Mechanizmy bakteryjnej patogenezy Flashcards
1
Q
Patogeny emerging
A
nowe czynniki etiologiczne, wyizolowane po 1976 roku o Legionella pneumophila o Campylobacter jejuni o Bartonella hensalae o Helicobacter pyroli o Borrelia burgdorferi
2
Q
• Patogeny reemerging
A
– patogeny pojawiające się na nowo, szczepy zyskujące nowe geny zwiększające ich wirulencje
o Mycobacterium tuberculosis
o Staphylococcus aureus
o Escherichia coli EHEC - enterokrwotoczna
3
Q
patogen New-new
A
Wyizolowane po raz pierwszy w historii ludzkości
Legionella
Borrelia
4
Q
patogen new-old
A
Znane od dawna i wywołujące choroby wcześniej, ale dopiero od niedawna istnieją metody diagnostyczne do ich identyfikacji
Campylobacter
Bartonella
Helicobacter pyroli
5
Q
patogen old-new
A
Patogeny znane od dawna, ale powracające w nowej postaci
Mycobacterium
Vibrio cholerae
6
Q
patogen old-old
A
Dawne patogeny stanowiące obecnie istotny czynnik etiologiczny Chlamydia trachomatis
Neisseria gonorhoeae
7
Q
Patogeny oportunistyczne
A
- Powodują choroby u pacjentów z osłabionym układem odpornościowym lub w nowym miejscu ze sprzyjającymi warunkami wzrostu, gdzie wcześniej nie występowały
- Naturalna flora fizjologiczna człowieka
- Drobnoustroje powszechnie występujące w środowisku naturalnym – np. bakterie glebowe produkujące antybiotyki
8
Q
Współczesne zagrożenia związane z patogenami
A
• Zakażenia związane z żywnością i wodą
o Zakażenia związane z osłabieniem układu odpornościowego
Transplantologia
Chemioterapia w leczeniu raka
AIDS (limfocyty T helperowe)
o Zakażenia związane z pokonaniem barier ochronnych przez bakterie
Zabiegi chirurgiczne
Aparatura podtrzymująca życie, np. rurki intubacyjne
o Patogeny oportunistyczne
o Zakażenia wynikające z wydłużonego życia ludzi
• Zakażenia pooperacyjne
• Bioterroryzm
9
Q
Mikroflora ludzkiego organizmu
A
• Bakterie wyraźnie zaznaczają swoją obecność
• Szereg korzyści ze współistnienia
o Udział w trawieniu – produkcja enzymów
o Produkcja witamin (K, z grupy B)
o Wykorzystywanie związków odżywczych
o Blokowanie miejsc do adhezji
o Decydująca rola w rozwoju wyściółki jelit
o Rozwój i dojrzewanie układu immunologicznego
o Rola probiotyków i prebiotyków
• Organizm człowieka to złożony ekosystem w którym znajduje się bogata i niezwykle zróżnicowana flora bakteryjna
• Człowiek w życiu płodowym jest pozbawiony drobnoustrojów
• Kolonizacja rozpoczyna się podczas porodu – mikroflora pionierska
• Dominującą florą człowieka są bakterie gram-dodatnie
• W przypadku chorób typu shift następuje przesunięcie tej równowagi na korzyść drobnoustrojów gram-ujemnych
10
Q
Jakie drobnoustroje są obecne (skład gatunkowy)?
A
sekwencjonowanie genów 16S rRNA i poszukiwanie pokrewieństw w bazach danych
11
Q
Jakie jest pokrewieństwo pomiędzy różnymi izolatami tego samego gatunku?
A
porównanie genomów poprzez profile map restrykcyjnych lub profile otrzymane metodą PCR
12
Q
aki jest potencjał fizjologiczny populacji bakteryjnej?
A
izolacja DNA z mieszaniny populacji bakteryjnych trawienie, klonowanie, sekwencjonowanie poszukiwanie genów w bazach danych
13
Q
Miazmatyczna teoria chorób
A
- Przyczyny chorób epidemicznych są w szkodliwym i zanieczyszczonym powietrzu, brudzie i odrażających zapach
- Zakażenia były wywoływane przez miazmaty, czyli wyziewy gnilnego powietrza pochodzące z wnętrzności ziemi i wdzierające się do ciała (tzw. morowe powietrze)
14
Q
Klasyczne postulaty Kocha
A
I Drobnoustrój musi być izolowany od wszystkich chorych osobników wykazujących identyczne objawy chorobowe
II powinien być otrzymywany w czystej hodowli in vitro
III Po celowym zakażeniu gospodarza powinien wywołać objawy chorobowe identyczne z poprzednio obserwowanymi
IV Od intencjonalnie zakażonego gospodarza powinien być wyizolowany ten sam drobnoustrój
15
Q
Izolacja patogenu in vitro w czystej kulturze
A
• Bakterie różnią się pod względem wymagań metabolicznych
• Brak jest uniwersalnego medium do hodowli wszystkich drobnoustrojów
• Ogromny wpływ mają też warunki hodowli
• Nie wszystkie bakterie mogą być hodowane na podłożach (Chlamydophila pneumoniae – hodowle tkankowe)
• Bakterie, które nie zostały wyhodowane w postaci czystych kolonii
o Treponema pallidium (jądra królika)
o Mycobacterium leprae
• Zastosowanie metod molekularnych w celu identyfikacji czynnika etiologicznego choroby
16
Q
Nowoczesne metody Umożliwiające potwierdzenie postulatów Kocha
A
o identyfikacja drobnoustrojów z tkanek gospodarza z zastosowaniem metody PCR
odnalezienie charakterystycznego genu i starterów
o identyfikacja drobnoustrojów z tkanek gospodarza z zastosowaniem metod immunohistochemicznych
znakowanie przeciwciałami określonych struktur
• doprowadziło to do:
o zastosowania antybiotyków w leczeniu chorób
o profilaktyka szczepienna
o higiena, dezynfekcja, zdrowa praktyka
17
Q
5 postulat Kocha
A
powstały po nowoczesnych metodach potwierdzających postulaty
• eliminacja drobnoustroju lub ochrona przed ekspozycją na jego działanie powinny eliminować chorobę lub jej zapobiegać
• szczepienia ochronne również jako metoda potwierdzająca związek patogenu z chorobą (wirus HPV –> związek z rakiem szyjki macicy)
18
Q
Choroby typu „SHIFT”
A
- brak określonego gatunku odpowiedzialnego za chorobę
- w wyniku zmian środowiskowych powoduje zwiększenie niektórych liczebności populacji bakterii, co prowadzi do powstania choroby
- parodontoza
- waginozy
19
Q
Molekularne postulaty Kocha
A
• Dotyczą cechy genu, którego produkt zaklasyfikowano jako czynnik wirulencji:
o 1) odnajdywany jedynie w szczepach chorobotwórczych
o 2) powinien ulegać ekspresji na pewnym etapie infekcji, a kodowany przez niego produkt powinien indukować pewien typ odpowiedzi immunologicznej
o 3) unieczynnienie genu kodującego czynnik wirulencji powinno prowadzić do obniżenia poziomu wirulencji
o 4) wprowadzenie genu (również operonu, wysp patogenności) do szczepu niewirulentnego może przekształcić go w szczep chorobotwórczy
o 5) możliwość klonowania genu – do badań
20
Q
Infekcja
A
• proces wniknięcia drobnoustroju do organizmu gospodarza, połączony z jego namnażaniem i kolonizacją
o infekcja nie jest równoznaczna z wystąpieniem objawów chorobowych
o może dojść do eradykacji mikroorganizmu – układ immunologiczny poradzi sobie z mikroorganizmem
o działalność układu immunologicznego eliminuje patogen ale nie objawy chorobowe (choroby autoimmunizacyjne)
• infekcje chroniczne (przewlekłe) - poziom indukowanej odpowiedzi immunologicznej jest zbyt niski do eliminacji patogenu
o zbyt niska odpowiedź immunologiczna powoduje wytworzenie równowagi z patogenem
o Helicobacter pylori –wrzody żołądka, objaw: bóle żołądka -> nowotwór żołądka
21
Q
• choroba to
A
kliniczna manifestacja uszkodzeń tkanek gospodarza, zainicjowana oddziaływaniem pomiędzy nim a drobnoustrojem
22
Q
• mikroorganizm patogenny to
A
mikroorganizm zdolny do wywołania uszkodzeń organizmu gospodarza
23
Q
• kolonizacja to
A
zdolność mikroorganizmu do namnażania się w konkretnej niszy ekologicznej (nie jest równoznaczna z chorobą ani z infekcją)
o Dotyczy głównie środowiska życia mikroorganizmu
24
Q
Czynniki wpływające na ewolucję patogenów
A
• Dostosowanie do warunków środowiska o Ofensywne Toksyny Inwazyny o Defensywne Maskowanie antygenów Proteazy IgA Koagulacja o Nie specyficzne siderofory • Walka o nisze – w jakiś sposób trzeba eliminować inne organizmy, konkurencji (np. antybiotyki, obniżenie pH przez produkcję metabolitów wtórnych) • Dostępność czynników odżywczych • Zmiany struktury populacji żywicieli o doprowadzają do powstania chorób, które wcześniej nie występowały • Koewolucja patogenów i żywicieli o Im dłuższe oddziaływanie między patogenem i żywicielem, tym te odziaływanie jest delikatniejsze i subtelniejsze, przez co nie prowadzą od razu do śmierci żywiciela
25
• Plastyczność genomów (genom stale dostosowuje się do środowiska) bakteryjnych zależy od
o Rearanżacji DNA - insercje, delecje, inwersje wewnątrz genomu bakteryjnego
o Nagromadzenia mutacji punktowych – przy każdym powielaniu materiału genetycznego polimerazy „mylą się” prowadząc do powstania mutacji w tym również mutacji korzystnych
o Horyzontalnego transferu genów (HGT) - główna siła napędowa ewolucji bakteryjnej
26
• Usuwanie z komórki informacji genetycznej
