższą czułość niż w przypadku ESI
• Typowe źródło jonów MALDI działa zazwyczaj pod znacznie obniżonym ciśnieniem – główna przeszkoda w połączeniach LC-MALDI-MS typu on-line
• Próbkę nakłada się na płytkę, miesza z matrycą (drobnocząsteczkowy, słaby kwas organiczny), a otrzymaną mieszaninę poddaje krystalizacji
• Po zakończeniu procesu próbki wprowadza się do źródła jonów i poddaje jonizacji pod wpływem promieniowania laserowego
• Połączenie LC-MALDI-MS typu off-line ze względów praktycznych wymaga odpowiedniej, zautomatyzowanej aparatury zbierającej i frakcjonującej eluat, mieszającej go z matrycą i nakładającej na płytkę

Question 98

LC-AP-MALDI

Answer 98

• Umożliwia bezpośrednią jonizację próbek pod ciśnieniem atmosferycznym
• Proces jonizacji zachodzi poza układem niskiego ciśnienia
• Próbka jest naświetlana promieniem lasera w obszarze o ciśnieniu atmosferycznym
• Powstające jony są kierowane do wnętrza spektrometru przez układ elektrod

Question 99

Technika wysokosprawnej chromatografii cieczowej (HPLC)

Answer 99

• Podstawą techniki HPLC jest zastosowanie złoża w postaci ziaren (faza stała)
• Im mniejsza średnia ziaren (granulacja złoża) tym większa powierzchnia oddziaływania ze składnikami mieszaniny i tym więcej półek teoretycznych znajduje się w jednostce długości kolumny
• Zmniejszanie średnicy ziaren wypełnienia kolumny powoduje wzrost ciśnienia hydrostatycznego niezbędnego do przepchnięcia eluenta wraz z próbką przez kolumnę chromatograficzną

Question 100

Technika ultrawysokosprawnej chromatografii cieczowej (UPLC)

Answer 100

• Umożliwia zmniejszenie granulacji fazy stacjonarnej, a co za tym idzie wykorzystanie wysokociśnieniowych pomp chromatograficznych
• Podgrzanie kolumny UPLC zmniejsza opory przepływu – na skutek zmniejszenia lepkości roztworu

Question 101

Metoda laserowej desorpcji / jonizacji wspomaganej matrycą (MALDI)

Answer 101

• szeroki zakres zastosowania – analiza peptydów i całych białek, kontrola jakościowa wielu typów próbek, identyfikacja białek za pomocą metody odcisku palca, analiza modyfikacji potranslacyjnych, obrazowanie tkanek, wykrywanie biomarkerów
• próbkę przed pomiarem miesza się z drobnocząsteczkową matrycą
• przebieg jonizacji
o po uruchomieniu lasera, wiązka promieniowania trafia w miejsce nałożenie mieszaniny matrycy oraz próbki – kryształów tej mieszaniny
o matryca absorbuje promieniowanie lasera, ulegając jonizacji i jonizując jednocześnie cząsteczki próbki
o pojawiające się oddziaływania kolumbowskie między jonami są tak silne, że wywołują desorpcję cząstek z powierzchni płytki
o w wyniku zderzeń cząstek próbki z fotowzbudzoną matrycą, w chmurze zdesorbowanych cząstek postępuje dalsza jonizacja jej cząsteczek
o po określonym czasie (nanosekundy po uderzeniu lasera) w źródle jonów zostaje włączony potencjał przyspieszający, który kieruje zdesorbowane jony do analizatora
• w zależności od zastosowanej matrycy, mocy wiązki oraz rodzaju cząstek mieszaniny, przed rozpoczęciem procesu jonizacji może zajść również proces fragmentacji cząsteczek – fragmentacja w źródle jonów (ISD)
• MALDI to łagodna metoda jonizacji

