Genetyka mikroorganizmów Flashcards
1
Q
w genomie prokariotycznym można wyróżnić geny… (3)
A
- geny stanowiące konserwatywny rdzeń genomu 8% - ich produktem są białka uczestniczące w translacji, replikacji i metabolizmie; to geny niezbędne do przeżycia komórki
- geny nadające cechy charakterystyczne danemu gatunkowi 64% - geny dające indywidualność komórkom
- geny dodatkowe 28% - to geny bez których komórki mogą przeżyć
2
Q
genom bakteryjny (charakterystyka [3] + wyjątki [3] )
A
- występuje w formie nukleoidu - chromosomu bakteryjnego, wysoce uporządkowane ciało włókniste
- zajmuje określony obszar w komórce prokariotycznej (brak błony jądrowej)
- DNA to zazwyczaj zamknięta struktura, bez wolnych końców, tworząca liczne pętle wokół centralnie ułożonego rdzenia zbudowanego z RNA i białek histonopodobnych
- wyjątki:
> chromosom liniowy - Borrelia burgdorferii, Streptomyces coelicolor
> 3 chromosomy - Burholderia cenocepacia
> 2 chromosomy (liniowy i kowalencyjnie zamknięty) - Agrobacterium spp.
3
Q
białka histonopodobne (charakterystyka - 6)
A
- to białka zakrzywiające (HU, IHF, Fis) i białka kohezyjne (H-NS, LRP, Dps)
- wiążą się z DNA i organizują tą cząsteczkę w strukturę wyższego rzędu - uporządkowanie materiału genetycznego
- pełnią funkcje regulacyjne podobne do eukariotycznych czynników transkrypcyjnych
- większość jest niezbędna do prawidłowego wzrostu komórki, a ich eliminacja silnie obniża przeżywalność bakterii
- mogą wiązać się nieswoiście lub swoiście [IHF, Fis] z DNA
- biorą udział w procesach molekularnych takich jak: inicjacja replikacji, transkrypcji, podziale komórkowym
4
Q
cechy wspólne histonów i białek histonopodobnych [7]
A
- zasadowy charakter - dużo argininy i lizyny
- oporność na temperaturę
- powinnowactwo do DNA in vitro i in vivo
- mała masa cząsteczkowa
- łatwość w tworzeniu struktur wyższego rzędu
- występowanie w dużej liczbie kopii w komórce
- wysoka konserwatywność ewolucyjna
5
Q
cechy odróżniające białka histonopodobne od histonów
A
- białka histonopodobne dużo słabiej wiążą się z DNA w porównaniu do histonów
- białka histonopodobne tworzą struktury znacznie mniej stabilne
- w przypadku białek histonopodobnych struktury wyższego rzędu tworzone są przez jeden rodzaj białka
6
Q
Białko HU (charakterystyka)
A
- możliwa forma heterodimeru (forma α i β - E. coli i Salmonella enterica sv Typhimurium) lub homodimeru (większość bakterii)
- tworzą nieswoiste wiązania z DNA
- mechanizm wiązania z DNA opiera się na przyciąganiu elektrostatycznym między dodatnio naładowanymi resztami aminokwasów zasadowych, a ujemnie naładowanymi resztami fosforanowymi DNA oraz na dopasowaniu części powierzchni dimeru HU do cząsteczki DNA
- zginanie DNA w zakresie 60-140st
- rola w procesach molekularnych: inicjacja replikacji DNA, inicjacja transkrypcji, transpozycja, podział komórkowy często poprzez ułatwienie rozpoznania specyficznych sekwencji nukleotydowych przez białka regulatorowe - uginanie helisy
7
Q
białko IHF (charakterystyka)
A
- w postaci heterodimeru (forma α i β)
- białko uginające DNA 140-160st
- duża homologia sekwencji aminokwasowej do białka HU
- wiąże się ze specyficznymi sekwencjami DNA
- w procesie wiązania do DNA największy udział mają odcinki β2 i β3 (część środkowa heterodimeru), które tworzą długie ramiona i charakteryzują się dużą liczbą aminokwasów zasadowych
- rola w rekombinacji integracyjnej bakteriofaga λ, replikacji, pakowanie DNA do główek fagowych, tworzenie fimbrii, regulacja transkrypcji, transpozycja, replikacja chromosomu i niektórych plazmidów E. coli
- jego brak powoduje zaburzenia w funkcjonowaniu - powolniejszy wzrost komórek, trochę gorszy podział komórek
- wysoko konserwatywne ewolucyjnie
8
Q
Najmniejsze genomy wśród prokariontów mają obligatoryjne symbionty i pasożyty ponieważ… [3]
A
- generowały większą liczbę delecji niż insercji
- utraciły geny warunkujące biosyntezę związków, które są im dostarczane przez gospodarza
- z powodu ograniczeń w zakresie horyzontalnego transferu genów i wprowadzania w ten sposób egzogennego DNA
9
Q
Zawartość G-C jest..