o Pseudogenizacja – powstają pseudogeny, czyli obszary zawierające niekodujące geny
o Redukcja genomu – usuwanie fragmentu genomu
o Działają tak patogeny wewnątrzkomórkowe
Np. wyewoluowanie Shigella spp., z Escherichia coli, która pozbyła się bardzo dużego fragmentu genomu
27
Mobilne elementy sprzyjające horyzontalnemu transferu genów
* Bakteriofagi integrowane do chromosomu
* Transpozony
* Plazmidy – przenoszone pomiędzy bakteriami
28
Mechanizmy warunkujące plastyczność genomów bakteryjnych
1. Mutacje punktowe - Zmiany ekspresji genów
2. Rekombinacja homologiczna - Rearanżacje DNA, inwersje, duplikacje, delecje, integracja DNA nabytego na drodze HGT
3. Transformacja - Zyskiwanie nowej informacji genetycznej
4. Sekwencje insercyjne -
Insercje, delecje, inwersje DNA, zmiany ekspresji genów
5. Transpozony - koniugacyjne Koniugacja
6. Plazmidy -
Mobilizacja innych plazmidów, HGT
7. Bakteriofagi - Transdukcja, HGT
8. Wyspy patogeniczności (PAIs) - HGT, integracja lub utrata dużych fragmentów DNA
9.Mutacje punktowe -
Zmiany ekspresji genów, utrata funkcji
10. Rekombinacja homologiczna -
Rearanżacje DNA, delecja DNA, integracja DNA nabytego na drodze HGT
11. Transpozycja - Zmiany ekspresji genów, utrata funkcji
29
• Cykle w których funkcjonują bakteriofagi
o Cykl lityczny – bakteriofag namnaża się w bakterii, a następnie ją niszczy
o Cykl lizogenny – bakteriofag wbudowuje się w materiał genetyczny komórki, jest powielany wraz z rozwojem komórki, komórki potomne gospodarza posiadają również tego bakteriofaga
Cały wirus wnika do komórek zwierzęcych, w przypadku komórek roślinnych niekoniecznie
30
Transdukcja uogólniona (ogólna)
• Każdy z licznych genów faga litycznego może być przeniesiony z jednej komórki bakterii do drugiej
• Podczas łączenia się części składowych faga, do główki pakowany jest DNA chromosomowy lub plazmidowy bakterii zamiast DNA fagowego
• W komórce biorcy (transduktanta) transdukowany DNA może:
o Być degradowany przez restrykcyjne endonukleazy
o Rekombinować z chromosomem (lub plazmidem), czego wynikiem jest stabilne dziedziczenie niektórych cech dawcy (transdukcja pełna)
o Trwać jako ustabilizowana, ale niereplikująca się cząsteczka (transdukcja poronna)
31
Transdukcja wyspecjalizowana (ograniczona)
* Udział biorą jedynie fagi lizogenne w których zachodzi faza integracji z chromosomem gospodarza
* Podczas wycięcia profag może zabrać część otaczającego chromosomu
* Fag transdukcji ograniczonej (wyspecjalizowana cząstka transdukcyjna, STP, ang. Specialized transducing particle) może utracić zdolność do replikacji
* Jednak zachowuje zdolność do wstrzyknięcia DNA do komórki biorcy – wycięty fragment zostanie wprowadzony do komórki biorcy, a co za tym idzie zwielokrotnienie lub zyskanie nowych funkcji przez komórki biorcy
32
Genom bakteryjny składa się z
```
• Sekwencje rdzeniowe
o o homogennej zawartości par G+C
o Niewielka podatność na mutacje
o Kodowanie czynników kluczowych dla komórki bakteryjnej
o Geny typu house keeping
• Wyspy genomowe (GEI, genomic Island)
o Odcinki DNA różniące się od reszty chromosomu niosące pulę unikalnych informacji genetycznych, zakodowanych w zwartych blokach DNA
o Kodujące cechy fenotypowe
```
33
Wyspy genomowe
• W zależności od funkcji (cech kodujących w obrębie wysp genomowych) wyspy genomowe dzieli się na:
o Wyspy symbiotyczne (jak tworzyć symbiozę) – elementy metabolizmu, które są odpowiedzialne za cechy pozwalające na życie w symbiozie
o Wyspy metaboliczne – kodowane cechy metabolizmu
o Wyspy opornościowe – kodowane cechy związane z mechanizmami oporności
o Wyspy patogenności (PAI, pathogenicity Island)
Zgrupowane w geny kodujące białka biorące udział w patogenezie (uzyskiwane najczęściej na drodze HGT)
Integracja z chromosomem, upodabnianie się do genomu gospodarza,
Im dłuższa integracja z chromosomem tym wyspy patogenności tracą swoją mobilność – utrata sekwencji insercyjnych po bokach wyspy patogenności (odpowiedzialne za integrację z genomem gospodarza)
Kodują wiele czynników wirulencji
• Wyspy młode na końcach posiadają sekwencje insercyjne, które umożliwiają im poruszanie się, wyspy stare tracą te sekwencje co skutkuje utratą mobilności
34
Cechy charakterystyczne wysp patogenności
• Duże jednostki genetyczne na chromosomie bakteryjnym
• Noszą jeden lub więcej genów wirulencji
• Obecne w szczepach patogennych, brak w szczepach niepatogennych
• Często są genetycznie niestabilne
• Obecność elementów genetycznych zaangażowanych w mobilność DNA
o Sekwencje powtórzone, integrazy, transpozazy, geny bakteriofagowe
• Skład sekwencji nukleotydowej ich DNA zwykle różni się od średniej dla całego chromosomu
• Miejsce insercji wysp patogenności często znajduje się w sąsiedztwie genów kodujących t-RNA
o Regiony t-RNA są regionami konserwatywnymi i niezmiennymi, które łatwo rozpoznać
35
Wirulencja (zjadliwość)
produkcja określonych czynników wirulencji oraz procesy prowadzące do szkodliwości organizmu wyższego
36
Wirotyp to
w obrębie danego gatunku, to takie grupy drobnoustrojów posiadające dane czynniki wirulencji – różne wyspy patogenności
37
Serotyp to
odmiana w obrębie gatunku drobnoustroju (bakterii, wirusa) wyłoniona za pomocą metod serologicznych, wykazujących różnice w budowie antygenowej
38
Szczep to
populacja drobnoustrojów w obrębie gatunku lub odmiany, wyróżniająca się określonymi cechami
39
Izolat to
kultura patogena uzyskana z określonego miejsca, w określonym czasie i prowadzona lub przechowywana w laboratorium w celach doświadczalnych
40
Rybotyp to
odmiana w obrębie gatunku wyłoniona za pomocą rybotypowania, wykorzystującego informacje z analiz filogenetycznych opartych na rRNA
41
Genotyp to
zespół genów danego osobnika warunkujących jego właściwości dziedziczne
42
poza genami wysp patogenności, za indukcję objawów chorobowych odpowiedzialne są również
o Geny plazmidowe
o Geny w obrębie wysepek patogenności (pathogenicity islet)
o Pojedyncze geny chromosomowe tzw. wysepki jednogenowe (singlet od single gene islet), które stanowią niezależne jednostki transkrypcyjne lub geny profagowe
43
Ewolucja przez redukcję
Ewolucja genomów bakteryjnych poprzez utratę fragmentów chromosomu lub inaktywację niektórych genów
• Proces adaptacji do nowego środowiska lub selekcja korzystnej cechy
• Mechanizmy odpowiedzialne za powstawanie pseudogenów (rozprzestrzenianie sekwencji IS)
44
Pangenomy bakteryjne
• Pangenom to cała pula genów danego gatunku
• Pangenom otwarty jest złożony z dwóch rodzajów genów
o Core genes (geny rdzeniowe) są to geny obecne we wszystkich szczepach danego gatunku (E. coli, S. pneumoniae)
o Dispensable genes- geny, które nie są niezbędne dla przeżycia danego gatunku i nie występują we wszystkich szczepach
• Pangenom zamknięty- charakteryzuje gatunki bakterii cechujące się dużą konserwatywnością genomów poszczególnych szczepów (B. anthracis, M. tuberculosis, Chlamydophila tracheomatis
45
Cechy zwierzęcego modelu – aby można było na nim dobrze badać cechy wirulencji
* wrażliwość na działanie patogenu
* symptomy choroby u zwierzęcia modelowego powinny odzwierciedlać, te występujące u pierwotnego gospodarza (człowieka)
* powinna istnieć możliwość pomiaru wirulencji – trzeba sprawdzać czy zwierzę choruje, czy pojawiają się symptomy wskazujące na chorobę które można zbadać
```
np.
• Helicobacter pyroli – fretki
• gruźlica – świnki morskie
• Haemophilus influenzae – szynszyle
• trąd – pancernik
```
46
Trzy zasady etyczne w badaniach na ludziach
• szacunek wobec obiektu badań
o informowanie o wszelkich podejmowanych działaniach, tak aby dana osoba wiedziała o efektach ubocznych i pożądanych
• badania wnoszą dużo do posiadanej wiedzy
o maksymalny zysk, minimalne szkody dla obiektu badanego
• sprawiedliwość
o rzetelne – losowo wybierana grupa placebo i grupa leczona
47
Typy badań klinicznych
• badania prospektywne
o zakażenie/leczenie pacjenta następuje w czasie rzeczywistym
o mamy pacjenta który jest już zakażony i badamy to jak rozwija się infekcja, lub jak oddziałuje na zastosowane leczenie
• badania retrospektywne
o badania nad chorobami, które pojawiły się w przeszłości przypadkowo lub w sposób naturalny w celu uzyskania informacji na temat transmisji i postępów choroby u ludzi
o informacje z opisów kronikarzy, lekarzy, kart medycznych itp.