Question 102

Najczęściej stosowane metody nanoszenia matryc na płytki MALDI

Answer 102

1. Wysychającej kropli Krople roztworu matrycy oraz roztworu próbki miesza się ze sobą przed nałożeniem na płytkę.
2. Odparowywania pod próżnią
   Wariant metody wysychającej kropli.
   Po nałożeniu kropli na płytkę rozpuszczalnik jest natychmiast odparowywany pod próżnią. Metoda wymaga zatem dodatkowego wyposażenia.
3. Cienkiej warstwy W metodzie nakłada się osobno matrycę i próbkę. Matryca nakłada się w szybko odparowującym rozpuszczalniku jak aceton a na powstałej homogennej warstwie matrycy nanosi się roztwór z próbką

Question 103

ZASTOSOWANIE MALDI

Answer 103

MALDI w analizie i identyfikacji białek
• MALDI jest łagodną metodą jonizacji, przez co idealnie nadaje się do analizy białek, nie powodując ich nadmiernej fragmentacji
• Nawet dla białek o stosunkowo dużych masach można uzyskać widmo masowe z widocznym jonem pseudomolekularnym
• Często daje się zjonizować białka oraz peptydy z zachowaniem modyfikacji potranslacyjnych

MALDI a fragmentacja
• Spontaniczna fragmentacja staje się problemem w przypadku złożonych widm na których występuje kilka składników. Z tego powodu matryce MALDI dzieli się na
o gorące – w których energia wewnętrzna jonów powstałych w wyniku jonizacji jest większa, niż w sytuacji gdy za proces jonizacji odpowiadają matryce zimne
o zimne – w których fragmentacja jest niewielka i cząsteczki docierają do analizatora w niezmienionej postaci
• proces fragmentacji może zajść w źródle jonów lub kiedy jon znajdzie się w analizatorze

MALDI a sekwencjonowanie białek
• ze względu na obecność na widmie praktycznie wyłącznie jonów jednokrotnie zjonizowanych, MALDI jest szczególnie dobrą metodą jonizacji do analizy de novo
• metoda ta polega na ustaleniu sekwencji nieznanych peptydów i białek
• zastosowanie MALDI sprawia, że przy nawet stosunkowo niskiej rozdzielczości analizatora można dokładnie określić jony fragmentacyjne, a przez to wyznaczyć sekwencję analizowanego białka lub peptydu ze znacznie większą pewnością niż w metodach jonizacji wielokrotnej np. ESI

Question 104

Analizator czasu przelotu

Answer 104

• ze względu na impulsowy charakter źródła jonów typu MALDI oraz pracę w warunkach wysokiej próżni, najczęściej zestawia się go z analizatorem przelotu – TOF
• analizator czasu przelotu to pusta w środku tuba ze źródłem jonów z jednej strony oraz detektorem z drugiej
• wszystkie jony o tej samej krotności jonizacji które ulegają przyspieszeniu w polu elektrycznym, mają taką samą energię kinetyczną – w takiej sytuacji prędkość jonu jest odwrotnie proporcjonalna do jego masy
• jony o małej masie poruszają się szybko, podczas gdy jony cięższe są znacznie powolniejsze – mierząc czas przelotu można określić ich m/z
• jony mogą mieć nadmiar energii która prowadzi do ich fragmentacji
• spektrometry MALDI z analizatorem czasu przelotu często są wyposażone w dodatkową opcję – reflektor
o to układ dodatkowych elektrod, których zadaniem jest zawrócenie jonów przeciwnie do kierunku ich lotu, co umożliwia zazwyczaj zwiększenie rozdzielczości pomiaru
• analizatory TOF/TOF
o zawierają dwa analizatory TOF
o wykorzystują pierwszy analizator TOF (działanie liniowe) do izolacji jonów macierzystych, a drugi do rozdzielania jonów fragmentacyjnych
o jony powstałe w wyniku fragmentacji w komorze kolizyjnej są wpychane do drugiego analizatora za pomocą następnej elektrody przyspieszającej (drugie źródło), dzięki czemu ich energia kinetyczna jest zbliżona, a rozdzielczość pomiaru zwiększa się