Mechanizmy bakteryjnej patogenezy

Question 1

Patogeny emerging

Answer 1

nowe czynniki etiologiczne, wyizolowane po 1976 roku
o	Legionella pneumophila
o	Campylobacter jejuni
o	Bartonella hensalae
o	Helicobacter pyroli
o	Borrelia burgdorferi

Question 2

• Patogeny reemerging

Answer 2

– patogeny pojawiające się na nowo, szczepy zyskujące nowe geny zwiększające ich wirulencje
o Mycobacterium tuberculosis
o Staphylococcus aureus
o Escherichia coli EHEC - enterokrwotoczna

Question 3

patogen New-new

Answer 3

Wyizolowane po raz pierwszy w historii ludzkości
Legionella
Borrelia

Question 4

patogen new-old

Answer 4

Znane od dawna i wywołujące choroby wcześniej, ale dopiero od niedawna istnieją metody diagnostyczne do ich identyfikacji
Campylobacter
Bartonella
Helicobacter pyroli

Question 5

patogen old-new

Answer 5

Patogeny znane od dawna, ale powracające w nowej postaci
Mycobacterium
Vibrio cholerae

Question 6

patogen old-old

Answer 6

Dawne patogeny stanowiące obecnie istotny czynnik etiologiczny Chlamydia trachomatis
Neisseria gonorhoeae

Question 7

Patogeny oportunistyczne

Answer 7

• Powodują choroby u pacjentów z osłabionym układem odpornościowym lub w nowym miejscu ze sprzyjającymi warunkami wzrostu, gdzie wcześniej nie występowały
• Naturalna flora fizjologiczna człowieka
• Drobnoustroje powszechnie występujące w środowisku naturalnym – np. bakterie glebowe produkujące antybiotyki

Question 8

Współczesne zagrożenia związane z patogenami

Answer 8

• Zakażenia związane z żywnością i wodą
o Zakażenia związane z osłabieniem układu odpornościowego
 Transplantologia
 Chemioterapia w leczeniu raka
 AIDS (limfocyty T helperowe)
o Zakażenia związane z pokonaniem barier ochronnych przez bakterie
 Zabiegi chirurgiczne
 Aparatura podtrzymująca życie, np. rurki intubacyjne
o Patogeny oportunistyczne
o Zakażenia wynikające z wydłużonego życia ludzi
• Zakażenia pooperacyjne
• Bioterroryzm

Question 9

Mikroflora ludzkiego organizmu

Answer 9

• Bakterie wyraźnie zaznaczają swoją obecność
• Szereg korzyści ze współistnienia
o Udział w trawieniu – produkcja enzymów
o Produkcja witamin (K, z grupy B)
o Wykorzystywanie związków odżywczych
o Blokowanie miejsc do adhezji
o Decydująca rola w rozwoju wyściółki jelit
o Rozwój i dojrzewanie układu immunologicznego
o Rola probiotyków i prebiotyków
• Organizm człowieka to złożony ekosystem w którym znajduje się bogata i niezwykle zróżnicowana flora bakteryjna
• Człowiek w życiu płodowym jest pozbawiony drobnoustrojów
• Kolonizacja rozpoczyna się podczas porodu – mikroflora pionierska
• Dominującą florą człowieka są bakterie gram-dodatnie
• W przypadku chorób typu shift następuje przesunięcie tej równowagi na korzyść drobnoustrojów gram-ujemnych

Question 10

Jakie drobnoustroje są obecne (skład gatunkowy)?

Answer 10

sekwencjonowanie genów 16S rRNA i poszukiwanie pokrewieństw w bazach danych

Question 11

Jakie jest pokrewieństwo pomiędzy różnymi izolatami tego samego gatunku?

Answer 11

porównanie genomów poprzez profile map restrykcyjnych lub profile otrzymane metodą PCR

Question 12

aki jest potencjał fizjologiczny populacji bakteryjnej?

Answer 12

izolacja DNA z mieszaniny populacji bakteryjnych trawienie, klonowanie, sekwencjonowanie poszukiwanie genów w bazach danych

Question 13

Miazmatyczna teoria chorób

Answer 13

• Przyczyny chorób epidemicznych są w szkodliwym i zanieczyszczonym powietrzu, brudzie i odrażających zapach
• Zakażenia były wywoływane przez miazmaty, czyli wyziewy gnilnego powietrza pochodzące z wnętrzności ziemi i wdzierające się do ciała (tzw. morowe powietrze)

Question 14

Klasyczne postulaty Kocha

Answer 14

I Drobnoustrój musi być izolowany od wszystkich chorych osobników wykazujących identyczne objawy chorobowe
II powinien być otrzymywany w czystej hodowli in vitro
III Po celowym zakażeniu gospodarza powinien wywołać objawy chorobowe identyczne z poprzednio obserwowanymi
IV Od intencjonalnie zakażonego gospodarza powinien być wyizolowany ten sam drobnoustrój

Question 15

Izolacja patogenu in vitro w czystej kulturze

Answer 15

• Bakterie różnią się pod względem wymagań metabolicznych
• Brak jest uniwersalnego medium do hodowli wszystkich drobnoustrojów
• Ogromny wpływ mają też warunki hodowli
• Nie wszystkie bakterie mogą być hodowane na podłożach (Chlamydophila pneumoniae – hodowle tkankowe)
• Bakterie, które nie zostały wyhodowane w postaci czystych kolonii
o Treponema pallidium (jądra królika)
o Mycobacterium leprae
• Zastosowanie metod molekularnych w celu identyfikacji czynnika etiologicznego choroby

Question 16

Nowoczesne metody Umożliwiające potwierdzenie postulatów Kocha

Answer 16

o identyfikacja drobnoustrojów z tkanek gospodarza z zastosowaniem metody PCR
 odnalezienie charakterystycznego genu i starterów
o identyfikacja drobnoustrojów z tkanek gospodarza z zastosowaniem metod immunohistochemicznych
 znakowanie przeciwciałami określonych struktur
• doprowadziło to do:
o zastosowania antybiotyków w leczeniu chorób
o profilaktyka szczepienna
o higiena, dezynfekcja, zdrowa praktyka

Question 17

5 postulat Kocha

Answer 17

powstały po nowoczesnych metodach potwierdzających postulaty
• eliminacja drobnoustroju lub ochrona przed ekspozycją na jego działanie powinny eliminować chorobę lub jej zapobiegać
• szczepienia ochronne również jako metoda potwierdzająca związek patogenu z chorobą (wirus HPV –> związek z rakiem szyjki macicy)

Question 18

Choroby typu „SHIFT”

Answer 18

• brak określonego gatunku odpowiedzialnego za chorobę
• w wyniku zmian środowiskowych powoduje zwiększenie niektórych liczebności populacji bakterii, co prowadzi do powstania choroby
• parodontoza
• waginozy

Question 19

Molekularne postulaty Kocha

Answer 19

• Dotyczą cechy genu, którego produkt zaklasyfikowano jako czynnik wirulencji:
o 1) odnajdywany jedynie w szczepach chorobotwórczych
o 2) powinien ulegać ekspresji na pewnym etapie infekcji, a kodowany przez niego produkt powinien indukować pewien typ odpowiedzi immunologicznej
o 3) unieczynnienie genu kodującego czynnik wirulencji powinno prowadzić do obniżenia poziomu wirulencji
o 4) wprowadzenie genu (również operonu, wysp patogenności) do szczepu niewirulentnego może przekształcić go w szczep chorobotwórczy
o 5) możliwość klonowania genu – do badań

Question 20

Infekcja

Answer 20

• proces wniknięcia drobnoustroju do organizmu gospodarza, połączony z jego namnażaniem i kolonizacją
o infekcja nie jest równoznaczna z wystąpieniem objawów chorobowych
o może dojść do eradykacji mikroorganizmu – układ immunologiczny poradzi sobie z mikroorganizmem
o działalność układu immunologicznego eliminuje patogen ale nie objawy chorobowe (choroby autoimmunizacyjne)
• infekcje chroniczne (przewlekłe) - poziom indukowanej odpowiedzi immunologicznej jest zbyt niski do eliminacji patogenu
o zbyt niska odpowiedź immunologiczna powoduje wytworzenie równowagi z patogenem
o Helicobacter pylori –wrzody żołądka, objaw: bóle żołądka -> nowotwór żołądka

Question 21

• choroba to

Answer 21

kliniczna manifestacja uszkodzeń tkanek gospodarza, zainicjowana oddziaływaniem pomiędzy nim a drobnoustrojem

Question 22

• mikroorganizm patogenny to

Answer 22

mikroorganizm zdolny do wywołania uszkodzeń organizmu gospodarza

Question 23

• kolonizacja to

Answer 23

zdolność mikroorganizmu do namnażania się w konkretnej niszy ekologicznej (nie jest równoznaczna z chorobą ani z infekcją)
o Dotyczy głównie środowiska życia mikroorganizmu

Question 24

Czynniki wpływające na ewolucję patogenów

Answer 24

•	Dostosowanie do warunków środowiska
o	Ofensywne
	Toksyny
	Inwazyny
o	Defensywne
	Maskowanie antygenów
	Proteazy IgA
	Koagulacja
o	Nie specyficzne
	siderofory 
•	Walka o nisze – w jakiś sposób trzeba eliminować inne organizmy, konkurencji (np. antybiotyki, obniżenie pH przez produkcję metabolitów wtórnych)
•	Dostępność czynników odżywczych 
•	Zmiany struktury populacji żywicieli 
o	doprowadzają do powstania chorób, które wcześniej nie występowały
•	Koewolucja patogenów i żywicieli
o	Im dłuższe oddziaływanie między patogenem i żywicielem, tym te odziaływanie jest delikatniejsze i subtelniejsze, przez co nie prowadzą od razu do śmierci żywiciela

Question 25

• Plastyczność genomów (genom stale dostosowuje się do środowiska) bakteryjnych zależy od

Answer 25

o Rearanżacji DNA - insercje, delecje, inwersje wewnątrz genomu bakteryjnego
o Nagromadzenia mutacji punktowych – przy każdym powielaniu materiału genetycznego polimerazy „mylą się” prowadząc do powstania mutacji w tym również mutacji korzystnych
o Horyzontalnego transferu genów (HGT) - główna siła napędowa ewolucji bakteryjnej

Question 26

• Usuwanie z komórki informacji genetycznej

Answer 26

o Pseudogenizacja – powstają pseudogeny, czyli obszary zawierające niekodujące geny
o Redukcja genomu – usuwanie fragmentu genomu
o Działają tak patogeny wewnątrzkomórkowe
 Np. wyewoluowanie Shigella spp., z Escherichia coli, która pozbyła się bardzo dużego fragmentu genomu

Question 27

Mobilne elementy sprzyjające horyzontalnemu transferu genów

Answer 27

• Bakteriofagi integrowane do chromosomu
• Transpozony
• Plazmidy – przenoszone pomiędzy bakteriami