48
Idealny model zwierzęcy do badań
* rozwój choroby o identycznych symptomach
* ta sama droga zakażenia
* tanie modele zwierzęce
* łatwe do hodowli
* łatwość modyfikacji genetycznych – w łatwy sposób można wprowadzać lub usuwać dane geny
* modyfikacje badań w zależności od cech organizmu modelowego
49
zwierzęta gnotobiotyczne „GERM-FREE”
o wzrost w sterylnym środowisku - hodowla
o mają specyficzny układ immunologiczny – nie posiadają naturalnej mikroflory
o poród przez cesarskie cięcie – brak nadkażenia przez drobnoustroje z dróg rodnych matki
o bardzo drogie
o badania nad rozwojem odpowiedzi immunologicznej
o problem z komensalizmem – nie są w stanie przyswajać pokarmu
50
• zwierzęta pozbawione specyficznych patogenów
o środowisko pozbawione specyficznych patogenów
| o eliminacja odporności względem specyficznych patogenów
51
Krzywa przeżywalności
• określa medianę czasu przeżywalności zwierząt po infekcji szczepem dzikim oraz mutantami o określonych cechach wirulencji
• wyniki są istotne statystycznie przy relatywnie małej liczbie zwierząt testowych – nawet poniżej 10 zwięrząt
• metoda ta może być łączona z obrazowaniem biofotonicznym
o szczepy bakteryjne używane do infekcji są modyfikowane operonem lucyferazy (luxABCDE) wprowadzonym do chromosomu
52
Obrazowanie biofotoniczne
* bakterie świecą w ciemności
* na bieżąco sprawdza się postęp infekcji – w czasie rzeczywistym
* myszy są usypiane i prześwietlane bardzo czułą kamerą
* specjalne programy oszacowują ilość światła emitowanego przez bakterie
53
• Dawka letalna (LD50) to
dawka powodująca śmierć (terminalną ostrą fazę infekcji) 50% badanych zwierząt
54
• Dawka infekcyjna (ID50) to
dawka powodująca zakażenie 50% badanych zwierząt
o określa zdolność patogenu do kolonizacji organizmu gospodarza, ustalenia fazy infekcji i wywołania objawów chorobowych
o cfu w organach lub krwi, obrazowanie biofotoniczne, pocenie się, utrata motoryki
55
Test kompetytywności - Competition assay
• pozwala określić indeks CI (competitive index)
• zwierzę jest infekowane mieszaniną szczepu zmutowanego i dzikiego
• CI to stosunek szczepu zmutowanego do dzikiego
• jeżeli CI=1 to mutacja nie ma wpływu na wirulencję badanego szczepu
• jeżeli CI˂1 to mutacja ma negatywny wpływ na poziom wirulencji szczepu
o szczepu dzikiego jest znacznie więcej niż mutantu
• jeżeli CI˃1 to mutacja zwiększyła poziom wirulencji szczepu
o mutanta jest znacznie więcej niż szczepu dzikiego
• mutant musi współzawodniczyć o nisze ze szczepem dzikim
• wady:
o słabo rosnące szczepy
o różnice są trudne do interpretacji
o wykluczenie biofotoniki – określanie stosunek jednej bakterii do drugiej, a nie sposób rozpowszechniania jej
56
Hodowle tkankowe w analizie procesów wirulencji
* analog organizmu gospodarza – korzystna cecha, badamy konkretny organizm, który chcemy
* uzyskano wiele istotnych informacji dotyczących oddziaływania patogenów z komórkami eukariotycznymi
zalety:
• nie ma konieczności przeprowadzania testów na zwierzętach (aspekt etyczny)
• łatwość prowadzenia badań
• można prowadzić badania w warunkach ściśle zdefiniowanych
• łatwość badania np.: różnych etapów patogenezy bakteryjnej
• duża powtarzalność wyników – ale w przypadku gdy robi to jedna osoba (ten sam rodzaj pipetowania, popełniania błędów itp.)
• aspekty finansowe
wady:
• pochodne komórek nowotworowych mogą podlegać mutacjom – możliwe ciągłe zmiany cech
• uproszczony układ
• ekspresja genów w innym środowisku – trzeba dokładnie odwzorować medium w którym rosną komórki
• trudność w korelacji wyników
• problemy z wyborem linii komórkowej
57
Test gentamycynowy
* hodowle tkankowe są bardzo często używane w celu identyfikacji czynników wirulencji zaangażowanych w adhezję i wnikanie do organizmu gospodarza przez patogeny wewnątrzkomórkowe
* test gentamycynowy (gentamicin protection assay) pozwala wykryć różnice pomiędzy szczepami dzikimi a mutantami defektywnymi w procesie adhezji lub wnikania
* gentamycyna – antybiotyk, nie przenika przez błony komórkowe
• W przypadku bakterii opornych na gentamycynę stosuje się inny antybiotyk lub bardzo duże stężenie gentamycyny
58
Operony/regulony bakteryjne
* gdy występuje tylko jeden gen odpowiedzialny za cechę wirulencji (bardzo rzadkie zjawisko) – gen ten znajduje się pod regulacją określonych komórkowych regulatorów, które są sterowane przez określone białka regulatorowe, bądź enzymy
* gdy występuje operon (zbiór wspólnie transkrybowanych i regulowanych genów, położonych obok siebie w genomie; bardzo częste zjawisko) – operon jest regulowany przez sekwencje promotora (miejsce wiązania polimerazy RNA, katalizującej transkrypcję) oraz operatora (krótka sekwencja nukleotydów, znajdująca się tuż przed pierwszym genem struktury)
* gdy występuje regulon (najczęściej; zestaw operonów lub genów) - regulowane przez wspólny czynnik transkrypcyjny
59
Geny reporterowe w analizie procesów wirulencji
• gen reporterowy służy badaniu innego genu np. badanie aktywności promotora przez poziom ekspresji genu kodującego β-galaktozydazę (lacZ u E. coli)
• mogą być też użyte do rozróżniania kolonii
• gen reporterowy jest łączony z sekwencją która ma być badana (potencjalne miejsca promotorowe, otwarte ramki odczytu)
o wzmacnianie lub inhibicja sekwencji badanej
• koduje białko, które może być wykryte bezpośrednio (np. emisja światła), lub jego aktywność jest rozpoznawana w wyniku reakcji enzymatycznej prowadzącej do powstania łatwo wykrywalnego produktu ( np. zmiana koloru)
60
Białko GFP w badaniu patogenów
• wykazano, że ulega ekspresji i produkuje białko zielonej fluorescencji, teraz niekoniecznie zielonej – w zależności od długości białka można uzyskać barwę od zielonej poprzez żółtą do czerwonej
• jest najczęściej stosowanym genem reporterowym ze względu na bogatą paletę barw, stabilność i znikomą toksyczność
badanie poziomu aktywności promotorów in vivo – przyłączenie białka do promotora i sprawdzenie, czy zwiększyła się czy też nie intensywność produkcji białka
• monitorowanie losów bakterii patogennych na modelach zwierzęcych
• badanie w jakich przedziałach komórkowych komórek eukariotycznych znajduje się patogen
• badanie losów poszczególnych białek patogenu w komórkach eukariotycznych
• analiza czasu ekspresji genów wirulencji – czy od samego początku infekcji?
• analiza sekwencyjnej ekspresji genów wirulencji – w jakiej kolejności następuje ekspresja
61
Metody w określaniu wirulencji patogenów
1. Mutageneza transpozonowa
2. Fuzje transkrypcyjne
3. Identyfikacja genów bakterii patogennych ulegających ekspresji in vivo
4. STM (Signature-tagged mutagenesis)
5. IVET (In vivo expresion technology)
6. RIVET (Recombinase- based IVET)
7. DFI (Differential fluorescence induction)
62
Mutageneza transpozonowa
• Mutageneza to zarówno spontaniczny jak i wywołany przez mutageny proces powstawania zmian – mutacji w DNA
• elementy transpozycyjne (TE, ang. transposable elements) należą do grupy ruchomych elementów genetycznych
1. są zdolne do zmiany miejsca w genomie w wyniku transpozycji (typ rekombinacji nieuprawnionej, która nie wymaga homologii sekwencji nukleotydowych cząsteczek DNA uczestniczących w procesie i zależy od transpozazy kodowanej przez TE) – proces losowy
2. transpozony niosą geny warunkujące cechy fenotypowe
• mutageneza transpozonowa
1. losowa insercja transpozonów do genomu bakterii i poszukiwanie mutantów, które utraciły wirulencję
2. transpozony zawierają markery:
geny repoterowe LacZ
geny oporności na antybiotyki
geny lux kodujące lucyferazę
3. otrzymuje się dużą pulę mutantów
4. transpozon jest jednocześnie markerem uszkodzonego genu - ułatwione klonowanie
5. ograniczenia metody:
uszkodzenie sekwencje kończące transkrypcję
uszkodzenie genów warunkujących wzrost – house keeping genes
63
Fuzje transkrypcyjne
* analiza aktywności promotorów
* przy pomocy enzymów restrykcyjnych czy PCR tworzymy fuzję transkrypcyjną – łączymy gen reporterowy z fragmentem DNA potencjalnie zawierającym promotor, który chcemy badać
* gen reporterowy nie posiada promotora, ma sekwencję startu translacji i wiązania się z rybosomami
* mierząc poziom produktu genu reporterowego możemy określić siłę promotora czy jego zależność od konkretnych czynników środowiska
64
Identyfikacja genów bakterii patogennych ulegających ekspresji in vivo
* ograniczeniem metody fuzji genów czy mutagenezy transpozonowej jest zaangażowanie w badania hodowli mikroorganizmów in vitro
* najlepsze warunki pozwalające określić ekspresję genów wirulencji są wewnątrz organizmu gospodarza
* dobór odpowiedniego zwierzęcia modelowego sprawia problemy
65
STM (Signature-tagged mutagenesis)
• metoda pozwala na identyfikacje w jednym doświadczeniu genów potrzebnych do przeżycia w organizmie gospodarza
• oparta na negatywnej selekcji - identyfikuje geny wirulencji, których uszkodzenie uniemożliwia wzrost w organizmie gospodarza
• jest to mutageneza transpozonowa, w której występują różne transpozony (każdy ma swój znacznik)
• polega na analizie przeżywalności klonów in vitro i in vivo
• hybrydyzacja porównawcza (metoda cytogenetyczna polegająca na detekcji utraty lub amplifikacji regionów chromosomowych na poziomie prążka chromosomowego bez konieczności prowadzenia hodowli komórkowej. Polega ona na wyznakowaniu dwóch preparatów DNA (badanego i wzorcowego) różnymi fluorochromami i porównaniu natężenia fluorescencji w chromosomach danej pary)
o zmiana sygnału – brak mutanta lub jego zmiana
o jako sond do hybrydyzacji używa się znaczników z transpozonów – dlatego transpozony muszą mieć specyficzne fragmenty
66
IVET (In vivo expresion technology)
• metoda pozytywnej selekcji-identyfikuje promotory (oraz ich aktywność) lub operony, które są aktywne tylko podczas infekcji w organizmie gospodarza
• kluczem tej metody jest konstrukcja systemu genów reporterowych
• poszukuje się genów warunkujących przeżycie komórki w organizmie gospodarza
• metoda polega na wyłapywaniu genów aktywnych przez cały czas infekcji
• manipuluje genetyczne prowadzi się w E. coli z lacZ (genom auksotroficzny)
• natomiast gotowy konstrukt na plazmidzie wstawia się do Salmonella
• budowa plazmidu do IVET – pIVET
• X’ - fragment DNA zawierający potencjalne promotory umożliwiające ekspresję purA
• Za X’ znajduje się miejsce cięcia dla enzymu restrykcyjnego przed genem selekcyjnym
• gen selekcyjny bez promotora (promotorless genes) – zazwyczaj purA, mutanty nie urosną in vivo ale in vitro z dodatkiem puryn już tak
• Bezpromotorowy gen oporności (reporter genes) – zwierzęta karmione antybiotykami
• Drugi gen reporterowy bez promotora przed genem selekcyjnym aby odróżnić mutanty które przeżyły w organizmie
• Gen oporności z własnym promotorem aby znaleźć mutanty z wbudowanym konstruktem (antibiotic resistance gene
67
RIVET (Recombinase- based IVET)
* modyfikacja metody IVET
* gen TnpR, kodujący resolwazę – enzym umożliwiający wycięcie fragmentu między konkretnymi miejscami
* metoda czuła, która wychwytuje geny słabiej lub tylko chwilowo ulegające ekspresji
* jeśli in vivo promotor jest czynny dochodzi do transkrypcji resolwazy, która wycina gen oporności na tetracyklinę/kanamycynę (pojawia się wrażliwość)
* kiedy promotor jest nieczynny, resolwazy brak i hodowla jest oporna
68
DFI (Differential fluorescence induction)
* połączenie zastosowania genu GFP z cytometrią przepływową (FACS – fluorescent activated cell sorting)
* pozwala na identyfikowanie genów bakterii patogennych, które ulegają ekspresji w danym środowisku (zarówno in vivo i in vitro)
* badanie np. poziomu ekspresji w komórkach makrofagów
* pierwszym etapem jest przygotowanie biblioteki przy użyciu mutagenezy transpozonowej z wykorzystaniem genu gfp, oraz następnie infekcja ta biblioteką komórek makrofagów
* kolejny etap to zastosowanie cytometrii przepływowej (oddzielenie komórek w których gen reporterowy uległ ekspresji)
* w drugim etapie sortowania hodujemy bakterie in vitro (wykluczenie komórek, w których promotor jest aktywny in vitro)
* zyskujemy pule komórek posiadających promotor aktywny in vivo
* GFP- białko zielonej fluorescencji
* Bierzemy te, które nie świecą, zakażamy drugi raz makrofagi→ te które świecą ulegają ekspresji tylko in vivo.