A
- gatunkowo swoista (indywidualna dla danego gatunku) i wykorzystywana jako ocena taksonomiczna
- Stosunek liczby moli guaniny i cytozyny do całkowitej liczby moli guaniny, cytozyny, adeniny i tyminy w DNA wyrażona w procentach [%]
- Bakterie różnią się w znacznym stopniu zawartością par G-C
10
Q
Polimeraza DNA I
A
- Podjednostki - jedna
- Aktywność egzonukleotyczna 3’->5’ - tak
- Aktywność egzonukleotyczna 5’->3’ - tak
- Funkcje - Replikacja i naprawianie DNA
- usuwa startery RNA i zastępuje je fragmentami DNA
- to metaloenzym – w centrum domeny polimeryzacyjnej występuje atom Zn
- Małe wymagania układu matryca-starter – matryca może być z pęknięciami, dużymi przerwami i jednoniciowym DNA (naprawa DNA)
- występuje enzym klenowa (zawiera domenę środkową i C-końcową polimerazy DNA I; uzyskuje się go po trawieniu polimerazy DNA I trypsyną)
- Izolowana z termofilów do celów biologii molekularnej oraz inżynierii genetycznej
11
Q
Polimeraza DNA III
A
- Podjednostki - min 10
- Aktywność egzonukleotyczna 3’->5’ - tak
- Aktywność egzonukleotyczna 5’->3’ - nie
- Funkcje - głównie enzym replikacyjny
- stałe tempo replikacji: 500 nukleotydów/sek.
- utrata podjednostki α (aktywność polimeryzacyjna) -> śmierć komórki
12
Q
budowa polimeraz DNA I i II
A
są to pojedyncze łańcuchy polipeptydowe
budowa domenowa polimerazy DNA I
- N-koniec - aktywność egzonukleazy 5’->3’ – usuwa startery RNA
- Środkowa – korekta egzonukleazy 3’->5’
- C-koniec – centrum polimeryzacyjne
13
Q
Budowa polimerazy DNA III - podjednostki
A
to wieloskładnikowy zespół białkowy o masie 900kDa
α – aktywność polimeryzacyjna
β – stabilizuje polimerazę DNA – przesuwająca się po DNA klamra
θ (theta) – stymuluje aktywność korekcyjną podjednostki ε
ε (epsilon) – aktywność 3’->5’ egzonukleolityczna
τ (tau) – dimeryzacja podjednostek α, ε, θ
γ – udział w replikacji nici opóźniającej
δ, δ’ (delta) – udział w replikacji nici opóźniającej
ψ (psi) – tworzy kompleks z γ lub τ
χ (chi) - tworzy kompleks z γ lub τ, przełączenie z primera RNA na DNA
14
Q
Replikacja DNA - etapy (3)
A
- Inicjacja – rozpoznanie miejsca lub miejsc startu replikacji
- Elongacja – proces przemieszczania się widełek replikacyjnych podczas kopiowania DNA rodzicielskiego
- Terminacja – kończenie i ostateczne kompletowanie nowych łańcuchów
15
Q
Inicjacja replikacji - etapy [7]
A
- aktywne białko DnaA z przyłączonym ATP przyłącza się do oriC (motyw 9-nukleotydowy w 5 powtórzeniach) i powstaje kompleks inicjacyjny
- wskutek wprowadzenia napięcia torsyjnego (wywołanego przez dużą ilość białka DnaA) następuje miejscowa denaturacja (w miejscu 3 powtórzeń 13stonukleotydowego motywu) wymagająca dużych stężeń ATP i białek HU, IHF, FIS
- po denaturacji powstaje kompleks otwarty
- po przyłączeniu do kompleksu otwartego białka SSB (6x białko DnaB - białko DnaC - ATP , ochrona przed reasocjacją i degradacją DNA) powstaje peprymosom I
- hydroliza ATP i odłączenie 6 cząsteczek białka DnaC skutkuje powstaniem peprymosomu II
- przyłączenie prymazy DnaG (przyłącza startery) skutkuje powstaniem prymosomu
- przyłączenie polimerazy DNA III i gryrazy do prymosomu powoduje powstanie replisomu
16
Q
białko DnaA
A
- jest niezbędne do inicjacji replikacji
- to silnie zasadowe białko
- tworzy kompleksy oligomeryczne niezbędne do inicjacji replikacji
- umożliwia rozplecenie podwójnej helisy, ułatwia dołączenie helikazy DnaB
- aktywna forma DnaA musi być połączona z ATP
- posiada 4 domeny funkcjonalne
> I i III – uczestniczą w oligomeryzacji białka (wiążą domeny białka DnaA między sobą i biorą udział w przyłączaniu białka DnaB)
> II – łącznik, który oddziela domenę I od III oraz jest miejscem wiązania ATP
> IV – odpowiedzialna za wiązanie się białka DnaA z DNA
17
Q
białko DnaB
A
- bierze udział w inicjacji replikacji
- w kompleksie z 6 cząsteczkami DnaC przyłącza się do miejscowo zdenaturowanego regionu z DnaA
- ma aktywność helikazy – denaturuje podwójną helisę na bardzo długich odcinkach, aby widełki replikacyjne mogły się przesuwać
- przesuwa się po DNA w kierunku 5’->3’
- Przesuwanie DnaB po DNA doprowadza do odłączenia się białka inicjatorowego DnaA od DNA – zapobiega to pojawianiu się przedwczesnych zdarzeń inicjacyjnych
- Szybkość z jaką przesuwa się ta helikaza po DNA jest czynnikiem decydującym o szybkości replikacji
18
Q
helikazy
A
- Przeprowadzają proces rozwijania DNA, wymaga zerwania wiązań wodorowych dzięki energii pochodzącej z hydrolizy ATP
- Udział w replikacji, transkrypcji, naprawie DNA, rekombinacji
- Współpraca z topoizomerazą (niszczy napięcia torsyjne, przed helikazą)
19
Q
regulacja inicjacji replikacji poprzez metylację
A
- w miejscu OriC w pozycji 6 adeniny w sekwencjach 5’-GATC-3’ przez metylazę Dam (powstaje metyloadenina)
- Po replikacji – hemimetylacja – nić rodzicielska jest metylowana, a nić potomna nie, taka nić związana jest z błoną i do czasu metylacji drugiej nici nowa replikacja się nie rozpocznie
- Metylacja może wpływać na zakrzywianie DNA
20
Q
startery
A
- są niezbędne do rozpoczęcia replikacji
- u bakterii syntetyzowane przez enzym prymazę
21
Q
prymaza - białko DnaG
A
- Forma aktywna – monomer
- Działa dystrybutywnie – po syntezie każdego startera odłącza się od DNA oraz białka DnaB
- Inicjacja syntezy starterów zachodzi w sekwencjach 3’-GTC-5’
- Długość starterów zależy od kontaktu fizycznego DnaG i DnaB (prymazy i helikazy)
22
Q
białka SSB
A
- to białka wiążące jednoniciowy DNA w inicjacji replikacji
- dołączają się do nici tworząc zwarty układ, otaczając jednoniciowy DNA i go chroniąc przed reasocjacją i degradacją
- Odłączanie się białek SSB od DNA jest regulowane i ściśle kontrolowane przez białka RNT
23
Q
w terminacji widełki replikacji nie mogą..