Question 28

Mechanizmy warunkujące plastyczność genomów bakteryjnych

Answer 28

1. Mutacje punktowe - Zmiany ekspresji genów
2. Rekombinacja homologiczna - Rearanżacje DNA, inwersje, duplikacje, delecje, integracja DNA nabytego na drodze HGT
3. Transformacja - Zyskiwanie nowej informacji genetycznej
4. Sekwencje insercyjne -
   Insercje, delecje, inwersje DNA, zmiany ekspresji genów
5. Transpozony - koniugacyjne Koniugacja
6. Plazmidy -
   Mobilizacja innych plazmidów, HGT
7. Bakteriofagi - Transdukcja, HGT
8. Wyspy patogeniczności (PAIs) - HGT, integracja lub utrata dużych fragmentów DNA

9.Mutacje punktowe -
Zmiany ekspresji genów, utrata funkcji

10. Rekombinacja homologiczna -
    Rearanżacje DNA, delecja DNA, integracja DNA nabytego na drodze HGT
11. Transpozycja - Zmiany ekspresji genów, utrata funkcji

Question 29

• Cykle w których funkcjonują bakteriofagi

Answer 29

o Cykl lityczny – bakteriofag namnaża się w bakterii, a następnie ją niszczy
o Cykl lizogenny – bakteriofag wbudowuje się w materiał genetyczny komórki, jest powielany wraz z rozwojem komórki, komórki potomne gospodarza posiadają również tego bakteriofaga
 Cały wirus wnika do komórek zwierzęcych, w przypadku komórek roślinnych niekoniecznie

Question 30

Transdukcja uogólniona (ogólna)

Answer 30

• Każdy z licznych genów faga litycznego może być przeniesiony z jednej komórki bakterii do drugiej
• Podczas łączenia się części składowych faga, do główki pakowany jest DNA chromosomowy lub plazmidowy bakterii zamiast DNA fagowego
• W komórce biorcy (transduktanta) transdukowany DNA może:
o Być degradowany przez restrykcyjne endonukleazy
o Rekombinować z chromosomem (lub plazmidem), czego wynikiem jest stabilne dziedziczenie niektórych cech dawcy (transdukcja pełna)
o Trwać jako ustabilizowana, ale niereplikująca się cząsteczka (transdukcja poronna)

Question 31

Transdukcja wyspecjalizowana (ograniczona)

Answer 31

• Udział biorą jedynie fagi lizogenne w których zachodzi faza integracji z chromosomem gospodarza
• Podczas wycięcia profag może zabrać część otaczającego chromosomu
• Fag transdukcji ograniczonej (wyspecjalizowana cząstka transdukcyjna, STP, ang. Specialized transducing particle) może utracić zdolność do replikacji
• Jednak zachowuje zdolność do wstrzyknięcia DNA do komórki biorcy – wycięty fragment zostanie wprowadzony do komórki biorcy, a co za tym idzie zwielokrotnienie lub zyskanie nowych funkcji przez komórki biorcy

Question 32

Genom bakteryjny składa się z

Answer 32

•	Sekwencje rdzeniowe 
o	o homogennej zawartości par G+C
o	Niewielka podatność na mutacje
o	Kodowanie czynników kluczowych dla komórki bakteryjnej
o	Geny typu house keeping 
•	Wyspy genomowe (GEI, genomic Island) 
o	Odcinki DNA różniące się od reszty chromosomu niosące pulę unikalnych informacji genetycznych, zakodowanych w zwartych blokach DNA
o	Kodujące cechy fenotypowe

Question 33

Wyspy genomowe

Answer 33

• W zależności od funkcji (cech kodujących w obrębie wysp genomowych) wyspy genomowe dzieli się na:
o Wyspy symbiotyczne (jak tworzyć symbiozę) – elementy metabolizmu, które są odpowiedzialne za cechy pozwalające na życie w symbiozie
o Wyspy metaboliczne – kodowane cechy metabolizmu
o Wyspy opornościowe – kodowane cechy związane z mechanizmami oporności
o Wyspy patogenności (PAI, pathogenicity Island)
 Zgrupowane w geny kodujące białka biorące udział w patogenezie (uzyskiwane najczęściej na drodze HGT)
 Integracja z chromosomem, upodabnianie się do genomu gospodarza,
 Im dłuższa integracja z chromosomem tym wyspy patogenności tracą swoją mobilność – utrata sekwencji insercyjnych po bokach wyspy patogenności (odpowiedzialne za integrację z genomem gospodarza)
 Kodują wiele czynników wirulencji
• Wyspy młode na końcach posiadają sekwencje insercyjne, które umożliwiają im poruszanie się, wyspy stare tracą te sekwencje co skutkuje utratą mobilności

Question 34

Cechy charakterystyczne wysp patogenności

Answer 34

• Duże jednostki genetyczne na chromosomie bakteryjnym
• Noszą jeden lub więcej genów wirulencji
• Obecne w szczepach patogennych, brak w szczepach niepatogennych
• Często są genetycznie niestabilne
• Obecność elementów genetycznych zaangażowanych w mobilność DNA
o Sekwencje powtórzone, integrazy, transpozazy, geny bakteriofagowe
• Skład sekwencji nukleotydowej ich DNA zwykle różni się od średniej dla całego chromosomu
• Miejsce insercji wysp patogenności często znajduje się w sąsiedztwie genów kodujących t-RNA
o Regiony t-RNA są regionami konserwatywnymi i niezmiennymi, które łatwo rozpoznać

Question 35

Wirulencja (zjadliwość)

Answer 35

produkcja określonych czynników wirulencji oraz procesy prowadzące do szkodliwości organizmu wyższego

Question 36

 Wirotyp to

Answer 36

w obrębie danego gatunku, to takie grupy drobnoustrojów posiadające dane czynniki wirulencji – różne wyspy patogenności

Question 37

 Serotyp to

Answer 37

odmiana w obrębie gatunku drobnoustroju (bakterii, wirusa) wyłoniona za pomocą metod serologicznych, wykazujących różnice w budowie antygenowej

Question 38

 Szczep to

Answer 38

populacja drobnoustrojów w obrębie gatunku lub odmiany, wyróżniająca się określonymi cechami

Question 39

 Izolat to

Answer 39

kultura patogena uzyskana z określonego miejsca, w określonym czasie i prowadzona lub przechowywana w laboratorium w celach doświadczalnych

Question 40

 Rybotyp to

Answer 40

odmiana w obrębie gatunku wyłoniona za pomocą rybotypowania, wykorzystującego informacje z analiz filogenetycznych opartych na rRNA

Question 41

 Genotyp to

Answer 41

zespół genów danego osobnika warunkujących jego właściwości dziedziczne

Question 42

poza genami wysp patogenności, za indukcję objawów chorobowych odpowiedzialne są również

Answer 42

o Geny plazmidowe
o Geny w obrębie wysepek patogenności (pathogenicity islet)
o Pojedyncze geny chromosomowe tzw. wysepki jednogenowe (singlet od single gene islet), które stanowią niezależne jednostki transkrypcyjne lub geny profagowe

Question 43

Ewolucja przez redukcję

Answer 43

Ewolucja genomów bakteryjnych poprzez utratę fragmentów chromosomu lub inaktywację niektórych genów
• Proces adaptacji do nowego środowiska lub selekcja korzystnej cechy
• Mechanizmy odpowiedzialne za powstawanie pseudogenów (rozprzestrzenianie sekwencji IS)

Question 44

Pangenomy bakteryjne

Answer 44

• Pangenom to cała pula genów danego gatunku
• Pangenom otwarty jest złożony z dwóch rodzajów genów
o Core genes (geny rdzeniowe) są to geny obecne we wszystkich szczepach danego gatunku (E. coli, S. pneumoniae)
o Dispensable genes- geny, które nie są niezbędne dla przeżycia danego gatunku i nie występują we wszystkich szczepach
• Pangenom zamknięty- charakteryzuje gatunki bakterii cechujące się dużą konserwatywnością genomów poszczególnych szczepów (B. anthracis, M. tuberculosis, Chlamydophila tracheomatis

Question 45

Cechy zwierzęcego modelu – aby można było na nim dobrze badać cechy wirulencji

Answer 45

• wrażliwość na działanie patogenu
• symptomy choroby u zwierzęcia modelowego powinny odzwierciedlać, te występujące u pierwotnego gospodarza (człowieka)
• powinna istnieć możliwość pomiaru wirulencji – trzeba sprawdzać czy zwierzę choruje, czy pojawiają się symptomy wskazujące na chorobę które można zbadać

np.
•	Helicobacter pyroli – fretki
•	gruźlica – świnki morskie
•	Haemophilus influenzae – szynszyle
•	trąd – pancernik

Question 46

Trzy zasady etyczne w badaniach na ludziach

Answer 46

• szacunek wobec obiektu badań
o informowanie o wszelkich podejmowanych działaniach, tak aby dana osoba wiedziała o efektach ubocznych i pożądanych
• badania wnoszą dużo do posiadanej wiedzy
o maksymalny zysk, minimalne szkody dla obiektu badanego
• sprawiedliwość
o rzetelne – losowo wybierana grupa placebo i grupa leczona

Question 47

Typy badań klinicznych

Answer 47

• badania prospektywne
o zakażenie/leczenie pacjenta następuje w czasie rzeczywistym
o mamy pacjenta który jest już zakażony i badamy to jak rozwija się infekcja, lub jak oddziałuje na zastosowane leczenie
• badania retrospektywne
o badania nad chorobami, które pojawiły się w przeszłości przypadkowo lub w sposób naturalny w celu uzyskania informacji na temat transmisji i postępów choroby u ludzi
o informacje z opisów kronikarzy, lekarzy, kart medycznych itp.