69
Metody genomowe w identyfikacji czynników wirulencji
1. GSH (Genomic substractive hybridization)
2. SCOTS (Selective capture of transcribed sequences)
3. IVIAT (In vivo - induced antygen technology)
4. Mikromacierze (microarrays)
70
GSH (Genomic substractive hybridization)
* izolacja sekwencji genomowego DNA specyficznego dla poszczególnych szczepów blisko spokrewnionych bakterii z zastosowaniem metody PCR
* identyfikuje geny obecne tylko u patogennych lub niepatogennych szczepów
* DNA genomowe po izolacji od gospodarza jest cięte enzymami restrykcyjnymi
* końce są ligowane linkerami lub primerami adaptorowymi
* DNA szczepów niepatogennych jest znakowane biotyną
* pule fragmentów DNA są mieszane i denaturowane
* następnie hybrydyzacja fragmentów komplementarnych
* do mieszaniny dodawane jest złoże streptawidynowe (wiązanie fragmentów zawierających DNA niepatogennego szczepu)
* w przypadku fragmentów patogennego szczepu, których nie ma u szczepu niepatogennego hybrydyzacja nie nastąpi i fragmenty nie zostaną związane ze streptawidyną
* następuje kilka rund reakcji hybrydyzacji i otrzymane fragmenty będą unikalne dla szczepu patogennego
* amplifikacja w reakcji PCR, klonowanie i sekwencjonowanie
71
SCOTS (Selective capture of transcribed sequences)
* metoda oparta na RT-PCR (riverse transcriptase – badamy RNA) często łączona z GSH
* identyfikuje geny transkrybowane tylko w warunkach in vivo lub in culturo
* porównujemy dwie pule mRNA (pule mRNA powstającą w szczepach niewirulentnych z pulą mRNA pochodząca ze szczepów wirulentnych)
* mRNA przepisywane jest przy pomocy odwrotnej transkryptazy na cDNA
* amplifikacja cDNA
* jedno cDNA znakowane jest przy pomocy biotyny
* denaturacja obu puli cDNA i hybrydyzacja
* jeśli któreś z genów ulegały ekspresji in vivo, a nie ulegały in vitro to nie będą ulegały hybrydyzacji
* klonowanie do plazmidów i sekwencjonowanie
72
IVIAT (In vivo - induced antygen technology)
* metoda oparta o analizę genomu za pomocą przeciwciał bez udziału zwierząt laboratoryjnych
* w metodzie wykorzystywane są pule surowicy pobranej od pacjentów, którzy mieli kontakt z patogenem i posiadają odporność względem niego
* bakterie hodowane w warunkach in vitro łączą się z przeciwciałami, a w puli surowicy pozostają tylko te które są specyficzne dla czynników wirulencji ekspresjonowanych in vivo
* przeszukiwanie bibliotek genomowych
73
Mikromacierze (microarrays)
* mikromacierze DNA (chipy DNA) są zbiorem sond molekularnych związanych ze stałym podłożem w ściśle określonym porządku
* sondy stanowią dwuwymiarowy układ mikroskopijnych miejsc, z określonymi sekwencjami kwasu nukleinowego
* z badanego szczepu izolujemy DNA, tniemy je i oznaczamy odpowiednimi barwnikami – jeśli dojdzie do hybrydyzacji sondy z materiałem badanym to dołek zaczyna świecić
* technologia ta pozwala na wykrywanie tysięcy cząsteczek kwasów nukleinowych, dzięki możliwości przeprowadzenia wielu eksperymentów hybrydyzacji w jednym czasie
74
• czynniki wirulencji - są molekułami produkowanymi lub strategiami wykazywanymi przez patogenne bakterie w celu umożliwienia
o adhezji i kolonizacji
o przeżycia lub uniknięcia odpowiedzi układu immunologicznego
o inwazji i rozprzestrzeniania się w
o zdobycia związków odżywczych i wzrostu
o uwolnienia i rozprzestrzeniania na innych żywicieli
75
Cechy umożliwiające przeżycie patogenu w organizmie gospodarza
* zdolność do adhezji do komórek gospodarza w celu kolonizacji – adhezja to pierwszy kontakt z komórka gospodarza, dlatego jest to kluczowy proces
* uniknięcie odpowiedzi układu immunologicznego gospodarza zarówno wrodzonej jak i nabytej odpowiedzi
* zdobycie żelaza oraz innych związków odżywczych w celu umożliwienia rozmnazania – czynnik wirulencji w gospodarzu np. toksyna niszcząca erytrocyt lub siderofor
* rozprzestrzenienie się w gospodarzu jak i w populacji (cecha umożliwiająca przeżycie gatunku) – zależne od rodzaju infekcji jak i samego patogenu (im młodszy patogen tym bardziej zjadliwy)
* zdolność do wywołania symptomów chorobowych - niektóre symptomy mogą przyczyniać się do rozwoju infekcji
76
Strategie przeżywania w środowisku zewnętrznym
* bakterie z rodzaju Clostridium i Bacillus produkują endospory
* odporność na wysychanie Enterococcus i Staphylococcus (dzieje się tak dzięki ograniczeniu utleniania białek i denaturacji DNA podczas wysychania)
* stan ograniczenia aktywności metabolicznej lub przejście w stan uśpienia (komórki persisters – brak aktywności metabolicznej, gwarantują przeżycie gatunku)
* zakażanie innych żywicieli – powstawanie żywicieli pośrednich, np. B. burgdorferii przenoszona przez kleszcze
* produkcji wtórych metabolitów np. bakteriocyny
* zmiana struktury osłon komórkowych (systemy pomp wyrzutowych)
* zdolność do zdobywania i metabolizowania czynników odżywczych dostępnych w ograniczonych ilościach
77
PAMPs (pathogen-associated moleculer patterns)
```
• nie występują u gospodarza
• maja istotne znaczenie dla patogenu
• charakteryzują duże grupy patogenów
o lipopolisacharydy
o peptydoglikany
o kwasy tejchojowe
o mannany
o bakteryjne DNA
o dwuniciowe RNA
o niemetylowane sekwencje CpG
```
78
PRRs (pattern recognition receptors)
• umożliwiają identyfikację patogenu przez układ immunologiczny gospodarza
• obecne na lub w komórkach odporności wrodzonej
• klasyfikacja rodzin receptorów
o TLRs rozpoznają bakterie, wirusy, grzyby i pierwotniaki
o NLRs rozpoznają tylko bakterie
o RLRs rozpoznają wirusy
• rozpoznają elementy budowy mikroorganizmów często określane jako PAMPs
• występują konstytutywnie na komórkach układu immunologicznego i rozpoznają PAMPs bez względu na fazę cyklu komórkowego patogenów
79
Biofilm
• ustrukturyzowana społeczność komórek bakteryjnych unieruchomionych w biopolimerowej macierzy zewnątrzkomórkowej wytwarzanej przez te komórki
• na trwałe przytwierdzony do podłoża, na którym wzrasta (materia nieożywiona, tkanki organizmu)
• występowanie w formie biofilmu pozwala bakteriom
o na zasiedlanie różnych nisz ekologicznych – jedna z metod adhezji zapewniająca przeżycie w organizmie gospodarza jak i w środowisku zewnętrznym
o przetrwać w niesprzyjających dla pojedynczych komórek warunkach
• Zalety formy biofilmowej
o oporność na działanie antybiotyków oraz środków dezynfekujących
o ochrona przed atakami pierwotniaków
o ochrona przed fagocytozą w organizmie gospodarza – matrix złożony głównie z cukrów, przez co układ odpornościowy rozpoznaje to jako uwodniony cukier (brak widocznych bakterii)
80
Strategie zdobywania żelaza
• Żelazo niezbędne do funkcjonowania organizmów bakteryjnych
• Borrelia burgdoferi wykorzystuje mangan zamiast żelaza
• żelazo w organizmie gospodarza:
o laktoferyna (białko sekrecyjne chelatujace jony żelaza)
o transferyna (białko surowicy odpowiedzialne za transport żelaza, produkowane w wątrobie)
o ferrytyna (utrzymuje żelazo w dostępnej i nieszkodliwej formie)
o hem (~70% żelaza w organizmie ludzkim występuje w formie hemoglobiny)
• Siderofory u bakterii
o to niskocząsteczkowe związki o wysokim powinowactwie do jonów żelaza
o należą do dwóch klas chemicznych
katechole
hydroksamaty
o bakterie posiadające receptory dla sideroforów produkowanych przez inne gatunki – synergizm w rozwoju koinfekcji – proces energozależny
• Mechanizmy zdobywania żelaza przez bakterie
o żelazo wykorzystywane przez komórki w gospodarza, bakterii, w cząsteczce hemoglobiny – drugi stopień utlenienia
o żelazo przenoszone – trzeci stopień utlenienia
o siderofory przechwytują tylko żelazo na trzecim stopniu utlenienia
o aby wychwycić żelazo na drugim stopniu utlenienia bakterie produkują hemolizyny
• Strategie zdobywania żelaza
o przykłady sideroforów
enterobaktyna - E. coli
o mutacje w genach kodujących siderofory nie zawsze powodują spadek wirulencji szczepu
o produkcja proteaz rozkładających transferyne lub laktoferyne
o zdobywanie żelaza bezpośrednio z hemoglobiny przez S. aureus
o produkcja hemolizyn (cytolizyn)
81
Toksyny bakteryjne są
produktem procesów metabolicznych, który po kontakcie z tkankami gospodarza zaburza ich metabolizm, ze szkodliwym skutkiem dla organizmu
* w wielu przypadkach geny kodujące toksyny nie znajdują się normalnie w chromosomach bakteryjnych
* większość toksyn zakodowanych jest na elementach pozachromosomalnych (PAI, plazmidy)
* w rozprzestrzenianiu się genów kodujących toksyny oraz w ewolucji bakterii patogennych kluczową role odgrywa horyzontalny transfer genów (HGT)
82
Rola toksyn bakteryjnych
• rozmnażanie i ewolucja patogenów
o ochrona przed wpływem układu immunologicznego
o zdobywanie czynników odżywczych dla drobnoustroju
• aspekt użytkowy toksyn (szczególnie tych nieniszczących)
o leczenie zeza
o wspomaganie w terapii porażenia mózgowego