A
przesunąć się poza swoją część replikowanego genomu
24
Q
w terminacji do regionów ter (sekwencje terminatorowe) przyłączają się białka Tus
A
- u E. coli występuje 6 swoistych 15-nukleotydowych, konserwatywnych sekwencji od terA do terG (również na plazmidach)
- w miejscach ter zatrzymywany jest ruch widełek replikacyjnych oraz zahamowana jest transkrypcja
- białka Tus wiążą się do różnych sekwencji ter z różną siłą
- białka Tus wchodzą w interakcje z niektórymi helikazami
- to system zabezpieczający przed przekroczeniem obszaru terminacji replikacji
- ilość białka Tus w komórce jest niewielka
25
przykład termostabilnej polimerazy DNA
polimeraza Taq
| Thermus aquaticus
26
polimeraza Taq
- polimeraza DNA
- Enzym monomeryczny
- Termostabilna - replikuje dna w 74stC, pozostaje funkcjonalna nawet po inkubacji w 95stC – dzięki czemu może być wykorzystywana w reakcji PCR
- Nie ma aktywności korektorskiej (3’-5’ egzonukleazowa) - może wprowadzić błąd raz na 104 – 105 nukleotydów
27
plazmid
- to cząsteczka pozachromosomowego DNA, zdolna do autonomicznej replikacji
- nie posiadają genów niezbędnych do przeżycia dla komórki
- posiadają geny potrzebne komórkom w specyficznych warunkach
- liczba plazmidów w komórce jest zmienna
- nie wszystkie plazmidy mogą ze współegzystować w komórce. Jeśli bakteria posiada już jeden rodzaj plazmidu, to kodowane są na niej białka, które zapobiegną replikacji wielu innym plazmidom lub po pobraniu może on zostać wydalony na zewnątrz lub ulec degradacji
- plazmidy są głównymi naturalnymi wektorami horyzontalnego transferu genów
28
plazmidy koniugacyjne i mobilizowalne mogą przenosić informację genetyczną między
komórkami odległych filogenetycznie mikroorganizmów - mają szeroki zakres gospodarzy
29
plazmidy o wąskim zakresie gospodarzy determinują
zmienność genetyczną w obrębie niższych grup taksonomicznych bakterii
30
plazmidy w kolejnych gospodarzach ulegają
licznym rekombinacjom prowadzących do zmiany ich struktury genetycznej
31
Praktyczne wykorzystanie plazmidów w biologii molekularnej
- badanie funkcji genów
- klonowanie
- plazmidy wahadłowe
- produkcja RNA - wykorzystywane do przygotowania cząsteczek RNA do hybrydyzacji w metodzie Northen Blot – promotory dla polimeraz RNA
- produkcja białek - plazmidy ekspresyjne, dzięki którym powstają białka
32
plazmidy wahadłowe
plazmidy, które mogą utrzymać się i replikować w dwóch typach komórek (zazwyczaj prokariotycznej i eukariotycznej)
33
System CRISPR/Cas9 składa się z
- Zgrupowanych regularnie rozproszonych sekwencji palindromicznych (odwrócone do siebie homologiczne sekwencje, zazwyczaj dzięki nim tworzy się struktura „spinki do włosów”)
- Białek z grupy Cas
34
zasada działania systemu CRISPR/Cas9
1. Do komórki są wprowadzane cząsteczki gRNA, które mają w sobie fragment którym łączą się z białkiem Cas oraz fragment komplementarny do fragmentów genomów
2. Cząsteczki RNA rozpoznają miejsce które ma być zreplikowane w genomie
3. W momencie, w którym cząsteczka gRNA połączy się z odpowiednim miejscem w genomie, to wtedy nukleazy Cas9 przecinają w tym miejscu DNA i w ten sposób dokonywana jest delecja
35
replikacja plazmidów to proces ściśle..