Question 48

Idealny model zwierzęcy do badań

Answer 48

• rozwój choroby o identycznych symptomach
• ta sama droga zakażenia
• tanie modele zwierzęce
• łatwe do hodowli
• łatwość modyfikacji genetycznych – w łatwy sposób można wprowadzać lub usuwać dane geny
• modyfikacje badań w zależności od cech organizmu modelowego

Question 49

zwierzęta gnotobiotyczne „GERM-FREE”

Answer 49

o wzrost w sterylnym środowisku - hodowla
o mają specyficzny układ immunologiczny – nie posiadają naturalnej mikroflory
o poród przez cesarskie cięcie – brak nadkażenia przez drobnoustroje z dróg rodnych matki
o bardzo drogie
o badania nad rozwojem odpowiedzi immunologicznej
o problem z komensalizmem – nie są w stanie przyswajać pokarmu

Question 50

• zwierzęta pozbawione specyficznych patogenów

Answer 50

o środowisko pozbawione specyficznych patogenów

o eliminacja odporności względem specyficznych patogenów

Question 51

Krzywa przeżywalności

Answer 51

• określa medianę czasu przeżywalności zwierząt po infekcji szczepem dzikim oraz mutantami o określonych cechach wirulencji
• wyniki są istotne statystycznie przy relatywnie małej liczbie zwierząt testowych – nawet poniżej 10 zwięrząt
• metoda ta może być łączona z obrazowaniem biofotonicznym
o szczepy bakteryjne używane do infekcji są modyfikowane operonem lucyferazy (luxABCDE) wprowadzonym do chromosomu

Question 52

Obrazowanie biofotoniczne

Answer 52

• bakterie świecą w ciemności
• na bieżąco sprawdza się postęp infekcji – w czasie rzeczywistym
• myszy są usypiane i prześwietlane bardzo czułą kamerą
• specjalne programy oszacowują ilość światła emitowanego przez bakterie

Question 53

• Dawka letalna (LD50) to

Answer 53

dawka powodująca śmierć (terminalną ostrą fazę infekcji) 50% badanych zwierząt

Question 54

• Dawka infekcyjna (ID50) to

Answer 54

dawka powodująca zakażenie 50% badanych zwierząt
o określa zdolność patogenu do kolonizacji organizmu gospodarza, ustalenia fazy infekcji i wywołania objawów chorobowych
o cfu w organach lub krwi, obrazowanie biofotoniczne, pocenie się, utrata motoryki

Question 55

Test kompetytywności - Competition assay

Answer 55

• pozwala określić indeks CI (competitive index)
• zwierzę jest infekowane mieszaniną szczepu zmutowanego i dzikiego
• CI to stosunek szczepu zmutowanego do dzikiego
• jeżeli CI=1 to mutacja nie ma wpływu na wirulencję badanego szczepu
• jeżeli CI˂1 to mutacja ma negatywny wpływ na poziom wirulencji szczepu
o szczepu dzikiego jest znacznie więcej niż mutantu
• jeżeli CI˃1 to mutacja zwiększyła poziom wirulencji szczepu
o mutanta jest znacznie więcej niż szczepu dzikiego
• mutant musi współzawodniczyć o nisze ze szczepem dzikim
• wady:
o słabo rosnące szczepy
o różnice są trudne do interpretacji
o wykluczenie biofotoniki – określanie stosunek jednej bakterii do drugiej, a nie sposób rozpowszechniania jej

Question 56

Hodowle tkankowe w analizie procesów wirulencji

Answer 56

• analog organizmu gospodarza – korzystna cecha, badamy konkretny organizm, który chcemy
• uzyskano wiele istotnych informacji dotyczących oddziaływania patogenów z komórkami eukariotycznymi

zalety:
• nie ma konieczności przeprowadzania testów na zwierzętach (aspekt etyczny)
• łatwość prowadzenia badań
• można prowadzić badania w warunkach ściśle zdefiniowanych
• łatwość badania np.: różnych etapów patogenezy bakteryjnej
• duża powtarzalność wyników – ale w przypadku gdy robi to jedna osoba (ten sam rodzaj pipetowania, popełniania błędów itp.)
• aspekty finansowe

wady:
• pochodne komórek nowotworowych mogą podlegać mutacjom – możliwe ciągłe zmiany cech
• uproszczony układ
• ekspresja genów w innym środowisku – trzeba dokładnie odwzorować medium w którym rosną komórki
• trudność w korelacji wyników
• problemy z wyborem linii komórkowej

Question 57

Test gentamycynowy

Answer 57

• hodowle tkankowe są bardzo często używane w celu identyfikacji czynników wirulencji zaangażowanych w adhezję i wnikanie do organizmu gospodarza przez patogeny wewnątrzkomórkowe
• test gentamycynowy (gentamicin protection assay) pozwala wykryć różnice pomiędzy szczepami dzikimi a mutantami defektywnymi w procesie adhezji lub wnikania
• gentamycyna – antybiotyk, nie przenika przez błony komórkowe

• W przypadku bakterii opornych na gentamycynę stosuje się inny antybiotyk lub bardzo duże stężenie gentamycyny

Question 58

Operony/regulony bakteryjne

Answer 58

• gdy występuje tylko jeden gen odpowiedzialny za cechę wirulencji (bardzo rzadkie zjawisko) – gen ten znajduje się pod regulacją określonych komórkowych regulatorów, które są sterowane przez określone białka regulatorowe, bądź enzymy
• gdy występuje operon (zbiór wspólnie transkrybowanych i regulowanych genów, położonych obok siebie w genomie; bardzo częste zjawisko) – operon jest regulowany przez sekwencje promotora (miejsce wiązania polimerazy RNA, katalizującej transkrypcję) oraz operatora (krótka sekwencja nukleotydów, znajdująca się tuż przed pierwszym genem struktury)
• gdy występuje regulon (najczęściej; zestaw operonów lub genów) - regulowane przez wspólny czynnik transkrypcyjny

Question 59

Geny reporterowe w analizie procesów wirulencji

Answer 59

• gen reporterowy służy badaniu innego genu np. badanie aktywności promotora przez poziom ekspresji genu kodującego β-galaktozydazę (lacZ u E. coli)
• mogą być też użyte do rozróżniania kolonii
• gen reporterowy jest łączony z sekwencją która ma być badana (potencjalne miejsca promotorowe, otwarte ramki odczytu)
o wzmacnianie lub inhibicja sekwencji badanej
• koduje białko, które może być wykryte bezpośrednio (np. emisja światła), lub jego aktywność jest rozpoznawana w wyniku reakcji enzymatycznej prowadzącej do powstania łatwo wykrywalnego produktu ( np. zmiana koloru)

Question 60

Białko GFP w badaniu patogenów

Answer 60

• wykazano, że ulega ekspresji i produkuje białko zielonej fluorescencji, teraz niekoniecznie zielonej – w zależności od długości białka można uzyskać barwę od zielonej poprzez żółtą do czerwonej
• jest najczęściej stosowanym genem reporterowym ze względu na bogatą paletę barw, stabilność i znikomą toksyczność
badanie poziomu aktywności promotorów in vivo – przyłączenie białka do promotora i sprawdzenie, czy zwiększyła się czy też nie intensywność produkcji białka
• monitorowanie losów bakterii patogennych na modelach zwierzęcych
• badanie w jakich przedziałach komórkowych komórek eukariotycznych znajduje się patogen
• badanie losów poszczególnych białek patogenu w komórkach eukariotycznych
• analiza czasu ekspresji genów wirulencji – czy od samego początku infekcji?
• analiza sekwencyjnej ekspresji genów wirulencji – w jakiej kolejności następuje ekspresja

Question 61

Metody w określaniu wirulencji patogenów

Answer 61

1. Mutageneza transpozonowa
2. Fuzje transkrypcyjne
3. Identyfikacja genów bakterii patogennych ulegających ekspresji in vivo
4. STM (Signature-tagged mutagenesis)
5. IVET (In vivo expresion technology)
6. RIVET (Recombinase- based IVET)
7. DFI (Differential fluorescence induction)

Question 62

Mutageneza transpozonowa

Answer 62

• Mutageneza to zarówno spontaniczny jak i wywołany przez mutageny proces powstawania zmian – mutacji w DNA
• elementy transpozycyjne (TE, ang. transposable elements) należą do grupy ruchomych elementów genetycznych
1. są zdolne do zmiany miejsca w genomie w wyniku transpozycji (typ rekombinacji nieuprawnionej, która nie wymaga homologii sekwencji nukleotydowych cząsteczek DNA uczestniczących w procesie i zależy od transpozazy kodowanej przez TE) – proces losowy
2. transpozony niosą geny warunkujące cechy fenotypowe
• mutageneza transpozonowa
1. losowa insercja transpozonów do genomu bakterii i poszukiwanie mutantów, które utraciły wirulencję
2. transpozony zawierają markery:
 geny repoterowe LacZ
 geny oporności na antybiotyki
 geny lux kodujące lucyferazę
3. otrzymuje się dużą pulę mutantów
4. transpozon jest jednocześnie markerem uszkodzonego genu - ułatwione klonowanie
5. ograniczenia metody:
 uszkodzenie sekwencje kończące transkrypcję
 uszkodzenie genów warunkujących wzrost – house keeping genes

Question 63

Fuzje transkrypcyjne

Answer 63

• analiza aktywności promotorów
• przy pomocy enzymów restrykcyjnych czy PCR tworzymy fuzję transkrypcyjną – łączymy gen reporterowy z fragmentem DNA potencjalnie zawierającym promotor, który chcemy badać
• gen reporterowy nie posiada promotora, ma sekwencję startu translacji i wiązania się z rybosomami
• mierząc poziom produktu genu reporterowego możemy określić siłę promotora czy jego zależność od konkretnych czynników środowiska

Question 64

Identyfikacja genów bakterii patogennych ulegających ekspresji in vivo

Answer 64

• ograniczeniem metody fuzji genów czy mutagenezy transpozonowej jest zaangażowanie w badania hodowli mikroorganizmów in vitro
• najlepsze warunki pozwalające określić ekspresję genów wirulencji są wewnątrz organizmu gospodarza
• dobór odpowiedniego zwierzęcia modelowego sprawia problemy

Question 65

STM (Signature-tagged mutagenesis)

Answer 65

• metoda pozwala na identyfikacje w jednym doświadczeniu genów potrzebnych do przeżycia w organizmie gospodarza
• oparta na negatywnej selekcji - identyfikuje geny wirulencji, których uszkodzenie uniemożliwia wzrost w organizmie gospodarza
• jest to mutageneza transpozonowa, w której występują różne transpozony (każdy ma swój znacznik)
• polega na analizie przeżywalności klonów in vitro i in vivo
• hybrydyzacja porównawcza (metoda cytogenetyczna polegająca na detekcji utraty lub amplifikacji regionów chromosomowych na poziomie prążka chromosomowego bez konieczności prowadzenia hodowli komórkowej. Polega ona na wyznakowaniu dwóch preparatów DNA (badanego i wzorcowego) różnymi fluorochromami i porównaniu natężenia fluorescencji w chromosomach danej pary)
o zmiana sygnału – brak mutanta lub jego zmiana
o jako sond do hybrydyzacji używa się znaczników z transpozonów – dlatego transpozony muszą mieć specyficzne fragmenty

Question 66

IVET (In vivo expresion technology)

Answer 66

• metoda pozytywnej selekcji-identyfikuje promotory (oraz ich aktywność) lub operony, które są aktywne tylko podczas infekcji w organizmie gospodarza
• kluczem tej metody jest konstrukcja systemu genów reporterowych
• poszukuje się genów warunkujących przeżycie komórki w organizmie gospodarza
• metoda polega na wyłapywaniu genów aktywnych przez cały czas infekcji
• manipuluje genetyczne prowadzi się w E. coli z lacZ (genom auksotroficzny)
• natomiast gotowy konstrukt na plazmidzie wstawia się do Salmonella
 
• budowa plazmidu do IVET – pIVET
• X’ - fragment DNA zawierający potencjalne promotory umożliwiające ekspresję purA
• Za X’ znajduje się miejsce cięcia dla enzymu restrykcyjnego przed genem selekcyjnym
• gen selekcyjny bez promotora (promotorless genes) – zazwyczaj purA, mutanty nie urosną in vivo ale in vitro z dodatkiem puryn już tak
• Bezpromotorowy gen oporności (reporter genes) – zwierzęta karmione antybiotykami
• Drugi gen reporterowy bez promotora przed genem selekcyjnym aby odróżnić mutanty które przeżyły w organizmie
• Gen oporności z własnym promotorem aby znaleźć mutanty z wbudowanym konstruktem (antibiotic resistance gene