o biologiczna regulacja szkodników upraw roślin (Bt toxin)
o zwalczanie plagi komarów
• prawdopodobna rola w
o fizjologii bakterii i ich wirusów
o regulacji komórkowej patogenów
o funkcjonowaniu fagów
o sygnalizacja pomiędzy komórkami
83
Endotoksyny
są zintegrowane z komórką bakteryjną i uwalniane w momencie lizy komórki
84
egzotoksyny
• Egzotoksyny to białka, które są wydzielane do środowiska zewnętrznego
o niektóre toksyny są akumulowane wewnątrz komórki i uwalnianie w trakcie lizy
o toksyny wstrzykiwane bezpośrednio do komórek żywiciela to białka efektorowe lub egzoenzymy
85
Podział toksyn - nomenklatura w zależności od:
* komórek/narządów, które są atakowane (cytotoksyny, neurotoksyny, hepatotoksyny, werotoksyny)
* produkujących je bakterii lub wywoływanych przez nie chorób (toksyna Shiga, toksyna cholery, toksyna błonicza)
* aktywności enzymatycznej toksyny (cyklaza adenylowa, lecytynaza)
* właściwości biochemicznych (HLT/HST)
* mechanizmu działania
86
Podział toksyn białkowych
```
• Toksyny I typu
o wiążą się z komórką docelową, ale nie wnikają do wnętrza, działają zewnątrzkomórkowo
o superantygen (SAg)
• Toksyny II typu
o działają na błony cytoplazmatyczne komórek eukariotycznych
o fosfolipazy, cytotoksyny tworzące pory
• Toksyny III typu
o klasyczne A-B toksyny
```
87
Lipopolisacharyd (LPS)
Toksyny niebiałkowe
• integralny składnik błony zewnętrznej bakterii Gram-ujemnych
• niezbędny do funkcjonowania drobnoustroju (ochrona przed obronnymi mechanizmami makroorganizmu oraz działaniem kwasów żółciowych i hydrofobowych antybiotyków)
• LPS składa się z trzech regionów różniących się budową chemiczną, właściwościami biologicznymi oraz zmiennością strukturalną
• struktura lipidu A odzwierciedla jego swoistą rolę w aktywności biologicznej LPS, stanowiąc centrum toksyczności tej makrocząsteczki
o im bardziej niesymetryczne kwasy tłuszczowe w lipidzie A tym bardziej LPS jest toksyczny
o jeśli jest nie parzysta liczba łańcuchów w lipidzie A, tym LPS jest bardziej toksyczny
• lipid A uwalnia się w czasie rozpadu komórki bakteryjnej
88
Sepsa
• sepsa jest określeniem zespołu klinicznego, który stanowi powikłanie ciężkiego zakażenia ogólnoustrojowego i charakteryzuje się ogólnoustrojową reakcją zapalną z towarzyszącym uszkodzeniem wielu tkanek i narządów (nadmierna reakcja układu odpornościowego gospodarza)
• stymulacja leukocytów oraz komórek śródbłonka
• uwolnieniem cytokin i czynników zapalnych:
o interleukiny (IL-I, -6, -8 -10)
o czynnik martwicy nowotworu (TNF-α)
o produkty metabolizmu kwasu arachidonowego (prostaglandyny, leukotrieny)
o czynnik aktywujący płytki krwi
o wolne rodniki tlenowe
o nadtlenek wodoru
o tlenek azotu
• uwolnione gwałtownie czynniki w stanach uogólnionego zakażenia bakteriami Gram-ujemnymi mogą powodować uszkodzenie tkanek nieobjętych infekcja
• ich zwiększona sekrecja powoduje:
o wysoką gorączkę
o hipotensję
o tachykardię
o przyspieszony oddech
o a w ciężkich przypadkach prowadzi to do:
wewnątrznaczyniowe wykrzepianie krwi -> powstawanie skrzepów -> niszczenie tkanek
wstrząs septyczny -> śmierć
• Postaci sepsy
1. SIRS (zespół ogólnoustrojowej reakcji zapalnej)
2. sepsa (posocznica)
3. ciężka sepsa
4. MODS (zespół niewydolności wielonarządowej)
5. wstrząs septyczny
6. zespół septyczny
89
• struktury bakteryjne wpływające na aktywacje czynników transkrypcyjnych kontrolujących ekspresje genów odpowiedzi immunologicznej (uwalniane podczas lizy komórki bakteryjnej):
o LPS,
o kwas tejchojowy,
o flagelina,
o fragmenty bakteryjnego DNA
90
Toksyny mikolaktonowe
* Mycobacterium ulcerans jest przyczyną martwiczych, skórnych zmian chorobowych, zwanych owrzodzeniem Buruli
* Egzotoksyna zwana mikolaktonem, wykazująca właściwości cytotoksyczne i immunosupresorowe
91
Pęcherzyki błonowe
* powstają w procesie naturalnej sekrecji u bakterii Gram-ujemnych
* pęcherzyki błonowe formują się, gdy błona zewnętrzna wraz z peryplazmą „odpączkowuje”
* postuluje się, iż zwiększona produkcja pęcherzyków następuje w odpowiedzi na stres, np. obecność związków chemicznych wpływających negatywnie na komórkę, podwyższona temperatura
* pęcherzyki zawierają cały szereg czynników wirulencji (funkcja w transporcie do komórek eukariotycznych i prokariotycznych)
* pęcherzyki zwierają PAMPsy (pathogen-associated molecular patterns), a także białka, enzymy i inne determinanty patogenności
92
Superantygeny (SAg)
• grupa strukturalnie i funkcjonalnie spokrewnionych toksyn
• do superantygenów zalicza się:
o toksynę wstrząsu toksycznego I (TSST-I)
o enterotoksyny gronkowcowe
o eksfoliatyny: ETA i ETB
• SAg wiążą się bezpośrednio z MHCII na powierzchni makrofagów oraz z TCR na powierzchni limfocytów T
• stymulacja 1 na 5 limfocytów T zamiast 1 na 10000
• reakcja gwałtowna i bardzo silna
• może prowadzić do uszkodzenia organów i śmierci
93
Toksyny uszkadzające błonę komórkową
• podwójna rola tych toksyn
o zabicie komórki gospodarza (w szczególności fagocytów – bakteria niszczy fagosom i uwalnia się lub rozpad endosomu)
o ucieczka z fagosomu i wniknięcie do wnętrza komórki gospodarza przed utworzeniem fagolizosomu
• typy toksyn uszkadzających błony
o białka tworzące poryny (PFTs, PFO, RTX)
o enzymy uszkadzające strukturę błony
94
Białka tworzące poryny
• Toksyny tworzące pory (PFTs)
o mechanizm ich działania opiera się o różnice w ciśnieniu osmotycznym wewnątrz komórki i na zewnątrz
o podział PFTs na α-toksyny i β-toksyny
o tworzą bardzo małe pory
• Toksyny zależne od cholesterolu (PFO)
o tworzą pory o dużej średnicy wewnętrznej
o monomery składają się z pojedynczego łańcucha białkowego o długości ok 300-400 aminokwasów
o aktywność zależy tylko od ilości cholesterolu
o Clostridium perfringens (perfringolizyna)
o Streptococcus pyogenes (streptolizyna)
• Toksyny z grupy RTX (repeats in toxin)
o produkowane przez bakterie Gram-ujemne i wydzielane na zewnątrz za pomocą I systemu sekrecji
o charakteryzują się obecnością konserwatywnej struktury C-końca białka, zawierającej kasetę powtórzeń bogatych w glicyny
domena ta wbudowuje się w błonę tworząc kanał częstokroć stabilizowany przez jony wapnia
95
Enzymy uszkadzające błonę
* zaburzenie integralności błony fosfolipidowej
* zróżnicowane nazewnictwo (cytolizyny, hemolizyny, fosfolizyny)
* fosfolipaza (PL) produkowana zarówno przez eukarioty jak i prokarioty
* wykazują swoistość wobec rozpoznawanego substratu jak i swoistość hydrolizowanego wiązania
96
Toksyny A-B
• składają się z dwóch podjednostek
o podjednostka A - o aktywności enzymatycznej
o podjednostka B - odpowiadająca za rozpoznawanie receptorów na komórkach docelowych oraz przenikanie podjednostki A do wnętrza komórki żywiciela
• podział toksyn typu A-B
o toksyny proste - syntetyzowane w postaci pojedynczego łańcucha polipeptydowego podlegającego obróbce proteolitycznej (np. toksyna błonicza, tężcowa i botulinowa)
o toksyny złożone - zbudowane z jednej podjednostki A i pięciu podjednostek B (toksyna cholery, toksyna czerwonki)
• podjednostki A i B są odseparowane podczas obróbki proteolitycznej, ale pozostają połączone mostkami dwusiarczkowymi
o wewnątrz komórki gospodarza następuje rozerwanie wiązań i uwolnienie podjednostek - jest to niezbędne dla dalszej aktywności enzymatycznej podjednostki A
97
Bakteryjne systemy sekrecji a wirulencja
* bakterie wykształciły systemy sekrecji do specyficznego transportu czynników wirulencji na powierzchnię komórki, do środowiska zewnętrznego lub bezpośrednio do wnętrza komórek gospodarza
* sekrecji podlegają: adhezyny, toksyny, egzoenzymy, proteazy, inne czynniki wirulencji
* systemy sekrecji bakterii gram-dodatnich i gram-ujemnych różnią się – ze względu na różnicę w budowie ściany komórkowej
98
• sekrecja - jest to
proces aktywnego transportu przez wszystkie błony (osłony) bakteryjne
99
• translokacja - to
pokonanie błony przez bakteryjne białka efektorowe
100
• eksport – to
transport przez błony cytoplazmatyczną (Gram-dodatnie - na zewnątrz, Gram-ujemne - przestrzeń peryplazmatyczna)
101
System Sec (general secretory system)
* transport potranslacyjny/ kotranslacyjny niezwiniętych białek poprzez kompleks - translokazę Sec
* sekwencja sygnałowa (liderowa) na N-końcu transportowanego białka
* bakterie gram-dodatnie - białka uwalniane są do błony lub do środowiska
* bakterie gram-ujemne - białka pozostają w przestrzeni peryplazmatycznej lub są transportowane przez kolejne systemy
- 3 drogi transportu niezwiniętych białek
a. białko jest kierowane do Sec translokazy potranslacyjnie rozpoznawanie sekwencji sygnałowej przez SecA lub za pośrednictwem SecB o właściwościach chaperonowych zapobiegających zwijaniu białka