kontrolowany - liczba plazmidów na komórkę jest ściśle określona
36
Podstawowy replikon plazmidowy
- to geny i sekwencje biorące udział w niezależnej od chromosomu gospodarza relikacji i jej kontroli, najmniejszy element niezbędny do zajścia replikacji
- Origin replikacji – miejsce rozpoczęcia replikacji
- geny cop i inc -> inicjacja replikacji,
- geny rep -> białka replikacyjne
- Połączone z np.: markerem selekcyjnym (np. gen dający odporność na penicylinę) tworzą funkcjonalną całość – to wystarczy, aby plazmid mógł się replikować
- Plazmid – dostarcza głównie białka inicjacyjne
- Gospodarz - dostarcza inne czynniki białkowo/enzymatyczne tj. polimerazy, ligazy, prymazy, helikazy (pochodzenie chromosomowe)
37
Baza replikonów plazmidowych – DPR
zdeponowane w bazach DNA sekwencje wielu replikonów plazmidowych (spowodowana dużą różnorodnością replikonów) -> badania nad klasyfikacja plazmidów, ewolucją, ekologią oraz biologią molekularną
38
Mechanizmy replikacji plazmidów [3]
1. Typu theta (θ) – obejmuje głównie bakterie gram ujemne
2. Odsuwanej nici (mechanizm pętli D) – obejmuje wielu gospodarzy
3. Toczącego się koła – obejmuje głównie bakterie gram dodatnie
39
replikacja typu θ (theta)
- najpowszechniejsza forma replikacji DNA plazmidowego [plazmidy gram-ujemne (F, ColE1), o niektóre gram-dodatnie (Bacillus subtilis, Enterococcus spp), chromosomy bakteryjne (E. coli)]
- Otworzenie oczka replikacyjnego następuje w miejscu ori
- Widełki replikacyjne pojedynczo przesuwają się wokół kolistej cząsteczki aż do punktu wyjścia
- Modyfikacja modelu – replikacja dwukierunkowa
- Niezbędny jest udział starterów RNA, prymaza
- Na nici wiodącej replikacja odbywa się w sposób ciągły, na opóźnionej nici w sposób nieciągły – różnice w inicjacji replikacji
- Większość plazmidów niesie gen Rep, które wiążą się do
kilku-kilkunasto nukleotydowych powtórzeń tzw. iteronów, które występują w miejscu inicjacji replikacji
- Występuje więcej niż 1 aktywny replisom – może być 6 lub 8 widełek replikacyjnych, które jednocześnie syntetyzują DNA wewnątrz (dzięki temu możliwa szybsza replikacja)
- Każda nowa runda replikacji rozpoczyna się w miejscu, które jest startem replikacji i rozpoczyna się przed zakończeniem poprzedniej rundy
40
Replikacja typu toczącego się koła (replikacja typu RCR, model sigma (σ))
- model replikacji plazmidów [bakterii gram-dodatnich (pC194 z Staphylococcus aureus, pIJ101 z Streptococcus lividans, pIM13 z Bacillus subtilis), bakterii gram-ujemnych (pHPK255 z Helicobacter pylori, pKYM z Shigella sonnei, pJDB21 z Selenomonas ruminantium), genomów bakteriofagów]
- nie wymaga dużej liczby enzymów
1. rozcięcie jedne z nici DNA w miejscu ori-DSO. Do końca 5' przyłącza się białko Rep, a wolny koniec 3' stanowi start replikacji
2. nić zewnętrzna z przyłączonym białkiem Rep jest odwijana, a nić wewnętrzna replikowana do miejsca SSO
3. końce nici zewnętrznej są łączone i powstaje jednoniciowa kolista pośrednia forma replikacyjna
4. synteza komplementarnej nici z wykorzystaniem startera RNA powstającego w rejonie SSO
41
Replikacja typu odsuwanej nici (mechanizm odsuwania nici, mechanizm przemieszczania się nici, mechanizm pętli D)
- typowy dla eukariotycznych genomów mitochondrialnych
- wykorzystywany w replikacji lub gdy nić poszukuje nici homologicznej w genomie
- do inicjacji potrzebne są białka inicjatorowe RepC, RepA (helikazy) oraz RepB (primaza - kontrola syntezy DNA)
- nić komplementarna ulega odsunięciu
- w miejscach ssi replikacja rozpoczyna się niezależnie od innych miejsc replikacji i jest ciągła, następuje odsunięcie niereplikującej się nici komplementarnej
1. miejscowa denaturacja
2. odsłonięcie miejsca oriL na nici wewnętrznej (jednoniciowa)
3. start replikacji nici wewnętrznej - replikacja ciągła, odsunięcie nici niereplikowanej
4. odsłonięcie miejsca oriR na nici niereplikowanej - jednoniciowej
5. start replikacji na nici zewnętrznej w przeciwnym kierunku
42
inicjacja replikacji plazmidu
- miejsce startu replikacji wegetatywnej w oriV
- replikacja związana z procesem koniugacyjnego transferu DNA rozpoczyna się w oriT
- zazwyczaj jedno miejsce ori (wyjątek plazmid F: 2-3 miejsca ori)
- w zależności od budowy plazmidu inicjacja może przebiegać z udziałem lub bez udziału białek inicjacyjnych
43
inicjacja replikacji bez udziału białka inicjacyjnego - plazmid E. coli ColE1
- gen cea - antybakteryjna substancja białkowa: kolicyna
- gen imm - zapobieganie toksycznemu efektowi kolicyny na komórkę niosącą plazmid