Question 67

RIVET (Recombinase- based IVET)

Answer 67

• modyfikacja metody IVET
• gen TnpR, kodujący resolwazę – enzym umożliwiający wycięcie fragmentu między konkretnymi miejscami
• metoda czuła, która wychwytuje geny słabiej lub tylko chwilowo ulegające ekspresji
• jeśli in vivo promotor jest czynny dochodzi do transkrypcji resolwazy, która wycina gen oporności na tetracyklinę/kanamycynę (pojawia się wrażliwość)
• kiedy promotor jest nieczynny, resolwazy brak i hodowla jest oporna

Question 68

DFI (Differential fluorescence induction)

Answer 68

• połączenie zastosowania genu GFP z cytometrią przepływową (FACS – fluorescent activated cell sorting)
• pozwala na identyfikowanie genów bakterii patogennych, które ulegają ekspresji w danym środowisku (zarówno in vivo i in vitro)
• badanie np. poziomu ekspresji w komórkach makrofagów
• pierwszym etapem jest przygotowanie biblioteki przy użyciu mutagenezy transpozonowej z wykorzystaniem genu gfp, oraz następnie infekcja ta biblioteką komórek makrofagów
• kolejny etap to zastosowanie cytometrii przepływowej (oddzielenie komórek w których gen reporterowy uległ ekspresji)
• w drugim etapie sortowania hodujemy bakterie in vitro (wykluczenie komórek, w których promotor jest aktywny in vitro)
• zyskujemy pule komórek posiadających promotor aktywny in vivo
• GFP- białko zielonej fluorescencji
• Bierzemy te, które nie świecą, zakażamy drugi raz makrofagi→ te które świecą ulegają ekspresji tylko in vivo.

Question 69

Metody genomowe w identyfikacji czynników wirulencji

Answer 69

1. GSH (Genomic substractive hybridization)
2. SCOTS (Selective capture of transcribed sequences)
3. IVIAT (In vivo - induced antygen technology)
4. Mikromacierze (microarrays)

Question 70

GSH (Genomic substractive hybridization)

Answer 70

• izolacja sekwencji genomowego DNA specyficznego dla poszczególnych szczepów blisko spokrewnionych bakterii z zastosowaniem metody PCR
• identyfikuje geny obecne tylko u patogennych lub niepatogennych szczepów
• DNA genomowe po izolacji od gospodarza jest cięte enzymami restrykcyjnymi
• końce są ligowane linkerami lub primerami adaptorowymi
• DNA szczepów niepatogennych jest znakowane biotyną
• pule fragmentów DNA są mieszane i denaturowane
• następnie hybrydyzacja fragmentów komplementarnych
• do mieszaniny dodawane jest złoże streptawidynowe (wiązanie fragmentów zawierających DNA niepatogennego szczepu)
• w przypadku fragmentów patogennego szczepu, których nie ma u szczepu niepatogennego hybrydyzacja nie nastąpi i fragmenty nie zostaną związane ze streptawidyną
• następuje kilka rund reakcji hybrydyzacji i otrzymane fragmenty będą unikalne dla szczepu patogennego
• amplifikacja w reakcji PCR, klonowanie i sekwencjonowanie

Question 71

SCOTS (Selective capture of transcribed sequences)

Answer 71

• metoda oparta na RT-PCR (riverse transcriptase – badamy RNA) często łączona z GSH
• identyfikuje geny transkrybowane tylko w warunkach in vivo lub in culturo
• porównujemy dwie pule mRNA (pule mRNA powstającą w szczepach niewirulentnych z pulą mRNA pochodząca ze szczepów wirulentnych)
• mRNA przepisywane jest przy pomocy odwrotnej transkryptazy na cDNA
• amplifikacja cDNA
• jedno cDNA znakowane jest przy pomocy biotyny
• denaturacja obu puli cDNA i hybrydyzacja
• jeśli któreś z genów ulegały ekspresji in vivo, a nie ulegały in vitro to nie będą ulegały hybrydyzacji
• klonowanie do plazmidów i sekwencjonowanie

Question 72

IVIAT (In vivo - induced antygen technology)

Answer 72

• metoda oparta o analizę genomu za pomocą przeciwciał bez udziału zwierząt laboratoryjnych
• w metodzie wykorzystywane są pule surowicy pobranej od pacjentów, którzy mieli kontakt z patogenem i posiadają odporność względem niego
• bakterie hodowane w warunkach in vitro łączą się z przeciwciałami, a w puli surowicy pozostają tylko te które są specyficzne dla czynników wirulencji ekspresjonowanych in vivo
• przeszukiwanie bibliotek genomowych

Question 73

Mikromacierze (microarrays)

Answer 73

• mikromacierze DNA (chipy DNA) są zbiorem sond molekularnych związanych ze stałym podłożem w ściśle określonym porządku
• sondy stanowią dwuwymiarowy układ mikroskopijnych miejsc, z określonymi sekwencjami kwasu nukleinowego
• z badanego szczepu izolujemy DNA, tniemy je i oznaczamy odpowiednimi barwnikami – jeśli dojdzie do hybrydyzacji sondy z materiałem badanym to dołek zaczyna świecić
• technologia ta pozwala na wykrywanie tysięcy cząsteczek kwasów nukleinowych, dzięki możliwości przeprowadzenia wielu eksperymentów hybrydyzacji w jednym czasie

Question 74

• czynniki wirulencji - są molekułami produkowanymi lub strategiami wykazywanymi przez patogenne bakterie w celu umożliwienia

Answer 74

o adhezji i kolonizacji
o przeżycia lub uniknięcia odpowiedzi układu immunologicznego
o inwazji i rozprzestrzeniania się w
o zdobycia związków odżywczych i wzrostu
o uwolnienia i rozprzestrzeniania na innych żywicieli

Question 75

Cechy umożliwiające przeżycie patogenu w organizmie gospodarza

Answer 75

• zdolność do adhezji do komórek gospodarza w celu kolonizacji – adhezja to pierwszy kontakt z komórka gospodarza, dlatego jest to kluczowy proces
• uniknięcie odpowiedzi układu immunologicznego gospodarza zarówno wrodzonej jak i nabytej odpowiedzi
• zdobycie żelaza oraz innych związków odżywczych w celu umożliwienia rozmnazania – czynnik wirulencji w gospodarzu np. toksyna niszcząca erytrocyt lub siderofor
• rozprzestrzenienie się w gospodarzu jak i w populacji (cecha umożliwiająca przeżycie gatunku) – zależne od rodzaju infekcji jak i samego patogenu (im młodszy patogen tym bardziej zjadliwy)
• zdolność do wywołania symptomów chorobowych - niektóre symptomy mogą przyczyniać się do rozwoju infekcji

Question 76

Strategie przeżywania w środowisku zewnętrznym

Answer 76

• bakterie z rodzaju Clostridium i Bacillus produkują endospory
• odporność na wysychanie Enterococcus i Staphylococcus (dzieje się tak dzięki ograniczeniu utleniania białek i denaturacji DNA podczas wysychania)
• stan ograniczenia aktywności metabolicznej lub przejście w stan uśpienia (komórki persisters – brak aktywności metabolicznej, gwarantują przeżycie gatunku)
• zakażanie innych żywicieli – powstawanie żywicieli pośrednich, np. B. burgdorferii przenoszona przez kleszcze
• produkcji wtórych metabolitów np. bakteriocyny
• zmiana struktury osłon komórkowych (systemy pomp wyrzutowych)
• zdolność do zdobywania i metabolizowania czynników odżywczych dostępnych w ograniczonych ilościach

Question 77

PAMPs (pathogen-associated moleculer patterns)

Answer 77

•	nie występują u gospodarza
•	maja istotne znaczenie dla patogenu
•	charakteryzują duże grupy patogenów
o	lipopolisacharydy
o	peptydoglikany
o	kwasy tejchojowe
o	mannany
o	bakteryjne DNA
o	dwuniciowe RNA
o	niemetylowane sekwencje CpG

Question 78

PRRs (pattern recognition receptors)

Answer 78

• umożliwiają identyfikację patogenu przez układ immunologiczny gospodarza
• obecne na lub w komórkach odporności wrodzonej
• klasyfikacja rodzin receptorów
o TLRs rozpoznają bakterie, wirusy, grzyby i pierwotniaki
o NLRs rozpoznają tylko bakterie
o RLRs rozpoznają wirusy
• rozpoznają elementy budowy mikroorganizmów często określane jako PAMPs
• występują konstytutywnie na komórkach układu immunologicznego i rozpoznają PAMPs bez względu na fazę cyklu komórkowego patogenów

Question 79

Biofilm

Answer 79

• ustrukturyzowana społeczność komórek bakteryjnych unieruchomionych w biopolimerowej macierzy zewnątrzkomórkowej wytwarzanej przez te komórki
• na trwałe przytwierdzony do podłoża, na którym wzrasta (materia nieożywiona, tkanki organizmu)
• występowanie w formie biofilmu pozwala bakteriom
o na zasiedlanie różnych nisz ekologicznych – jedna z metod adhezji zapewniająca przeżycie w organizmie gospodarza jak i w środowisku zewnętrznym
o przetrwać w niesprzyjających dla pojedynczych komórek warunkach
• Zalety formy biofilmowej
o oporność na działanie antybiotyków oraz środków dezynfekujących
o ochrona przed atakami pierwotniaków
o ochrona przed fagocytozą w organizmie gospodarza – matrix złożony głównie z cukrów, przez co układ odpornościowy rozpoznaje to jako uwodniony cukier (brak widocznych bakterii)

Question 80

Strategie zdobywania żelaza

Answer 80

• Żelazo niezbędne do funkcjonowania organizmów bakteryjnych
• Borrelia burgdoferi wykorzystuje mangan zamiast żelaza
• żelazo w organizmie gospodarza:
o laktoferyna (białko sekrecyjne chelatujace jony żelaza)
o transferyna (białko surowicy odpowiedzialne za transport żelaza, produkowane w wątrobie)
o ferrytyna (utrzymuje żelazo w dostępnej i nieszkodliwej formie)
o hem (~70% żelaza w organizmie ludzkim występuje w formie hemoglobiny)
• Siderofory u bakterii
o to niskocząsteczkowe związki o wysokim powinowactwie do jonów żelaza
o należą do dwóch klas chemicznych
 katechole
 hydroksamaty
o bakterie posiadające receptory dla sideroforów produkowanych przez inne gatunki – synergizm w rozwoju koinfekcji – proces energozależny
• Mechanizmy zdobywania żelaza przez bakterie
o żelazo wykorzystywane przez komórki w gospodarza, bakterii, w cząsteczce hemoglobiny – drugi stopień utlenienia
o żelazo przenoszone – trzeci stopień utlenienia
o siderofory przechwytują tylko żelazo na trzecim stopniu utlenienia
o aby wychwycić żelazo na drugim stopniu utlenienia bakterie produkują hemolizyny
• Strategie zdobywania żelaza
o przykłady sideroforów
 enterobaktyna - E. coli
o mutacje w genach kodujących siderofory nie zawsze powodują spadek wirulencji szczepu
o produkcja proteaz rozkładających transferyne lub laktoferyne
o zdobywanie żelaza bezpośrednio z hemoglobiny przez S. aureus
o produkcja hemolizyn (cytolizyn)