b. niektóre białka błonowe i prebiałka są kierowane kotranslacyjnie (związane z rybosomem)Sekwencja sygnałowa jest rozpoznawana przez SRP (ribosome-bound signal regognition particle) i kierowana do receptora FtsY (receptor dla SRP odpowiedzialny również za hydrolizę GTP)
c. potranslacyjnie niektóre białka błonowe wbudowywane są za pośrednictwem YidC
102
Accesory Sec System
```
• Streptococcus, Listeria, Mycobakterium
• składa się z 2 białek SecA:
o SecAI białko spokrewnione z SecA
o SecA2 część systemu pobocznego
• homologiem SecY jest SecY2
• dodatkowo występują białka poboczne Asp1 – Asp5
```
103
System TAT (Twin- argininę transport system)
* system wyspecjalizowany w transportowaniu białek w pełni zwiniętych
* niektóre białka transportowane poprzez system TAT posiadają kofaktory
* białka posiadają sekwencje sygnałową na N- końcu (polarny N- koniec o zróżnicowanej długości; motyw SRRXFLM, region hydrofobowy zbudowany z 12-20 aa kwasowych, czasami kilkoma zasadowymi aa),
* sekwencja sygnałowa rozpoznawana jest przez białko TatBC które rozpoczyna proces zmian konformacyjnych (białko TatBC łączy się z białkiem TatA) prowadzących do utworzenia kanału
* transport z energią pochodzącej z siły protono-motorycznej
104
SYSTEMY SEKRECJI SPECYFICZNE DLA BAKTERII GRAM-UJEMNYCH
| Systemy sekrecji zależne od systemu Sec (General secretory pathway)
T2SS – II system sekrecji
T5SS – V system sekrecji
System chaperon/usher
fimbrie agregacyjne
105
T2SS – II system sekrecji
• system transportujący białka z peryplazmy na zewnątrz komórki
• składa się 12-14 białek
• aparat białkowy system przypomina system biorący udział w biogenezie pili typu IV, składanie faga filamentowego i kompetencyjny aparat do pobierania DNA
np. System pul – transport enzymu pullulanaza wytwarzany przez Klebsiella oxytoca
106
T5SS – V system sekrecji
• Transportowane w ten sposób białka zewnątrzkomórkowe (autotransportery) nie wymagające aktywności białek pomocniczych do wydostania się z peryplazmy
o proteaza IgA N. gonorrhoeacea, E. coli
• prebiałko syntetyzowane jest jako pojedynczy prekursor złożony z kilku domen (α, β, γ oraz proteaza) oraz N-końcowej sekwencji sygnałowej dla transportera Sec
• Podział na 3 grupy:
o Va - białko zostaje związane z błoną lub wystaje na zewnątrz
o Vb - białko zostaje uwolnione na zewnątrz – białko wolne
o Vc – na stałe połączone z błoną, tworzą się adhezyny z rodziny Oca
107
System chaperon/usher
* Chaperon – białko opiekuńcze
* Usher – białko przepuszczające
* Chaperon dostarcza podjednostki a usher przepuszcza i pozwala na syntezę fimbrie Pap i Fim od dołu
108
fimbrie agregacyjne
* Po transporcie białek zwiniętych z peryplazmy na zewnątrz następuje dobudowanie
* są bardzo długie,
* jest ich dużo,
* bakterie dzięki nim agregują,
* podjednostki są transportowane i białka mogą być dobudowywane od góry,
109
SYSTEMY SEKRECJI SPECYFICZNE DLA BAKTERII GRAM-UJEMNYCH
| Systemy sekrecji niezależne od Sec
T1SS – I system sekrecji
T3SS – III system sekrecji
T4SS – IV system sekrecji
T6SS
110
T1SS – I system sekrecji
* system zbudowany z kompleksu 3 białek,
* białko zlokalizowane w błonie cytoplazmatycznej, to ABC transporter (ATP-binding-casstee) – białko czerpie energię z hydrolizy ATP
* transportowane białka mają sekwencje sygnałową na C-końcu (≈50 aa) o charakterze amfipatycznym (zarówno hydrofilowy i hydrofobowy charakter) bogatą w glicyny (powtórzony motyw GGXGXD)
111
T3SS – III system sekrecji
• jednoetapowy transport substratów bezpośrednio do komórki gospodarza (transport białek efektorowych)
• powstał w procesie ewolucji w wyniku przekształcenia genów biorących udział w biogenezie rzęsek
• geny kodujące aparat sekrecyjny zlokalizowane na PAIs
• przenoszenie białek o strukturze monomerów
• w komórkach jednego gatunku bakterii może funkcjonować kilka typów T3SS w zależności od transportowanego białka
• białka efektorowe transportowane poprzez ten system zawierają kilka modułów:
o N-końcowy fragment sygnalny
o fragment wiążący białko opiekuńcze
o domena efektorowa
• aparat sekrecyjny T3SS nazywany jest molekularną strzykawką.
112
T4SS – IV system sekrecji
* jednoetapowy transport substratów bezpośrednio do komórki gospodarza,
* podobieństwo do systemu budującego pilusy koniugacyjne
* energia do transportu pochodzi z rozpadu ATP
* transport białek (monomerów i oligomerów) nukleoprotein, fragmentów rozpadu peptydoglikanu,
113
T6SS
* konserwatywny system u wielu gram ujemnych,
* białka systemu zakodowane są na PAIs,
* sekrecja czynników wirulencji zależna jest od ATP,
* system o homologii do białek bakteriofagowych
114
SYSTEMY SEKRECJI SPECYFICZNE DLA BAKTERII GRAM-DODATNICH
CMT (cytolysin- mediated translocation)
ExPortal
T7SS
115
CMT (cytolysin- mediated translocation)
mechanizm dzięki któremu białka efektorowe są transportowane za pomocą systemu Sec i dostarczane bezpośrednio do komórki gospodarza poprzez porynę uformowaną w błonie cytoplazmatycznej (CDC=PFO)
116
ExPortal
* system Sec zlokalizowany w specyficznej mikrodomenie błonowej,
* proponuje się aby uważany był za organelle koordynujące interakcje pomiędzy wydzielanymi białkami a systemem chaperonów związanych z błoną,
* umożliwienie zwijania się białek na zewnątrz komórki,
* lokalizacja ExPortali w pobliżu miejsca podziału komórki
117
T7SS
* scharakteryzowany u Mycobacterium – powierzchnia komórki woskowata
* jedna cześć w błonie cytoplazmatycznej i druga prawdopodobnie w mykomembranie (zbudowana z lipidów)
* niezależne od systemu Sec
118
Rola mutacji w regulacji na poziomie materiału genetycznego
• spontaniczne mutacje (SNPs single-nucleotide polymorphism)
• insercje oraz delecje (indels)
• w warunkach stresowych pojawia się w populacji frakcja komórek charakteryzujących się większą częstością mutacji (hypermutable fraction)
o cel ewolucyjny – większa szansa na pojawienie się mutacji, która będzie korzystna
• indukcja polimeraz DNA o niskiej wierności (error-prone)
119
Rearanżacje genomowe
* źródło plastyczności genomu bakteryjnego
* analiza genomów bakteryjnych wykazała obecność dużej liczby obszernych, nielosowo rozpowszechnionych sekwencji powtórzonych, które mogą służyć jako miejsca rekombinacji
* rola duplikacji i amplifikacji w oporności na antybiotyki (zwiększona produkcja enzymów, molekuł docelowych lub pomp wyrzutowych)
* duplikacja (poprzez rekombinację homologiczną) i amplifikacja zwiększające liczbę kopii genu oporności
* zmiany w miejscach regulatorowych chromosomu
* zwiększone prawdopodobieństwo powstania mechanizmów oporności o lepszej efektywności
120
Zmienność fazowa
• proces adaptacyjny, w którym komórki bakteryjne przechodzą częste i odwracalne zmian fenotypu
• efektem jest niejednolity skład populacji
• zjawisko jest odwracalne (nie doprowadza do nagromadzenia zmian potencjalnie szkodliwych dla komórki) i dotyczy konkretnych genów (mimo, że jest to proces przypadkowy)
• główne mechanizmy warunkujące zmienność fazową:
o rekombinacja zlokalizowana
o pomyłki w replikacji DNA
o metylacja sekwencji GATC
121
Rekombinacja zlokalizowana
* np. rzęski Salmonella
* komórki Salmonella występują w dwu różnych stanach aglutynacyjnych flagelina H1 – FliC lub H2 – FljB
* następuje rekombinacja zlokalizowana (udział rekombinazy Hin oraz kompleksu białkowego zwanego inwertasomem)
122
Pomyłki w replikacji DNA
| • slipped-strand misrepair
* dotyczy genów zawierających w regionach promotorowych lub rejonach 5’ sekwencje powtórzone
* ich obecność skutkuje poślizgiem polimerazy w trakcie replikacji, co wpływa na dodawanie lub usuwanie powtórzeń
* tego typu zmiany zaburzają procesy transkrypcji i translacji, niejednokrotnie prowadząc do braku funkcjonalnego białka (zmiana ramki odczytu, wypadanie kodonu „start”) lub zmiany poziomu jego transkrypcji
* w efekcie otrzymujemy bakterie o różnym fenotypie
123
Metylacja sekwencji GATC
* np. fimbrie typu Pap u uropatogennych szczepów E. coli
* proces epigenetyczny (nie powoduje zmian w sekwencji nukleotydowej, a jedynie zmiany fenotypowe)
* czynniki środowiska wpływające na wytwarzanie tych organelli adhezyjnych to temperatura 37°C oraz osmolarność
* nawet w optymalnych warunkach populacja drobnoustrojów zawiera komórki zawierające fimbrie, jak i takie, które nie mają tych struktur
* zmienność fazowa ekspresji operonu pap w temperaturze 37°C, regulowana na poziomie transkrypcji, jest uzależniona od metylacji dwu sekwencji GATC (I i II)
* w zależności od tego, która sekwencja GATC jest zmetylowana dochodzi (bądź też nie) do ekspresji operonu pap i biogenezy fimbrii adhezyjnych
124
Zmienność antygenowa
• proces trudny do odwrócenia
• umożliwia ucieczkę przed mechanizmami obronnymi gospodarza
• umożliwia kolonizację różnych środowisk
• to zmiany fenotypowe warunkujące ogromną różnorodność fenotypową i zmienność populacji bakteryjnej