- replikacja tylko w jednym kierunku - kierunek P
- RNA I i RNA II to produkty genu rop, odpowiedzialnego za kontrolę replikacji
- chloramfenikol, spektynomycyna - hamowanie syntezy białek i replikacji DNA chromosomowego
1. polimeraza RNA syntetyzuje pre-starterowe RNA
2. powstaje złożona struktura II-rzędowa, która łączy się z DNA w regionie ori (hybrydyzacja)
3. RNazaH nacina hybrydę
4. powstaje wolny koniec 3'-OH, który staje się miejscem starterowym RNA dla polimerazy DNA I
5. utworzenie prymosomu w miejscu pas
- nowe rundy replikacji nie wymagają syntezy białek inicjacyjnych
44
inicjacja replikacji z udziałem białek inicjacyjnych Rep - bakterie Gram-ujemne
- białka Rep na plazmidach
- model theta oraz pętli D
- charakterystyczne dla plazmidów posiadających iterony - miejsca wiązania plazmidowego białka inicjującego replikację (białko Rep)
- w ori plazmidów również: miejsce wiązania białka DnaA i czynnika IHF, sekwencje GATC (miejsca metylacji), region bogaty w A-T
1. białko Rep samo lub z DnaA (z chromosomu gospodarza) rozpoznaje sekwencje iteronowe i wiąże się z nimi
2. otwarcie dupleksu i zerwanie wiązań A-T
3. możliwe jest wbudowanie replisomu - białka gospodarza DnaB i DnaC, prymaza, polimeraza DNA III, SSB
- wyjątek plazmid R1
45
iterony
- proste sekwencje powtórzone w regionach replikacyjnych ori
- stanowią motyw konserwatywny, heksanukleotydowy
- miejsce wiązania plazmidowego białka inicjującego replikację (białko Rep)
- funkcje regulacyjne, ale gdy ich lokalizacja występuje poza ori replikacji
46
inicjacja replikacji z udziałem białek inicjacyjnych Rep - plazmid R1
- wymaga do inicjacji replikacji białka inicjacyjnego, ale nie zawiera w ori sekwencji iteronowych
- występują sekwencje częściowo palindromowe S1 i S2 - pomiędzy nimi 8 obrotów helisy
1. sekwencja S1 i S2 rozpoznawane przez białko RepA
2. powstaje pętla, a w wyniku tego dochodzi do denaturacji regionu bogatego w A-T oraz zbliżenia się DnaA-box
3. powstaje bąbel replikacyjny i następuje przyłączenie niezbędnych białek do replikacji DNA
47
inicjacja replikacji plazmidów RCR bakterii gram-dodatnich
> mechanizm toczącego się koła
> struktura spinki do włosów (bogata w G-C) powstaje dzięki obecności conajmneij 1 pary odwróconych sekwencji powtórzonych IR
> miejsce DSO
- rozpoczęcie replikacji
- białka RepC wiążą się z regionem bind (domena wiążąca białka Rep) i wprowadzenie nacięcia w domenie nic
- kowalencyjne związanie dimeru białka RepC z końcem 5'
- powstaje wolny koniec 3' - starter do syntezy nowej nici
- kompleks replikacyjny zawiera białka kodowane przez genom gospodarza (helikaza PcrA, polimeraza DNA III, SSB) i plazmidowe
- synteza nici opóźnionej rozpoczyna się od miejsc SSO od syntezy startera przez polimerazę RNA, później przez polimerazę DNA I i III
- synteza nici opóźnionej zależna od białek gospodarza
> miejsca SSO
- 4 klasy
- pojedyncze lub podwójne spinki do włosów - w ich obrębie regiony mogące być rozpoznawane przez polimerazę RNAP (kodowana chromosomowo, miejsca syntezy starterów)
- niektóre SSO rozpoznawane są przez RNAP
- plazmidy z więcej niż jednym SSO mogą mieć więcej gospodarzy
- niektóre SSO funkcjonują w obecności ryfampiny, zaburzającej funkcje polimerazy RNA - jest alternatywny mechanizm replikacji niezależny od RNAP
- SSO to sekwencja rozpoznawana przez polimerazę RNA - przyłączanie startera, inicjacja replikacji
48
Inicjacja replikacji w plazmidzie zależy
- od rodzaju plazmidu
49
Białka inicjacyjne oddziałujące z interonami
• dimery (forma nieaktywna)
o przed związaniem się z ori dzięki białkom opiekuńczym -> powstają formy aktywne – monomery (mogące inicjować replikację)
• białko inicjacyjne TrfA dla plazmidu RK2 może występować w dwóch formach:
o TrfA-44 i TrfA-33 (2 miejsca startu translacji);
o białko 33kDa – większość gram-ujemnych;
o białko 44kDa – Pseudomonas aeruginosa
• budowa białek
o 30 białek Rep z plazmidów replikujących się według modelu theta lub pętli D – niewielkie podobieństwo sekwencji aa – ale obecność podobnych motywów
motyw suwaka leucynowego (motyw L-Z) N-koniec –oddziaływane białko – białko
dwie domeny globularne HTH – helix-turn-helix – oddziaływanie z interonami (specyficzne sekwencje)
50
Oddziaływanie białka Rep z interonami
• przyłączenie Rep do interenów skutkuje zgięciem i destabilizacją helisy -> otwarcie helisy w regionie bogatym w A-T -> przyłączenie kolejnych białek i utworzenie kompleksu otwartego
51