Question 81

Toksyny bakteryjne są

Answer 81

produktem procesów metabolicznych, który po kontakcie z tkankami gospodarza zaburza ich metabolizm, ze szkodliwym skutkiem dla organizmu

• w wielu przypadkach geny kodujące toksyny nie znajdują się normalnie w chromosomach bakteryjnych
• większość toksyn zakodowanych jest na elementach pozachromosomalnych (PAI, plazmidy)
• w rozprzestrzenianiu się genów kodujących toksyny oraz w ewolucji bakterii patogennych kluczową role odgrywa horyzontalny transfer genów (HGT)

Question 82

Rola toksyn bakteryjnych

Answer 82

• rozmnażanie i ewolucja patogenów
o ochrona przed wpływem układu immunologicznego
o zdobywanie czynników odżywczych dla drobnoustroju
• aspekt użytkowy toksyn (szczególnie tych nieniszczących)
o leczenie zeza
o wspomaganie w terapii porażenia mózgowego
o biologiczna regulacja szkodników upraw roślin (Bt toxin)
o zwalczanie plagi komarów
• prawdopodobna rola w
o fizjologii bakterii i ich wirusów
o regulacji komórkowej patogenów
o funkcjonowaniu fagów
o sygnalizacja pomiędzy komórkami

Question 83

Endotoksyny

Answer 83

są zintegrowane z komórką bakteryjną i uwalniane w momencie lizy komórki

Question 84

egzotoksyny

Answer 84

• Egzotoksyny to białka, które są wydzielane do środowiska zewnętrznego
o niektóre toksyny są akumulowane wewnątrz komórki i uwalnianie w trakcie lizy
o toksyny wstrzykiwane bezpośrednio do komórek żywiciela to białka efektorowe lub egzoenzymy

Question 85

Podział toksyn - nomenklatura w zależności od:

Answer 85

• komórek/narządów, które są atakowane (cytotoksyny, neurotoksyny, hepatotoksyny, werotoksyny)
• produkujących je bakterii lub wywoływanych przez nie chorób (toksyna Shiga, toksyna cholery, toksyna błonicza)
• aktywności enzymatycznej toksyny (cyklaza adenylowa, lecytynaza)
• właściwości biochemicznych (HLT/HST)
• mechanizmu działania

Question 86

Podział toksyn białkowych

Answer 86

•	Toksyny I typu
o	wiążą się z komórką docelową, ale nie wnikają do wnętrza, działają zewnątrzkomórkowo
o	superantygen (SAg)
•	Toksyny II typu
o	działają na błony cytoplazmatyczne komórek eukariotycznych
o	fosfolipazy, cytotoksyny tworzące pory
•	Toksyny III typu
o	klasyczne A-B toksyny

Question 87

Lipopolisacharyd (LPS)

Answer 87

Toksyny niebiałkowe
• integralny składnik błony zewnętrznej bakterii Gram-ujemnych
• niezbędny do funkcjonowania drobnoustroju (ochrona przed obronnymi mechanizmami makroorganizmu oraz działaniem kwasów żółciowych i hydrofobowych antybiotyków)
• LPS składa się z trzech regionów różniących się budową chemiczną, właściwościami biologicznymi oraz zmiennością strukturalną
• struktura lipidu A odzwierciedla jego swoistą rolę w aktywności biologicznej LPS, stanowiąc centrum toksyczności tej makrocząsteczki
o im bardziej niesymetryczne kwasy tłuszczowe w lipidzie A tym bardziej LPS jest toksyczny
o jeśli jest nie parzysta liczba łańcuchów w lipidzie A, tym LPS jest bardziej toksyczny
• lipid A uwalnia się w czasie rozpadu komórki bakteryjnej

Question 88

Sepsa

Answer 88

• sepsa jest określeniem zespołu klinicznego, który stanowi powikłanie ciężkiego zakażenia ogólnoustrojowego i charakteryzuje się ogólnoustrojową reakcją zapalną z towarzyszącym uszkodzeniem wielu tkanek i narządów (nadmierna reakcja układu odpornościowego gospodarza)
• stymulacja leukocytów oraz komórek śródbłonka
• uwolnieniem cytokin i czynników zapalnych:
o interleukiny (IL-I, -6, -8 -10)
o czynnik martwicy nowotworu (TNF-α)
o produkty metabolizmu kwasu arachidonowego (prostaglandyny, leukotrieny)
o czynnik aktywujący płytki krwi
o wolne rodniki tlenowe
o nadtlenek wodoru
o tlenek azotu
• uwolnione gwałtownie czynniki w stanach uogólnionego zakażenia bakteriami Gram-ujemnymi mogą powodować uszkodzenie tkanek nieobjętych infekcja
• ich zwiększona sekrecja powoduje:
o wysoką gorączkę
o hipotensję
o tachykardię
o przyspieszony oddech
o a w ciężkich przypadkach prowadzi to do:
 wewnątrznaczyniowe wykrzepianie krwi -> powstawanie skrzepów -> niszczenie tkanek
 wstrząs septyczny -> śmierć
• Postaci sepsy
1. SIRS (zespół ogólnoustrojowej reakcji zapalnej)
2. sepsa (posocznica)
3. ciężka sepsa
4. MODS (zespół niewydolności wielonarządowej)
5. wstrząs septyczny
6. zespół septyczny

Question 89

• struktury bakteryjne wpływające na aktywacje czynników transkrypcyjnych kontrolujących ekspresje genów odpowiedzi immunologicznej (uwalniane podczas lizy komórki bakteryjnej):

Answer 89

o LPS,
o kwas tejchojowy,
o flagelina,
o fragmenty bakteryjnego DNA

Question 90

Toksyny mikolaktonowe

Answer 90

• Mycobacterium ulcerans jest przyczyną martwiczych, skórnych zmian chorobowych, zwanych owrzodzeniem Buruli
• Egzotoksyna zwana mikolaktonem, wykazująca właściwości cytotoksyczne i immunosupresorowe

Question 91

Pęcherzyki błonowe

Answer 91

• powstają w procesie naturalnej sekrecji u bakterii Gram-ujemnych
• pęcherzyki błonowe formują się, gdy błona zewnętrzna wraz z peryplazmą „odpączkowuje”
• postuluje się, iż zwiększona produkcja pęcherzyków następuje w odpowiedzi na stres, np. obecność związków chemicznych wpływających negatywnie na komórkę, podwyższona temperatura
• pęcherzyki zawierają cały szereg czynników wirulencji (funkcja w transporcie do komórek eukariotycznych i prokariotycznych)
• pęcherzyki zwierają PAMPsy (pathogen-associated molecular patterns), a także białka, enzymy i inne determinanty patogenności

Question 92

Superantygeny (SAg)

Answer 92

• grupa strukturalnie i funkcjonalnie spokrewnionych toksyn
• do superantygenów zalicza się:
o toksynę wstrząsu toksycznego I (TSST-I)
o enterotoksyny gronkowcowe
o eksfoliatyny: ETA i ETB
• SAg wiążą się bezpośrednio z MHCII na powierzchni makrofagów oraz z TCR na powierzchni limfocytów T
• stymulacja 1 na 5 limfocytów T zamiast 1 na 10000
• reakcja gwałtowna i bardzo silna
• może prowadzić do uszkodzenia organów i śmierci

Question 93

Toksyny uszkadzające błonę komórkową

Answer 93

• podwójna rola tych toksyn
o zabicie komórki gospodarza (w szczególności fagocytów – bakteria niszczy fagosom i uwalnia się lub rozpad endosomu)
o ucieczka z fagosomu i wniknięcie do wnętrza komórki gospodarza przed utworzeniem fagolizosomu
• typy toksyn uszkadzających błony
o białka tworzące poryny (PFTs, PFO, RTX)
o enzymy uszkadzające strukturę błony

Question 94

Białka tworzące poryny

Answer 94

• Toksyny tworzące pory (PFTs)
o mechanizm ich działania opiera się o różnice w ciśnieniu osmotycznym wewnątrz komórki i na zewnątrz
o podział PFTs na α-toksyny i β-toksyny
o tworzą bardzo małe pory
• Toksyny zależne od cholesterolu (PFO)
o tworzą pory o dużej średnicy wewnętrznej
o monomery składają się z pojedynczego łańcucha białkowego o długości ok 300-400 aminokwasów
o aktywność zależy tylko od ilości cholesterolu
o Clostridium perfringens (perfringolizyna)
o Streptococcus pyogenes (streptolizyna)
• Toksyny z grupy RTX (repeats in toxin)
o produkowane przez bakterie Gram-ujemne i wydzielane na zewnątrz za pomocą I systemu sekrecji
o charakteryzują się obecnością konserwatywnej struktury C-końca białka, zawierającej kasetę powtórzeń bogatych w glicyny
 domena ta wbudowuje się w błonę tworząc kanał częstokroć stabilizowany przez jony wapnia

Question 95

Enzymy uszkadzające błonę

Answer 95

• zaburzenie integralności błony fosfolipidowej
• zróżnicowane nazewnictwo (cytolizyny, hemolizyny, fosfolizyny)
• fosfolipaza (PL) produkowana zarówno przez eukarioty jak i prokarioty
• wykazują swoistość wobec rozpoznawanego substratu jak i swoistość hydrolizowanego wiązania

Question 96

Toksyny A-B

Answer 96

• składają się z dwóch podjednostek
o podjednostka A - o aktywności enzymatycznej
o podjednostka B - odpowiadająca za rozpoznawanie receptorów na komórkach docelowych oraz przenikanie podjednostki A do wnętrza komórki żywiciela
• podział toksyn typu A-B
o toksyny proste - syntetyzowane w postaci pojedynczego łańcucha polipeptydowego podlegającego obróbce proteolitycznej (np. toksyna błonicza, tężcowa i botulinowa)
o toksyny złożone - zbudowane z jednej podjednostki A i pięciu podjednostek B (toksyna cholery, toksyna czerwonki)
• podjednostki A i B są odseparowane podczas obróbki proteolitycznej, ale pozostają połączone mostkami dwusiarczkowymi
o wewnątrz komórki gospodarza następuje rozerwanie wiązań i uwolnienie podjednostek - jest to niezbędne dla dalszej aktywności enzymatycznej podjednostki A

Question 97

Bakteryjne systemy sekrecji a wirulencja

Answer 97

• bakterie wykształciły systemy sekrecji do specyficznego transportu czynników wirulencji na powierzchnię komórki, do środowiska zewnętrznego lub bezpośrednio do wnętrza komórek gospodarza
• sekrecji podlegają: adhezyny, toksyny, egzoenzymy, proteazy, inne czynniki wirulencji
• systemy sekrecji bakterii gram-dodatnich i gram-ujemnych różnią się – ze względu na różnicę w budowie ściany komórkowej