• procesy skutkujące zmianami sekwencji aminokwasowych w białkach powierzchniowych o charakterze antygenów
• strategia ta umożliwia patogenom uniknięcie rozpoznania przez komórki układu immunologicznego
• mechanizmy warunkujące ten proces:
o rearanżacje genomu na drodze rekombinacji pomiędzy wieloma kopiami tego samego genu w chromosomie
o rearanżacje genomu na drodze rekombinacji pomiędzy powtarzającymi się sekwencjami nukleotydowymi w obrębie konkretnego genu
125
Skutki zmienności antygenowej i fazowej
* różne objawy infekcji tą samą bakterią
* trudności w konstruowaniu skutecznych szczepionek
* pojawianie się „nowych” szczepów patogennych, podczas gdy „stare” nabywają nowych właściwości
* przebycie groźnej choroby bakteryjnej może nie chronić przed ponownym zakażeniem (np. rzeżączka)
126
Poziomy regulacji na poziomie transkrypcji genów
• warunki środowiskowe wpływające na proces regulacji ekspresji czynników wirulencji
o temperatura
o pH
o dostępność jonów żelaza (Fe2+)
o inne jony dwuwartościowe (Ca2+, Mg2+, Mn2+)
o dostępność węgla i azotu (cukry, aminokwasy)
o osmolarność
o dostępność tlenu
o obecność CO2
o dostępność światła
• geny wirulencji - geny, które są regulowane w odpowiedzi na działanie czynników wirulencji, a ich produkty warunkują przeżycie patogenu w gospodarzu, infekcję i wywołanie procesu chorobowego
• poziomy regulacji - operony i regulony
o regulony - regulacja skoordynowana to regulacja ekspresji wielu genów w odpowiedzi na pojedynczy sygnał
o gdy jeden regulator kontroluje dużą liczbę różnych typów genów a co za tym idzie całego szeregu procesów fizjologicznych nazywa się go globalnym regulatorem
127
Aktywatory i represory transkrypcyjne
* aktywator transkrypcyjny to białko stymulujące ekspresję genów poprzez wiązanie się do specyficznej sekwencji DNA i wiązanie polimerazy RNA do regionu promotorowego
* represor transkrypcyjny działa odwrotnie do aktywatora fizycznie uniemożliwiając związanie polimerazy RNA do regionu promotorowego
* wiele genów wirulencji zależnych od poziomu żelaza jest regulowanych poprzez aktywność represora homologicznego do Fur (ferric uptake repressor) u E. coli
128
Regulacja genów wirulencji poprzez poziom żelaza
* toksyna DT produkowana przez Corynebacterium diphteriae
* białko DtxR jest represorem podobnym do Fur aktywnym w przypadku wysokiego stężenia jonów żelaza w środowisku
* gdy brak żelaza – białko DtxR zmienia konformację i nie blokuje promotora
129
Układy dwuskładnikowe w regulacji procesów patogenezy (TCS)
• komórki bakteryjne muszą stale kontrolować warunki otoczenia i reagować odpowiednio na zmiany
• regulacja przez układ dwuskładnikowy zachodzi na poziomie transkrypcji i jest aktywowana przez czynniki środowiska
• im większy genom bakteryjny i im więcej nisz ekologicznych tym więcej TCS – każdy system TCS odpowiedzialny jest za wyczuwanie odpowiedniego czynnika
• układ dwuskładnikowy to system umożliwiający odebranie i przekazanie sygnału
• najprostszy TCS składa się z:
o sensora - białka odbierającego sygnał, zlokalizowanego w błonie komórkowej
o regulatora - białka cytoplazmatycznego zdolnego do wiązania DNA w rejonach promotorowych i wpływającego na proces transkrypcji
• mechanizm działania - odebranie sygnału wiąże się z autofosforylacją białka sensorowego na konserwowanej reszcie histydyny (N-koniec), która dalej stanowi źródło dla fosforylacji kwasu asparaginowego domeny regulatorowej (centrum katalityczne tworzone przez konserwowane bloki aminokwasów C-końca). Ta fosforylacja indukuje zmianę konformacyjną białka regulatorowego i umożliwia wiązanie się z DNA i transkrypcję genów
130
Białko sensorowe
• dwie domeny
o domena peryplazmatyczna przyjmująca sygnał posiada zmienną sekwencją aminokwasową (w zależności od rodzaju sygnału)
o cytoplazmatyczna domena transmitera uczestniczy w przeniesieniu sygnału
• jest autokinazą (sama ulega fosforylacji) tworzącą homodimery
• histydyna zlokalizowana jest przeważnie na N-końcu białka
• posiada aktywność fosfatazową
131
Białko regulatorowe
• dwie domeny
o domena odbierająca sygnał jest ewolucyjnie konserwowana
o domena oddziałująca z DNA ma sekwencję zmienną (oddziałuje z różnymi sekwencjami promotorowymi)
• katalizuje transfer grupy fosforanowej
• fosforylacja domeny przyjmującej sygnał skutkuje zmianą konformacji domeny oddziałującej z DNA odblokowując proces transkrypcji
132
Układ PhoP- PhoQ
warunkujący wirulencję Salmonella
• jest to układ białek regulujący aktywność niespecyficznej fosfatazy
• głównym regulatorem aktywności układu jest stężenie jonów magnezu, wyczuwane przez domenę peryplazmatyczną białka sensorowego
• białko PhoQ znajdujące się w błonie cytoplazmatycznej odbiera sygnał i przekazuje go na cytoplazmatyczne białko regulatorowe PhoP
• duże stężenie jonów magnezu indukuje wyciszenie transkrypcji genów pag i włączeniem transkrypcji genów prg
• pewna klasa genów aktywowanych przez PhoP podlega także kontroli drugiego układu dwuskładnikowego PmrA-PmrB
o układ ten reaguje na stężenie jonów żelaza
o ulega ekspresji w środowisku o małym stężeniu jonów magnezu i dużym jonów żelaza
• wiele z nich warunkuje wprowadzenie rozmaitych modyfikacji w strukturze osłon komórkowych, co powoduje miedzy innymi oporności bakterii na niektóre peptydy przeciwbakteryjne – modyfikacja LPS
133
wieloetapowy transfer grupy fosforanowej (phosphorelay)
* odmianą układu dwuskładnikowego
* zapewnia bardziej precyzyjną modulację odpowiedzi komórki (regulacja szybkości przepływu grupy fosforanowej)
* grupa fosforanowa jest przekazywana w sekwencji: His-Asp-His-Asp pomiędzy kolejnymi modułami białka sensorowego
* BvgAS Bordetella pertussis
* inną odmianą transdukcji sygnału jest układ wyczuwania liczebności (quorum sensing)
134
Czynnik sigma
* czynniki σ są podjednostkami polimerazy RNA umożliwiającymi rozpoznawanie specyficznych sekwencji promotorowych
* czynniki σ są rozróżniane na podstawie ich masy molekularnej
* są związane z ekspresją genów ważnych w szczególnych warunkach np. stresowych lub genów związanych z cyklem życiowym komórki
* rdzeń polimerazy może związać tylko jeden czynnik σ
* czynniki σ odgrywają kluczową rolę w regulacji transkrypcji wielu genów wirulencji
* bakterie różnią się pod względem ilości posiadanych czynników σ
* u niektórych gatunków bakterii opisano systemy regulacji negatywnej z udziałem czynników anty-σ
* są to swoiste białka antagonistyczne , które wiążą się z czynnikami σ i tym samym uniemożliwiają ich przyłączanie do rdzenia polimerazy RNA
* funkcja czynników σ może zostać przywrócona poprzez aktywność czynników anty-anty σ
* jest to modelowy przykład regulacji kaskadowej
135
Termosensory RNA
* struktura RNA może służyć za indykator zmian temperatury
* w niskich temperaturach RNA tworzy strukturę spinki do włosów maskując miejsca RBS (sekwencje Shine-Dalgarno SD) tzw. termostable riboswitches
* w wyższych temperaturach struktura II rzędowa ulega roztopieniu i miejsca RBS są wolne
* translacja IcrF u Yersinia pestis następuje w temperaturze 37°C (aktywator transkrypcyjny wielu genów wirulencji)
* często zjawisko u patogenów posiadających żywicieli pośrednich (zimnokrwistych i ciepłokrwistych)
136
Mechanizmy działania ncRNA
• małe niekodujące RNA (ncRNA – non-coding RNA = sRNA – small RNA)(40-500 nukleotydów) są modulatorami ekspresji genów bakteryjnych w odpowiedzi na zmiany czynników środowiska
• ncRNA koordynują adaptację do warunków stresowych (odpowiedź na zmiany różnych czynników środowiska) oraz ekspresję genów wirulencji
• efekt działania może być pozytywny lub negatywny i wpływa na procesy translacji lub stabilność mRNA (zmiana jego struktury)
• ncRNA działają jako antysensowne RNA komplementarne do mRNA
• przyłączając się zmieniają strukturę mRNA
o przyłączenie w rejonie 5’ mRNA skutkuje brakiem translacji
o wiązanie ncRNA w rejonach RBS blokuje rybosomy
o przyłączenie się ncRNA w rejonach 3’ mRNA powoduje zmianę jego struktury i skierowanie na drogę degradacji
o małe RNA przyłączają się głównie do obszarów niekodujących lub w środku operonu (poziom ekspresji białek z jednego operonu nie jest identyczny)
• wiele ncRNA to cząsteczki efektorowe układów quorum sensing umożliwiające bakteriom monitorowanie gęstości populacji oraz dostosowanie ekspresji genów do fazy wzrostu
• poziom ekspresji regulowany jest przez trzy ncRNA, których produkcja związana jest z warunkami środowiska (wpływają też na inne białka - efekt plejotropowy)
• małe RNA mogą także wpływać na białka regulatorowe - wiążąc się z nimi znoszą ich działanie
137
Quorum sensing (QS)
• system komunikacji między komórkami bakterii uczestniczący w regulacji ekspresji genów w odpowiedzi na gęstość populacji drobnoustrojów