iałko DnaA jest chromosomalnym odpowiednikiem
białka Rep (oddziałuje z oriC) jednak nie jest w stanie zastąpić tego białka
• białko DnaA wspomaga interakcję Rep z interonami oraz tworzenie wieloskładnikowych kompleksów z udziałem DnaB
52
Białka inicjacji replikacji – plazmidy nieinterenowe typu theta
białko inicjacyjne plazmidu R1
• rozpoznaje sekwencje S1 i S2 – w regionie ori – oriR
• wiąże się jako dimer
• równowaga pomiędzy formą mono- i dimerów RepA – kontrolowana przez białko opiekuńcze DnaK
53
Białka inicjacji replikacji plazmidów RCR
* grupa białek Rep
* mogą nacinać i łączyć plazmidowy DNA w sposób podobny do działania topoizomerazy DNA I
* aktywność nacinająca – potrzebna do inicjacji replikacji
* aktywność łącząca – niezbędna do terminacji replikacji
* brak motywu HTH (potrzebnego do interakcji z interonami)
* po nacięciu DNA białka te pozostają kowalencyjnie związane z końcem 5’-DNA
* po zakończeniu rundy replikacji i zamknięciu formy kolistej w wyniku reakcji transestryfikacji białko Rep jest uwalniane w formie nieaktywnej
54
Białka bakteryjne biorące udział w replikacji DNA plazmidowego
* DnaA – białko inicjatorowe replikacji, wiąże się swoiście do sekwencji DnaA i rozplata dwuniciowy DNA w regionie oriC
* DnaB- helikaza DNA
* DnaC – wprowadza białko DnaB do oczka replikacyjnego
* Ssb – białka opiekuńcze dla jednoniciowego DNA
* DnaG – prymaza
* polimerazy DNA III i I
* polimeraza RNA
* Gyraza – topoizomeraza DNA typu II, białko które w sytuacji kiedy dwuniciowa helisa jest rozplatana gyraza przez odpowiednie cięcia niszczy napięcia powstające nad helikazą DNA
* IHF – białko histonopodobne
* DnaK, DnaJ, GrpE, ClpP – białka opiekuńcze
* Ter, Tus – białka kopmleksu terminacyjnego
* topoizomeraza IV - grupa białek kodowanych chromosomalnie, dostarczane przez gospodarza
55
Plazmidy wielokopijne
* plazmidy o rozluźnionej kontroli replikacji
* mechanizm hamujący replikację przy określonej liczbie plazmidów,
* replikacja przebiega bardzo szybko,
* nie ma obawy, że komórka potomna nie otrzyma tego plazmidu
56
Plazmidy jednokopijne
* plazmidy o zaostrzonej kontroli replikacji
* restrykcyjne systemy regulacji inicjacji,
* mechanizmy zapewniające precyzyjny rozdział kopii plazmidu do komórek potomnych,
* bardzo skomplikowana replikacja
57
Regulacja inicjacji replikacji poprzez
* inhibitorowe RNA
* kompleksy RNA-białko
* swoiste oddziaływanie białko –sekwencje interonowe
58
Regulacja za pośrednictwem antysensownego RNA – plazmidy typu ColE1
• brak białek inicjacji replikacji, starter powstaje w wyniku przekształcenia kodowanego przez plazmid prestarterowego RNA II
• cząsteczka RNA I
o Im więcej cząsteczek plazmidu – tym więcej jest cząsteczek RNA I – optymalny poziom – hamowanie kolejnych rund replikacji
o blokowanie - zakłócanie tworzenia startera do replikacji
59
Regulacja inicjacji replikacji przez antysensowny RNA i białka – plazmid R1
* do inicjacji wykorzystywane jest białko RepA kodowane plazmidowo
* prepA aktywny tyko bezpośrednio po wejściu plazmidu do komórki gdy nie ma jeszcze białka CopB (copy-numer control gene)
* pod jego kontrolą prowadzona jest synteza RepA i replikacja plazmidu
* nagromadzanie białka CopB blokuje promotor prepA i gen RepA transkrybowany jest przez promotora pcopB
* promotor pcopA zlokalizowany na nici przeciwnej powstaje tzw. CopA-RNA który tworząc hybryd z mRNA Rep A dodatkowo hamuje replikacje tego białka
60
Kontrola inicjacji replikacji poprzez oddziaływanie białka inicjacyjnego z interonami np. plazmid F
RepE – wiąże się w formie monomerycznej z interonami regionu ori
• wyższa liczba plazmidów -> wysycenie interonów białkami RepE -> wiązanie się wysyconych białkiem RepE interonów regionów ori dwóch plazmidów
61
Multimery plazmidowe lub chromosomalne
* plazmidy współistniejące w komórce na skutek homologicznej rekombinacji pomiędzy sekwencjami homologicznymi mogą w wyniku rearanżacji łączyć się ze sobą lub po replikacji
* dimery dłużej wędrują w żelu agarozowym
* dimery mają zaburzoną segregację do komórek potomnych
* dimery ulegają częstszej replikacji (systemy rozpoznają liczbę ori a nie liczbę cząsteczek plazmidu)
62
System rekombinacji zlokalizowanej mrs (ang. multimer resolution system)
sekwencja nukleotydowa na plazmidzie (res / cer) + enzymy (rekombinazy, rezolwazy, integrazy, transpozazy, inwertazy DNA)
enzymy rozpoznają odpowiednie sekwencje na plazmidzie i w wyniku wewnątrzplazmidowej rekombinacji między nimi przekształcają multimery w monomery