Question 98

• sekrecja - jest to

Answer 98

proces aktywnego transportu przez wszystkie błony (osłony) bakteryjne

Question 99

• translokacja - to

Answer 99

pokonanie błony przez bakteryjne białka efektorowe

Question 100

• eksport – to

Answer 100

transport przez błony cytoplazmatyczną (Gram-dodatnie - na zewnątrz, Gram-ujemne - przestrzeń peryplazmatyczna)

Question 101

System Sec (general secretory system)

Answer 101

• transport potranslacyjny/ kotranslacyjny niezwiniętych białek poprzez kompleks - translokazę Sec
• sekwencja sygnałowa (liderowa) na N-końcu transportowanego białka
• bakterie gram-dodatnie - białka uwalniane są do błony lub do środowiska
• bakterie gram-ujemne - białka pozostają w przestrzeni peryplazmatycznej lub są transportowane przez kolejne systemy
• 3 drogi transportu niezwiniętych białek
  a. białko jest kierowane do Sec translokazy potranslacyjnie rozpoznawanie sekwencji sygnałowej przez SecA lub za pośrednictwem SecB o właściwościach chaperonowych zapobiegających zwijaniu białka
  b. niektóre białka błonowe i prebiałka są kierowane kotranslacyjnie (związane z rybosomem)Sekwencja sygnałowa jest rozpoznawana przez SRP (ribosome-bound signal regognition particle) i kierowana do receptora FtsY (receptor dla SRP odpowiedzialny również za hydrolizę GTP)
  c. potranslacyjnie niektóre białka błonowe wbudowywane są za pośrednictwem YidC

Question 102

Accesory Sec System

Answer 102

•	Streptococcus, Listeria, Mycobakterium
•	składa się z 2 białek SecA:
o	SecAI białko spokrewnione z SecA
o	SecA2 część systemu pobocznego
•	homologiem SecY jest SecY2
•	dodatkowo występują białka poboczne Asp1 – Asp5

Question 103

System TAT (Twin- argininę transport system)

Answer 103

• system wyspecjalizowany w transportowaniu białek w pełni zwiniętych
• niektóre białka transportowane poprzez system TAT posiadają kofaktory
• białka posiadają sekwencje sygnałową na N- końcu (polarny N- koniec o zróżnicowanej długości; motyw SRRXFLM, region hydrofobowy zbudowany z 12-20 aa kwasowych, czasami kilkoma zasadowymi aa),
• sekwencja sygnałowa rozpoznawana jest przez białko TatBC które rozpoczyna proces zmian konformacyjnych (białko TatBC łączy się z białkiem TatA) prowadzących do utworzenia kanału
• transport z energią pochodzącej z siły protono-motorycznej

Question 104

SYSTEMY SEKRECJI SPECYFICZNE DLA BAKTERII GRAM-UJEMNYCH

Systemy sekrecji zależne od systemu Sec (General secretory pathway)

Answer 104

T2SS – II system sekrecji
T5SS – V system sekrecji
System chaperon/usher
fimbrie agregacyjne

Question 105

T2SS – II system sekrecji

Answer 105

• system transportujący białka z peryplazmy na zewnątrz komórki
• składa się 12-14 białek
• aparat białkowy system przypomina system biorący udział w biogenezie pili typu IV, składanie faga filamentowego i kompetencyjny aparat do pobierania DNA
np. System pul – transport enzymu pullulanaza wytwarzany przez Klebsiella oxytoca

Question 106

T5SS – V system sekrecji

Answer 106

• Transportowane w ten sposób białka zewnątrzkomórkowe (autotransportery) nie wymagające aktywności białek pomocniczych do wydostania się z peryplazmy
o proteaza IgA N. gonorrhoeacea, E. coli
• prebiałko syntetyzowane jest jako pojedynczy prekursor złożony z kilku domen (α, β, γ oraz proteaza) oraz N-końcowej sekwencji sygnałowej dla transportera Sec
• Podział na 3 grupy:
o Va - białko zostaje związane z błoną lub wystaje na zewnątrz
o Vb - białko zostaje uwolnione na zewnątrz – białko wolne
o Vc – na stałe połączone z błoną, tworzą się adhezyny z rodziny Oca

Question 107

System chaperon/usher

Answer 107

• Chaperon – białko opiekuńcze
• Usher – białko przepuszczające
• Chaperon dostarcza podjednostki a usher przepuszcza i pozwala na syntezę fimbrie Pap i Fim od dołu

Question 108

fimbrie agregacyjne

Answer 108

• Po transporcie białek zwiniętych z peryplazmy na zewnątrz następuje dobudowanie
• są bardzo długie,
• jest ich dużo,
• bakterie dzięki nim agregują,
• podjednostki są transportowane i białka mogą być dobudowywane od góry,

Question 109

SYSTEMY SEKRECJI SPECYFICZNE DLA BAKTERII GRAM-UJEMNYCH

Systemy sekrecji niezależne od Sec

Answer 109

T1SS – I system sekrecji
T3SS – III system sekrecji
T4SS – IV system sekrecji
T6SS

Question 110

T1SS – I system sekrecji

Answer 110

• system zbudowany z kompleksu 3 białek,
• białko zlokalizowane w błonie cytoplazmatycznej, to ABC transporter (ATP-binding-casstee) – białko czerpie energię z hydrolizy ATP
• transportowane białka mają sekwencje sygnałową na C-końcu (≈50 aa) o charakterze amfipatycznym (zarówno hydrofilowy i hydrofobowy charakter) bogatą w glicyny (powtórzony motyw GGXGXD)

Question 111

T3SS – III system sekrecji

Answer 111

• jednoetapowy transport substratów bezpośrednio do komórki gospodarza (transport białek efektorowych)
• powstał w procesie ewolucji w wyniku przekształcenia genów biorących udział w biogenezie rzęsek
• geny kodujące aparat sekrecyjny zlokalizowane na PAIs
• przenoszenie białek o strukturze monomerów
• w komórkach jednego gatunku bakterii może funkcjonować kilka typów T3SS w zależności od transportowanego białka
• białka efektorowe transportowane poprzez ten system zawierają kilka modułów:
o N-końcowy fragment sygnalny
o fragment wiążący białko opiekuńcze
o domena efektorowa
• aparat sekrecyjny T3SS nazywany jest molekularną strzykawką.

Question 112

T4SS – IV system sekrecji

Answer 112

• jednoetapowy transport substratów bezpośrednio do komórki gospodarza,
• podobieństwo do systemu budującego pilusy koniugacyjne
• energia do transportu pochodzi z rozpadu ATP
• transport białek (monomerów i oligomerów) nukleoprotein, fragmentów rozpadu peptydoglikanu,

Question 113

T6SS

Answer 113

• konserwatywny system u wielu gram ujemnych,
• białka systemu zakodowane są na PAIs,
• sekrecja czynników wirulencji zależna jest od ATP,
• system o homologii do białek bakteriofagowych

Question 114

SYSTEMY SEKRECJI SPECYFICZNE DLA BAKTERII GRAM-DODATNICH

Answer 114

CMT (cytolysin- mediated translocation)
ExPortal
T7SS

Question 115

CMT (cytolysin- mediated translocation)

Answer 115

mechanizm dzięki któremu białka efektorowe są transportowane za pomocą systemu Sec i dostarczane bezpośrednio do komórki gospodarza poprzez porynę uformowaną w błonie cytoplazmatycznej (CDC=PFO)

Question 116

ExPortal

Answer 116

• system Sec zlokalizowany w specyficznej mikrodomenie błonowej,
• proponuje się aby uważany był za organelle koordynujące interakcje pomiędzy wydzielanymi białkami a systemem chaperonów związanych z błoną,
• umożliwienie zwijania się białek na zewnątrz komórki,
• lokalizacja ExPortali w pobliżu miejsca podziału komórki

Question 117

T7SS

Answer 117

• scharakteryzowany u Mycobacterium – powierzchnia komórki woskowata
• jedna cześć w błonie cytoplazmatycznej i druga prawdopodobnie w mykomembranie (zbudowana z lipidów)
• niezależne od systemu Sec

Question 118

Rola mutacji w regulacji na poziomie materiału genetycznego

Answer 118

• spontaniczne mutacje (SNPs single-nucleotide polymorphism)
• insercje oraz delecje (indels)
• w warunkach stresowych pojawia się w populacji frakcja komórek charakteryzujących się większą częstością mutacji (hypermutable fraction)
o cel ewolucyjny – większa szansa na pojawienie się mutacji, która będzie korzystna
• indukcja polimeraz DNA o niskiej wierności (error-prone)

Question 119

Rearanżacje genomowe

Answer 119

• źródło plastyczności genomu bakteryjnego
• analiza genomów bakteryjnych wykazała obecność dużej liczby obszernych, nielosowo rozpowszechnionych sekwencji powtórzonych, które mogą służyć jako miejsca rekombinacji
• rola duplikacji i amplifikacji w oporności na antybiotyki (zwiększona produkcja enzymów, molekuł docelowych lub pomp wyrzutowych)
• duplikacja (poprzez rekombinację homologiczną) i amplifikacja zwiększające liczbę kopii genu oporności
• zmiany w miejscach regulatorowych chromosomu
• zwiększone prawdopodobieństwo powstania mechanizmów oporności o lepszej efektywności

Question 120

Zmienność fazowa

Answer 120

• proces adaptacyjny, w którym komórki bakteryjne przechodzą częste i odwracalne zmian fenotypu
• efektem jest niejednolity skład populacji
• zjawisko jest odwracalne (nie doprowadza do nagromadzenia zmian potencjalnie szkodliwych dla komórki) i dotyczy konkretnych genów (mimo, że jest to proces przypadkowy)
• główne mechanizmy warunkujące zmienność fazową:
o rekombinacja zlokalizowana
o pomyłki w replikacji DNA
o metylacja sekwencji GATC

Question 121

Rekombinacja zlokalizowana

Answer 121

• np. rzęski Salmonella
• komórki Salmonella występują w dwu różnych stanach aglutynacyjnych flagelina H1 – FliC lub H2 – FljB
• następuje rekombinacja zlokalizowana (udział rekombinazy Hin oraz kompleksu białkowego zwanego inwertasomem)

Question 122

Pomyłki w replikacji DNA

• slipped-strand misrepair

Answer 122

• dotyczy genów zawierających w regionach promotorowych lub rejonach 5’ sekwencje powtórzone
• ich obecność skutkuje poślizgiem polimerazy w trakcie replikacji, co wpływa na dodawanie lub usuwanie powtórzeń
• tego typu zmiany zaburzają procesy transkrypcji i translacji, niejednokrotnie prowadząc do braku funkcjonalnego białka (zmiana ramki odczytu, wypadanie kodonu „start”) lub zmiany poziomu jego transkrypcji
• w efekcie otrzymujemy bakterie o różnym fenotypie