• ma szczególne znaczenie w opanowywaniu przez bakterie nowych środowisk
• w QS pośredniczą małe cząsteczki sygnalizacyjne (autoinduktory)
• po przekroczeniu progowego stężenia dochodzi do skoordynowanej zmiany ekspresji genów
• systemy QS bakterii Gram-dodatnich i Gram-ujemnych w znacznym stopniu różnią się od siebie
• w QS bakterii uczestniczą cząsteczki sygnalizacyjne
o u Gram-ujemnych lakton N-acylo-L-homoseryny (acyl-L-homoserine lactone-AHL)
o bakterie Gram-dodatnie sygnały oligopeptydowe (trawienie większych prekursorów białkowych)
• transport na zewnątrz komórki za pośrednictwem transporterów ABC
• system QS zidentyfikowano u licznych gatunków bakterii patogennych dla człowieka, zwierząt oraz roślin
138
Quorum sensing bakterii Gram-ujemnych
• system QS oparty na cząsteczkach AHL, zidentyfikowano u ponad 26 gatunków bakterii Gram-ujemnych
• system opierający się na współdziałaniu:
o cząsteczek sygnalizacyjnych AHL (chemiczne sygnały dyfuzyjne lub autoinduktory)
o białek z rodziny syntaz autoinduktora LuxI
o rodziny białkowych regulatorów transkrypcyjnych LuxR
o genów docelowych
139
Cząsteczki sygnalizacyjne AHL
zbudowane z pierścienia laktonu homoseryny (homoserine lactone – HSL) acylowanego łańcuchem tłuszczowym (4–18 atomów węgla)
• zmiany konformacyjne pierścienia HSL przy pH 8-9 (zależność od wartości pH środowiska)
• transport cząsteczek AHL
o swobodna dyfuzja przez ścianę komórkową - AHL mające łańcuch kwasu tłuszczowego zawierający 4–6 atomów węgla
o transport z udziałem pompy protonowej - autoinduktory o łańcuchach kwasu tłuszczowego zawierających powyżej 6 atomów węgla
140
Białka z rodziny LuxI
• warunkują syntezę cząsteczek AHL u bakterii Gram-ujemnych
141
Regulator transkrypcyjny LuxR
* stężenie cząsteczek sygnalizacyjnych w otaczającym komórki bakteryjne środowisku osiąga odpowiedni poziom
* AHL wiążą się i uaktywniają rodzinę białkowych regulatorów transkrypcyjnych LuxR
* C-końcowy fragment łańcucha polipeptydowego jest odpowiedzialny za bezpośrednie oddziaływanie z DNA
* N-końcowy fragment łańcucha jest odpowiedzialny za rozpoznawanie i wiązanie cząsteczek AHL
* w większości przypadków w obecności cząsteczki AHL, białko LuxR zmienia konformację i ulega aktywacji, indukując transkrypcję genów docelowych
142
HGT a QS
* w mechanizmie quorum sensing występuje horyzontalny transfer genów
* wiele homologów białek LuxR i LuxI jest umiejscowionych na plazmidach
143
Quorum sensing bakterii gram-dodatnich
* sygnały oligopeptydowe
* obróbka potranslacyjna z udziałem białek błonowych (trawienie większych prekursorów białkowych)
* odkryty u S. aureus system Arg
* synteza większości czynników wirulencji pod globalną kontrolą systemu Arg
144
do czynników wirulencji regulowanych przez system quorum sensing, należą
```
o biosynteza pozakomórkowych proteaz
o biosynteza hemolizyn
o biosynteza egzotoksyn
o tworzenie biofilmu
o wzrost rozpełzliwy komórek
```
145
• proces tworzenia się biofilmów bakteryjnych na powierzchni komórek eukariotycznych lub materiałach abiotycznych jest regulowany przez
mechanizm QS
• wytwarzanie przez komórki cząsteczek AHL inicjuje proces adhezji pojedynczych drobnoustrojów do płaszczyzn stałych
• komórka bakteryjna łączy się z daną powierzchnią od strony, w której tempo sekrecji cząsteczek sygnalizacyjnych uległo zmniejszeniu
• u drobnoustrojów, pozostających w zawiesinie, sekrecja cząsteczek AHL jest jednakowa z każdej strony komórki
• w matrycy dojrzałego biofilmu możliwa jest swobodna dyfuzja cząsteczek sygnalizacyjnych
146
Enteropatogeny
| • patogeny wewnątrzkomórkowe:
```
o Salmonella (dur brzuszny)
o Shigella (dyzenteria)
o Listeria (listriozy)
o Mycobacterium (gruźlica, trąd)
o Legionella (legionelloza)
o Neisseria (rzeżączka)
o Yersinia (dżuma)
o Rickettsiae (tyfus)
• komórki w których się namnażają :
o komórki nabłonka/śródbłonka („non-phagocytic cells”) → naturalna bariera ochronna
o hepatocyty
o makrofagi
```
147
Mechanizm działania enteropatogenów
• białka efektorowe
o kinazy
o fosfatazy tyrozynowe
o fosfatazy inozytolu
o białka modulujące aktywność małych białek G (GTPazy Rho)
Rho, Rac, Cdc42
białka kontrolowane przez cykl GTPazowy
• wpływ na szlaki transdukcji sygnału
• przebudowa cytoszkieletu (aktyna związana z błoną, aktyna na biegunie komórki-kompleks Arp2/3)
• indukcja lub zahamowanie apoptozy
148
Oddziaływanie bakterii patogennych z białkami G
W formie nieaktywnej białka G mają przyłączone GDP.
• grupy białek regulujące aktywność białek Rho:
o aktywujące białka GEF (ang. guanine nucleotide exchange factors) umożliwiają wymianę GDP na GTP i przeprowadzają białka Rho w stan aktywny
o regulatorowe białko GDI (ang. guanine nucleotide dissociation inhibitors) blokujenwymianę nukleotydu i wplywa na transport białka G z błon komórkowych do cytozolu
o regulatorowe białko GAP (ang. guanine nucleotide activating protein) regulujenwewnętrzną aktywność GTPazową białek Rho stymulując hydrolizę GTP do GDP i Pi intym samym prowadząc do inaktywacji białek Rho
• enteropatogeny mogą modulować aktywność białek G poprzez
o toksyny białkowe przenoszące małe cząsteczki na białka docelowe np. na małe białka G
ADP ryboza (toksyny ADP rybozylujące)
glukoza (glukozylotransferazy)
o białka efektorowe produkowane przez większość patogenów i przekazywane do cytozolu komórek gospodarza,
należeć do rodziny GEF, GDI, GAP
modulują szlaki sygnalizacyjne
149
Wnikanie enteropatogenów do fagocytów
• rola układu immunologicznego (fagocytoza)
• część patogenów w toku ewolucji wykształciła zdolność przeżycia i rozmnażania się w makrofagach, neutrofilach czy komórkach dendrytycznych
o Mycobacterium spp.
o Brucella spp.
o Legionella spp.
o Salmonella enterica
• proces złożony i prawdopodobnie odmienny od fagocytozy opsonizowanych lub zabitych bakterii
150
Etapy internalizacji komórek enteropatogenów
1) kontakt patogenu z komórką gospodarza i adhezja niezależne od aktyny (tylko receptor i ligand)
2) formowanie błony związane z polimeryzacją aktyny
3) zamknięcie błony i depolimeryzacja aktyny
151
Mechanizmy wnikania do niefagocytujących komórek eukariotycznych
Mechanizm zipper
• adhezyny bakteryjne wiążą się z receptorem na powierzchni komórki
• następuje aktywacja białek regulatorowych modulujących dynamikę cytoszkieletu
• aktywacja kaskad sygnalizacyjnych (fosforylacja tyrozyny) prowadzących do rearanżacji aktyny i reorganizacji błony
Mechanizm trigger
• białka efektorowe wnikają do komórki gospodarza poprzez T3SS
• wpływ na kluczowe białka regulatorowe
• kontrola dynamiki zmian cytoszkieletu
• dramatyczne rearanżacje cytoszkieletu skutkujące fałdowaniem błony (membrane ruffling) oraz makropinocytozą
• niektóre białka efektorowe mimikują aktywatory białek GTPaz (GAPs) lub GEFs (guanine-nucleotide-exchange factors)
152
Strategie przeżywania wewnątrz komórek
```
Modyfikacja warunków wewnątrz fagosomu
• Fuzja z lizosomem
o Coxiella
• Poza szlakiem endocytozy
o Chlamydia,
o Legionella,
o Brucella
• Zahamowanie dojrzewania fagosomu
o Mycobacterium,
o Salmonella
```
Ucieczka do cytozolu
o Listeria
o Shigella
o Rickettsia
153
Modulacja procesu apoptozy przez enteropatogeny
działanie pro- i antyapoptotyczne w zalezności od:
o gatunku patogenu
o 2etapu cyklu życiowego
Legionella na początku działa anty- a potem proapoptotycznie
Mycobacterium, Chlamydia - w zależności od etapu infekcji indukują lub hamują śmierć komórki
o rodzaju komórek eukariotycznych
Shigella, Salmonella, Neisseria - działanie pro- na makrofagi i anty- na komórki nabłonkowe
• apoptoza indukowana infekcją bakteryjną jest procesem tkankowozależnym
154
Patogeny oportunistyczne
• występują w środowisku bądź kolonizują makroorganizm (składniki flory naturalnej)
• nie są szkodliwe dla makroorganizmów, ale mogą wywołać zakażenia endogenne, nieraz o ciężkim przebiegu
o u osób z zakłóconą sprawnością układu immunologicznego
o u osób przewlekle chorych
o u osób po terapii antybiotykami
o przy naruszeniu ciągłości tkanek
155
Czynniki predysponujące do zakażeń przez drobnoustroje oportunistyczne
• zakłócona równowaga immunologiczna
• przewlekłe wyniszczające choroby (nowotwory złośliwe, białaczka, chłoniaki)
• zaburzenia metaboliczne (cukrzyca, niedoczynność tarczycy, niewydolność nerek, przewlekły alkoholizm)
• choroby układu oddechowego i przewodu pokarmowego przebiegające z obniżeniem odporności komórkowej i/lub humoralnej
• czynniki jatrogenne spowodowane podczas leczenia
o stosowanie różnych leków (antybiotyki o szerokim spektrum)
o tuberkulostatyki (leki przeciwgruźlicze)
o leki immunosupresyjne
o badania kliniczne i laboratoryjne
o zastosowanie aparatury medycznej – respiratory, cewniki, hemodializa, karmienie dożylne