63
System aktywnego rozdziału plazmidów
• charakterystyczny dla plazmidów jedno- i niskokopijnych – niska liczba kopii plazmidu zmniejsza szansę przeniesienia go do każdej komórki potomnej
• najdokładniej poznano i opisano 2 systemy
o system aktywnego rozdziału plazmidu F (sopABC)
o system aktywnego rozdziału plazmidowej formy faga P1 (parABC)
64
system aktywnego rozdziału plazmidu F (sopABC)
Białko SopB wiąże się z sekwencją sopC -> plazmidy łączą się w pary i układają w płaszczyźnie podziału komórki -> przed wytworzeniem przegrody komórkowej pary plazmidów rozdzielają się i każdy przemieszcza się w odpowiedni region przyszłej komórki potomnej
Białko SopA łączy się z promotorem zapobiegając nadprodukcji obu białek (SopA i SopB) – negatywny regulator (białko SopB jako korepresor)
65
system aktywnego rozdziału plazmidowej formy faga P1 (parABC)
• Z promotora para ekspresji ulegają białka ParM (białko aktywne „motor”) i ParR (białko represor)
• Białko ParM
o to ATPaza
o ma zdolność tworzenia filamentów
o w trakcie rozdziału plazmidów powstaje dynamiczny układ – ruch filamentów zależy od procesów polimeryzacji ParM z jednej strony filamentu i depolimeryzacji z drugiego końca
66
Postsegregacyjna eliminacja komórek bezplazmidowych (addykcyjne)
* eliminacja komórki potomnej gospodarza plazmidu, która po podziale nie otrzymała plazmidu
* plazm1id koduje białko truciznę, toksynę oraz antidotum (białko, RNA), które jest wytwarzane w nadmiarze
* komórka potomna, która po podziale nie dostaje plazmidu wraz z białkami komórkowymi otrzymuje porcję toksyny i antidotum
* antidotum ma mniejszą trwałość niż toksyna, ulega wcześniejszej inaktywacji, toksyna osiąga cel w komórce -> komórka ginie
67
System ccd (ang. Control of cel death)– system białkowy na przykładzie plazmidu F
Postsegregacyjna eliminacja komórek bezplazmidowych (addykcyjne)
* gen ccdA – białko CcdA (antidotum)
* gen ccdB białko CcdB (trucizna)
* CcdB inaktywacja gyrazy (zaburzona replikacja, transkrypcja, translacja)
* CcdA – wiązanie się do białka CcdB i jego inaktywacja
* kompleks CcdA-CcdB – negatywny regulator własnego operonu
68
System gdzie antidotum to antysensowny RNA – np. plazmid R1
Postsegregacyjna eliminacja komórek bezplazmidowych (addykcyjne)
* system hok-sok
* gen mok-hok – trucizna,
* polipeptyd Hok- powoduje depolimeryzację błony cytoplazmatycznej
* komórka bezplazmidowa – nietrwały mRNA genu sok ulega degradacji – translacja stabilnego mRNA genów mok i sok i ekspresja białka Hok (trucizny)
69
Transkrypcja
* zachodzi na matrycy jednoniciowego DNA
* nić RNA syntetyzowana jest w kierunku 5’->3’
* pierwszym nukleotydem na końcu 5’ transkryptu jest trifosforan purynowy
* do inicjacji nie jest wymagany starter
* w obrębie jednego operonu matrycę transkrypcyjną stanowi zawsze jedna nić DNA
70
Operon
* jednostka aktywności transkrypcyjnej kontrolowana przez element genetyczny inaczej operator
* w genomie od kilkaset do tysiąca operonów, wielo – lub jednogenowych
* Zależne i nie zależne od warunków środowiska
* najczęściej kodują białka funkcjonalnie związane
71
Regulon
kilka operonów regulowanych przez ten sam wewnątrzkomórkowy czynnik transkrypcyjny pochodzący z wnętrza komórki
72
Stymulon
grupa operonów, których transkrypcja jest regulowana przez ten sam czynnik zewnętrzny
73
Polimeraza RNA (transkryptaza)
* katalizuje polimerazę NTP w kierunku 5’->3’ w procesie transkrypcji
* zbudowana z 5 ewolucyjnie konserwatywnych
* rdzeń katalityczny mimo iż jest centrum aktywnym to samodzielnie nie rozpozna sekwencji startu transktypcji
* czynnik σ zapewnia specyficzność transkrypcji dzięki zdolności do selekcji promotorów
* w środku białka znajduje się szczelina podobna do tej w polimerazie DNA I
* metaloenzym – w centrum aktywnym znajdują się 2 atomy cynku
* wszystkie podjednostki są zsekwencjonowane
74
Polimeraza RNA (transkryptaza) - Podjednostka α
* najmniejsza podjednostka polimerazy RNA
* część N-końcowa – rusztowanie w czasie łączenia się poszczególnych podjednostek
* część C-końcowa – inicjacja transkrypcji
* oddziałuje z aktywatorami transkrypcji
75
Polimeraza RNA (transkryptaza) -Podjednostka β
* centrum katalityczne
* miejsca wiązania produktu i substratu
* w genie rpoB mapują się mutacje determinujące oporność na ryfampicynę i streptolidyginnę
* odpowiedzialna za wierność procesu kopiowania RNA
* naprawianie pomyłek transkrypcyjnych
76
Polimeraza RNA (transkryptaza) - Podjenostka β’