Question 123

Metylacja sekwencji GATC

Answer 123

• np. fimbrie typu Pap u uropatogennych szczepów E. coli
• proces epigenetyczny (nie powoduje zmian w sekwencji nukleotydowej, a jedynie zmiany fenotypowe)
• czynniki środowiska wpływające na wytwarzanie tych organelli adhezyjnych to temperatura 37°C oraz osmolarność
• nawet w optymalnych warunkach populacja drobnoustrojów zawiera komórki zawierające fimbrie, jak i takie, które nie mają tych struktur
• zmienność fazowa ekspresji operonu pap w temperaturze 37°C, regulowana na poziomie transkrypcji, jest uzależniona od metylacji dwu sekwencji GATC (I i II)
• w zależności od tego, która sekwencja GATC jest zmetylowana dochodzi (bądź też nie) do ekspresji operonu pap i biogenezy fimbrii adhezyjnych

Question 124

Zmienność antygenowa

Answer 124

• proces trudny do odwrócenia
• umożliwia ucieczkę przed mechanizmami obronnymi gospodarza
• umożliwia kolonizację różnych środowisk
• to zmiany fenotypowe warunkujące ogromną różnorodność fenotypową i zmienność populacji bakteryjnej
• procesy skutkujące zmianami sekwencji aminokwasowych w białkach powierzchniowych o charakterze antygenów
• strategia ta umożliwia patogenom uniknięcie rozpoznania przez komórki układu immunologicznego
• mechanizmy warunkujące ten proces:
o rearanżacje genomu na drodze rekombinacji pomiędzy wieloma kopiami tego samego genu w chromosomie
o rearanżacje genomu na drodze rekombinacji pomiędzy powtarzającymi się sekwencjami nukleotydowymi w obrębie konkretnego genu

Question 125

Skutki zmienności antygenowej i fazowej

Answer 125

• różne objawy infekcji tą samą bakterią
• trudności w konstruowaniu skutecznych szczepionek
• pojawianie się „nowych” szczepów patogennych, podczas gdy „stare” nabywają nowych właściwości
• przebycie groźnej choroby bakteryjnej może nie chronić przed ponownym zakażeniem (np. rzeżączka)

Question 126

Poziomy regulacji na poziomie transkrypcji genów

Answer 126

• warunki środowiskowe wpływające na proces regulacji ekspresji czynników wirulencji
o temperatura
o pH
o dostępność jonów żelaza (Fe2+)
o inne jony dwuwartościowe (Ca2+, Mg2+, Mn2+)
o dostępność węgla i azotu (cukry, aminokwasy)
o osmolarność
o dostępność tlenu
o obecność CO2
o dostępność światła
• geny wirulencji - geny, które są regulowane w odpowiedzi na działanie czynników wirulencji, a ich produkty warunkują przeżycie patogenu w gospodarzu, infekcję i wywołanie procesu chorobowego
• poziomy regulacji - operony i regulony
o regulony - regulacja skoordynowana to regulacja ekspresji wielu genów w odpowiedzi na pojedynczy sygnał
o gdy jeden regulator kontroluje dużą liczbę różnych typów genów a co za tym idzie całego szeregu procesów fizjologicznych nazywa się go globalnym regulatorem

Question 127

Aktywatory i represory transkrypcyjne

Answer 127

• aktywator transkrypcyjny to białko stymulujące ekspresję genów poprzez wiązanie się do specyficznej sekwencji DNA i wiązanie polimerazy RNA do regionu promotorowego
• represor transkrypcyjny działa odwrotnie do aktywatora fizycznie uniemożliwiając związanie polimerazy RNA do regionu promotorowego
• wiele genów wirulencji zależnych od poziomu żelaza jest regulowanych poprzez aktywność represora homologicznego do Fur (ferric uptake repressor) u E. coli

Question 128

Regulacja genów wirulencji poprzez poziom żelaza

Answer 128

• toksyna DT produkowana przez Corynebacterium diphteriae
• białko DtxR jest represorem podobnym do Fur aktywnym w przypadku wysokiego stężenia jonów żelaza w środowisku
• gdy brak żelaza – białko DtxR zmienia konformację i nie blokuje promotora

Question 129

Układy dwuskładnikowe w regulacji procesów patogenezy (TCS)

Answer 129

• komórki bakteryjne muszą stale kontrolować warunki otoczenia i reagować odpowiednio na zmiany
• regulacja przez układ dwuskładnikowy zachodzi na poziomie transkrypcji i jest aktywowana przez czynniki środowiska
• im większy genom bakteryjny i im więcej nisz ekologicznych tym więcej TCS – każdy system TCS odpowiedzialny jest za wyczuwanie odpowiedniego czynnika
• układ dwuskładnikowy to system umożliwiający odebranie i przekazanie sygnału
• najprostszy TCS składa się z:
o sensora - białka odbierającego sygnał, zlokalizowanego w błonie komórkowej
o regulatora - białka cytoplazmatycznego zdolnego do wiązania DNA w rejonach promotorowych i wpływającego na proces transkrypcji
• mechanizm działania - odebranie sygnału wiąże się z autofosforylacją białka sensorowego na konserwowanej reszcie histydyny (N-koniec), która dalej stanowi źródło dla fosforylacji kwasu asparaginowego domeny regulatorowej (centrum katalityczne tworzone przez konserwowane bloki aminokwasów C-końca). Ta fosforylacja indukuje zmianę konformacyjną białka regulatorowego i umożliwia wiązanie się z DNA i transkrypcję genów

Question 130

Białko sensorowe

Answer 130

• dwie domeny
o domena peryplazmatyczna przyjmująca sygnał posiada zmienną sekwencją aminokwasową (w zależności od rodzaju sygnału)
o cytoplazmatyczna domena transmitera uczestniczy w przeniesieniu sygnału
• jest autokinazą (sama ulega fosforylacji) tworzącą homodimery
• histydyna zlokalizowana jest przeważnie na N-końcu białka
• posiada aktywność fosfatazową

Question 131

Białko regulatorowe

Answer 131

• dwie domeny
o domena odbierająca sygnał jest ewolucyjnie konserwowana
o domena oddziałująca z DNA ma sekwencję zmienną (oddziałuje z różnymi sekwencjami promotorowymi)
• katalizuje transfer grupy fosforanowej
• fosforylacja domeny przyjmującej sygnał skutkuje zmianą konformacji domeny oddziałującej z DNA odblokowując proces transkrypcji

Question 132

Układ PhoP- PhoQ

Answer 132

warunkujący wirulencję Salmonella
• jest to układ białek regulujący aktywność niespecyficznej fosfatazy
• głównym regulatorem aktywności układu jest stężenie jonów magnezu, wyczuwane przez domenę peryplazmatyczną białka sensorowego
• białko PhoQ znajdujące się w błonie cytoplazmatycznej odbiera sygnał i przekazuje go na cytoplazmatyczne białko regulatorowe PhoP
• duże stężenie jonów magnezu indukuje wyciszenie transkrypcji genów pag i włączeniem transkrypcji genów prg
• pewna klasa genów aktywowanych przez PhoP podlega także kontroli drugiego układu dwuskładnikowego PmrA-PmrB
o układ ten reaguje na stężenie jonów żelaza
o ulega ekspresji w środowisku o małym stężeniu jonów magnezu i dużym jonów żelaza
• wiele z nich warunkuje wprowadzenie rozmaitych modyfikacji w strukturze osłon komórkowych, co powoduje miedzy innymi oporności bakterii na niektóre peptydy przeciwbakteryjne – modyfikacja LPS

Question 133

wieloetapowy transfer grupy fosforanowej (phosphorelay)

Answer 133

• odmianą układu dwuskładnikowego
• zapewnia bardziej precyzyjną modulację odpowiedzi komórki (regulacja szybkości przepływu grupy fosforanowej)
• grupa fosforanowa jest przekazywana w sekwencji: His-Asp-His-Asp pomiędzy kolejnymi modułami białka sensorowego
• BvgAS Bordetella pertussis
• inną odmianą transdukcji sygnału jest układ wyczuwania liczebności (quorum sensing)

Question 134

Czynnik sigma

Answer 134

• czynniki σ są podjednostkami polimerazy RNA umożliwiającymi rozpoznawanie specyficznych sekwencji promotorowych
• czynniki σ są rozróżniane na podstawie ich masy molekularnej
• są związane z ekspresją genów ważnych w szczególnych warunkach np. stresowych lub genów związanych z cyklem życiowym komórki
• rdzeń polimerazy może związać tylko jeden czynnik σ
• czynniki σ odgrywają kluczową rolę w regulacji transkrypcji wielu genów wirulencji
• bakterie różnią się pod względem ilości posiadanych czynników σ
• u niektórych gatunków bakterii opisano systemy regulacji negatywnej z udziałem czynników anty-σ
• są to swoiste białka antagonistyczne , które wiążą się z czynnikami σ i tym samym uniemożliwiają ich przyłączanie do rdzenia polimerazy RNA
• funkcja czynników σ może zostać przywrócona poprzez aktywność czynników anty-anty σ
• jest to modelowy przykład regulacji kaskadowej

Question 135

Termosensory RNA

Answer 135

• struktura RNA może służyć za indykator zmian temperatury
• w niskich temperaturach RNA tworzy strukturę spinki do włosów maskując miejsca RBS (sekwencje Shine-Dalgarno SD) tzw. termostable riboswitches
• w wyższych temperaturach struktura II rzędowa ulega roztopieniu i miejsca RBS są wolne
• translacja IcrF u Yersinia pestis następuje w temperaturze 37°C (aktywator transkrypcyjny wielu genów wirulencji)
• często zjawisko u patogenów posiadających żywicieli pośrednich (zimnokrwistych i ciepłokrwistych)

Question 136

Mechanizmy działania ncRNA

Answer 136

• małe niekodujące RNA (ncRNA – non-coding RNA = sRNA – small RNA)(40-500 nukleotydów) są modulatorami ekspresji genów bakteryjnych w odpowiedzi na zmiany czynników środowiska
• ncRNA koordynują adaptację do warunków stresowych (odpowiedź na zmiany różnych czynników środowiska) oraz ekspresję genów wirulencji
• efekt działania może być pozytywny lub negatywny i wpływa na procesy translacji lub stabilność mRNA (zmiana jego struktury)
• ncRNA działają jako antysensowne RNA komplementarne do mRNA
• przyłączając się zmieniają strukturę mRNA
o przyłączenie w rejonie 5’ mRNA skutkuje brakiem translacji
o wiązanie ncRNA w rejonach RBS blokuje rybosomy
o przyłączenie się ncRNA w rejonach 3’ mRNA powoduje zmianę jego struktury i skierowanie na drogę degradacji
o małe RNA przyłączają się głównie do obszarów niekodujących lub w środku operonu (poziom ekspresji białek z jednego operonu nie jest identyczny)
• wiele ncRNA to cząsteczki efektorowe układów quorum sensing umożliwiające bakteriom monitorowanie gęstości populacji oraz dostosowanie ekspresji genów do fazy wzrostu
• poziom ekspresji regulowany jest przez trzy ncRNA, których produkcja związana jest z warunkami środowiska (wpływają też na inne białka - efekt plejotropowy)
• małe RNA mogą także wpływać na białka regulatorowe - wiążąc się z nimi znoszą ich działanie

Question 137

Quorum sensing (QS)

Answer 137

• system komunikacji między komórkami bakterii uczestniczący w regulacji ekspresji genów w odpowiedzi na gęstość populacji drobnoustrojów
• ma szczególne znaczenie w opanowywaniu przez bakterie nowych środowisk
• w QS pośredniczą małe cząsteczki sygnalizacyjne (autoinduktory)
• po przekroczeniu progowego stężenia dochodzi do skoordynowanej zmiany ekspresji genów
• systemy QS bakterii Gram-dodatnich i Gram-ujemnych w znacznym stopniu różnią się od siebie
• w QS bakterii uczestniczą cząsteczki sygnalizacyjne
o u Gram-ujemnych lakton N-acylo-L-homoseryny (acyl-L-homoserine lactone-AHL)
o bakterie Gram-dodatnie sygnały oligopeptydowe (trawienie większych prekursorów białkowych)
• transport na zewnątrz komórki za pośrednictwem transporterów ABC
• system QS zidentyfikowano u licznych gatunków bakterii patogennych dla człowieka, zwierząt oraz roślin

Question 138

Quorum sensing bakterii Gram-ujemnych

Answer 138

• system QS oparty na cząsteczkach AHL, zidentyfikowano u ponad 26 gatunków bakterii Gram-ujemnych
• system opierający się na współdziałaniu:
o cząsteczek sygnalizacyjnych AHL (chemiczne sygnały dyfuzyjne lub autoinduktory)
o białek z rodziny syntaz autoinduktora LuxI
o rodziny białkowych regulatorów transkrypcyjnych LuxR
o genów docelowych

Question 139

Cząsteczki sygnalizacyjne AHL

Answer 139

zbudowane z pierścienia laktonu homoseryny (homoserine lactone – HSL) acylowanego łańcuchem tłuszczowym (4–18 atomów węgla)
• zmiany konformacyjne pierścienia HSL przy pH 8-9 (zależność od wartości pH środowiska)
• transport cząsteczek AHL
o swobodna dyfuzja przez ścianę komórkową - AHL mające łańcuch kwasu tłuszczowego zawierający 4–6 atomów węgla
o transport z udziałem pompy protonowej - autoinduktory o łańcuchach kwasu tłuszczowego zawierających powyżej 6 atomów węgla

Question 140

Białka z rodziny LuxI

Answer 140

• warunkują syntezę cząsteczek AHL u bakterii Gram-ujemnych

Question 141

Regulator transkrypcyjny LuxR

Answer 141

• stężenie cząsteczek sygnalizacyjnych w otaczającym komórki bakteryjne środowisku osiąga odpowiedni poziom
• AHL wiążą się i uaktywniają rodzinę białkowych regulatorów transkrypcyjnych LuxR
• C-końcowy fragment łańcucha polipeptydowego jest odpowiedzialny za bezpośrednie oddziaływanie z DNA
• N-końcowy fragment łańcucha jest odpowiedzialny za rozpoznawanie i wiązanie cząsteczek AHL
• w większości przypadków w obecności cząsteczki AHL, białko LuxR zmienia konformację i ulega aktywacji, indukując transkrypcję genów docelowych

Question 142

HGT a QS

Answer 142

• w mechanizmie quorum sensing występuje horyzontalny transfer genów
• wiele homologów białek LuxR i LuxI jest umiejscowionych na plazmidach

Question 143

Quorum sensing bakterii gram-dodatnich

Answer 143

• sygnały oligopeptydowe
• obróbka potranslacyjna z udziałem białek błonowych (trawienie większych prekursorów białkowych)
• odkryty u S. aureus system Arg
• synteza większości czynników wirulencji pod globalną kontrolą systemu Arg

Question 144

do czynników wirulencji regulowanych przez system quorum sensing, należą

Answer 144

o	biosynteza pozakomórkowych proteaz
o	biosynteza hemolizyn
o	biosynteza egzotoksyn
o	tworzenie biofilmu
o	wzrost rozpełzliwy komórek

Question 145

• proces tworzenia się biofilmów bakteryjnych na powierzchni komórek eukariotycznych lub materiałach abiotycznych jest regulowany przez

Answer 145

mechanizm QS
• wytwarzanie przez komórki cząsteczek AHL inicjuje proces adhezji pojedynczych drobnoustrojów do płaszczyzn stałych
• komórka bakteryjna łączy się z daną powierzchnią od strony, w której tempo sekrecji cząsteczek sygnalizacyjnych uległo zmniejszeniu
• u drobnoustrojów, pozostających w zawiesinie, sekrecja cząsteczek AHL jest jednakowa z każdej strony komórki
• w matrycy dojrzałego biofilmu możliwa jest swobodna dyfuzja cząsteczek sygnalizacyjnych

Question 146

Enteropatogeny

• patogeny wewnątrzkomórkowe:

Answer 146

o	Salmonella (dur brzuszny)
o	Shigella (dyzenteria)
o	Listeria (listriozy)
o	Mycobacterium (gruźlica, trąd)
o	Legionella (legionelloza)
o	Neisseria (rzeżączka)
o	Yersinia (dżuma)
o	Rickettsiae (tyfus)
•	komórki w których się namnażają :
o	komórki nabłonka/śródbłonka („non-phagocytic cells”) → naturalna bariera ochronna
o	hepatocyty
o	makrofagi

Question 147

Mechanizm działania enteropatogenów

Answer 147

• białka efektorowe
o kinazy
o fosfatazy tyrozynowe
o fosfatazy inozytolu
o białka modulujące aktywność małych białek G (GTPazy Rho)
 Rho, Rac, Cdc42
 białka kontrolowane przez cykl GTPazowy
• wpływ na szlaki transdukcji sygnału
• przebudowa cytoszkieletu (aktyna związana z błoną, aktyna na biegunie komórki-kompleks Arp2/3)
• indukcja lub zahamowanie apoptozy

Question 148

Oddziaływanie bakterii patogennych z białkami G

Answer 148

W formie nieaktywnej białka G mają przyłączone GDP.
• grupy białek regulujące aktywność białek Rho:
o aktywujące białka GEF (ang. guanine nucleotide exchange factors) umożliwiają wymianę GDP na GTP i przeprowadzają białka Rho w stan aktywny
o regulatorowe białko GDI (ang. guanine nucleotide dissociation inhibitors) blokujenwymianę nukleotydu i wplywa na transport białka G z błon komórkowych do cytozolu
o regulatorowe białko GAP (ang. guanine nucleotide activating protein) regulujenwewnętrzną aktywność GTPazową białek Rho stymulując hydrolizę GTP do GDP i Pi intym samym prowadząc do inaktywacji białek Rho
• enteropatogeny mogą modulować aktywność białek G poprzez
o toksyny białkowe przenoszące małe cząsteczki na białka docelowe np. na małe białka G
 ADP ryboza (toksyny ADP rybozylujące)
 glukoza (glukozylotransferazy)
o białka efektorowe produkowane przez większość patogenów i przekazywane do cytozolu komórek gospodarza,
 należeć do rodziny GEF, GDI, GAP
 modulują szlaki sygnalizacyjne

Question 149

Wnikanie enteropatogenów do fagocytów

Answer 149

• rola układu immunologicznego (fagocytoza)
• część patogenów w toku ewolucji wykształciła zdolność przeżycia i rozmnażania się w makrofagach, neutrofilach czy komórkach dendrytycznych
o Mycobacterium spp.
o Brucella spp.
o Legionella spp.
o Salmonella enterica
• proces złożony i prawdopodobnie odmienny od fagocytozy opsonizowanych lub zabitych bakterii

Question 150

Etapy internalizacji komórek enteropatogenów

Answer 150

1) kontakt patogenu z komórką gospodarza i adhezja niezależne od aktyny (tylko receptor i ligand)
2) formowanie błony związane z polimeryzacją aktyny
3) zamknięcie błony i depolimeryzacja aktyny

Question 151

Mechanizmy wnikania do niefagocytujących komórek eukariotycznych

Answer 151

Mechanizm zipper
• adhezyny bakteryjne wiążą się z receptorem na powierzchni komórki
• następuje aktywacja białek regulatorowych modulujących dynamikę cytoszkieletu
• aktywacja kaskad sygnalizacyjnych (fosforylacja tyrozyny) prowadzących do rearanżacji aktyny i reorganizacji błony

Mechanizm trigger
• białka efektorowe wnikają do komórki gospodarza poprzez T3SS
• wpływ na kluczowe białka regulatorowe
• kontrola dynamiki zmian cytoszkieletu
• dramatyczne rearanżacje cytoszkieletu skutkujące fałdowaniem błony (membrane ruffling) oraz makropinocytozą
• niektóre białka efektorowe mimikują aktywatory białek GTPaz (GAPs) lub GEFs (guanine-nucleotide-exchange factors)

Question 152

Strategie przeżywania wewnątrz komórek

Answer 152

Modyfikacja warunków wewnątrz fagosomu
•	 Fuzja z lizosomem
o	Coxiella
•	Poza szlakiem endocytozy
o	Chlamydia,
o	Legionella,
o	Brucella
•	Zahamowanie dojrzewania fagosomu
o	Mycobacterium,
o	Salmonella

Ucieczka do cytozolu
o Listeria
o Shigella
o Rickettsia

Question 153

Modulacja procesu apoptozy przez enteropatogeny

Answer 153

działanie pro- i antyapoptotyczne w zalezności od:
o gatunku patogenu
o 2etapu cyklu życiowego
 Legionella na początku działa anty- a potem proapoptotycznie
 Mycobacterium, Chlamydia - w zależności od etapu infekcji indukują lub hamują śmierć komórki
o rodzaju komórek eukariotycznych
 Shigella, Salmonella, Neisseria - działanie pro- na makrofagi i anty- na komórki nabłonkowe
• apoptoza indukowana infekcją bakteryjną jest procesem tkankowozależnym

Question 154

Patogeny oportunistyczne

Answer 154

• występują w środowisku bądź kolonizują makroorganizm (składniki flory naturalnej)
• nie są szkodliwe dla makroorganizmów, ale mogą wywołać zakażenia endogenne, nieraz o ciężkim przebiegu
o u osób z zakłóconą sprawnością układu immunologicznego
o u osób przewlekle chorych
o u osób po terapii antybiotykami
o przy naruszeniu ciągłości tkanek

Question 155

Czynniki predysponujące do zakażeń przez drobnoustroje oportunistyczne

Answer 155

• zakłócona równowaga immunologiczna
• przewlekłe wyniszczające choroby (nowotwory złośliwe, białaczka, chłoniaki)
• zaburzenia metaboliczne (cukrzyca, niedoczynność tarczycy, niewydolność nerek, przewlekły alkoholizm)
• choroby układu oddechowego i przewodu pokarmowego przebiegające z obniżeniem odporności komórkowej i/lub humoralnej
• czynniki jatrogenne spowodowane podczas leczenia
o stosowanie różnych leków (antybiotyki o szerokim spektrum)
o tuberkulostatyki (leki przeciwgruźlicze)
o leki immunosupresyjne
o badania kliniczne i laboratoryjne
o zastosowanie aparatury medycznej – respiratory, cewniki, hemodializa, karmienie dożylne