o najbardziej zasadowa
o wiąże DNA
o najsilniejsze oddziaływanie nie z nicią matrycową z nicią do niej komplementarną
o Heparyna – wiąże się z tą podjednostką i hamuje jej wiązanie się z DNA
77
Czynniki σ
* Odpowiada za specyficzność transkrypcji
* zdolność do wiązania się z rdzeniem polimerazy RNA
* zdolność do wiązania się z sekwencją promotorów i miejscową denaturacją DNA
* funkcja regulacyjna - hamowanie transkrypcji niespecyficznej i nie inicjowanej w promotorach
* większość mutacji -> efekt letalny
* bierze udział tylko w inicjacji transkrypcji
78
Wynik współzawodnictwa o rdzeń polimerazy zależy
głównie od wewnątrzkomórkowego stężenia czynników sigma
79
Czynniki anty-σ
* To czynniki białkowe
* wiążą się do podjednostki σ i uniemożliwiają ich przyłączenie się do rdzenia polimerazy RNA natomiast czynniki anty-anty-σ mogą aktywność czynników σ przywrócić – negatywna regulacja kaskadowa
80
Kompleks elongacyjny
```
• domena
α-aminoterminalna (α-NTD) - rusztowanie dla całego utworzonego kompleksu elongacyjnego
• domena
α-karboksyterminalna
(α-CTD) oraz ω – funkcje regulacyjne
```
81
Promotor u prokariota – sekwencja z która wiąże się bakteryjna polimeraza RNA
* promotor znajduje się powyżej pierwszego genu operonu
* składa się z dwóch 6-nukleotydowych segmentów (sekwencje najwyższej zgodności)
* odległość pomiędzy blokami ma istotne znaczenie – muszą się one znaleźć po tej samej stronie podwójnej helisy, co umożliwia ich równoczesne oddziaływanie z podjednostką polimerazy RNA, odpowiedzialną za wiązanie się do DNA
82
Inicjacja transkrypcji u E. coli
1. polimeraza RNA bezpośrednio wiąże się z promotorem -> dochodzi do przekształcenia zamkniętego kompleksu promotorowego w otwarty kompleks promotorowy
2. czynnik σ oddysocjowuje od rdzenia polimerazy RNA po polimeryzacji ok 10 nukleotydów
• rdzeń polimerazy ma powinowactwo do DNA na zasadzie przeciwstawnego ładunku i wiąże się z matrycą w wielu miejscach – powstaje struktura o okresie półtrwania nawet 60 min
• obecność czynnika σ zmniejsza powinowactwo do sekwencji DNA (poza promotorem) - połączenie z innymi fragmentami DNA – czas półtrwania mniej niż 1 sekunda
83
Start transkrypcji
* miejsce startu transkrypcji +1 – najczęściej adenina ulokowana w trójce 5‘CAT3’
* mutacje w regionie -10 – zaburzenie denaturacji DNA i utworzenie kompleksu otwartego
* mutacje w regionie -35 – ograniczenia w wiązaniu polimerazy RNA z promotorem
84
Wzajemne ułożenie promotorów
* ułożenie tandemowe – transkrypcja zachodzi na tej samej nici
* ułożenie zbieżne i rozbieżne – transkrypcja zachodzi w dwóch przeciwbieżnych nici
85
Elongacja i terminacja transkrypcji u bakterii
* w czasie elongacji polimeraza składa się z 2 podjednostek α i po jednej z podjednostek β i β’
* trwałość i aktywność kompleksu jest zapewniona przez istnienie kilku miejsc oddziaływać polimerazy RNA z DNA i RNA
* elongacja = zależności kinetyczne pomiędzy procesem wbudowywania nukleotydu + przesuwanie się kompleksu + topnienie helisy + przejście transkryptu przez miejsce ścisłego wiązania RNA
86
Model bakteryjnego transkrypcyjnego kompleksu elongacyjnego
podwójna helisa leży pomiędzy podjednostakami β i β’ w zagłębieniu na wewnętrznej powierzchni podjednostki β’
• miejsce aktywne znajduje się również pomiędzy tymi podjednostkami
• nić nie będąca matrycą wypętla się z miejsca aktywnego jest trzymana przez podjednostkę β
• zatrzymanie transkrypcji – oddysocjowanie końca 3’ transkryptu od centrum katalitycznego polimerazy RNA
• zablokowanie transkrypcji – zatrzymani transkrypcji, cofanie się polimerazy po DNA, dysocjacja heterodupleksu RNA:DNA-> stan którego zniesienie wymaga udziału dodatkowych białek GreA i GreB
87
pozytywne regulatory elongacji – GreA i GreB
• etapy kontrolowane:
o etap uwolnienia polimerazy ze stanu zablokowania elongacyjnego
o kontrola dokładności transkrypcji
o supresja inicjacji poronnej i dzięki temu stymulacja elongacji i nowej rundy replikacji
• stymulują aktywność endonukleolityczną polimerazy RNA
• GreB - trawienie fragmentów 2-18nukleotydowych, zapobiega wejściu w stan zablokowania oraz atakuje kompleks już zablokowany
• GreA – trawienie fragmentów 2-3-nukleotydowych, nie zniesie już istniejącego bloku, zapobiega utworzeniu bloku - nie zawsze poprzez trawienie – zapobiega tworzeniu przez polimerazę A konformacji charakterystycznej dla stanu zablokowania transkrypcji
88
Terminatory transkrypcji to
sekwencje znajdujące się w genomie (zazwyczaj na końcu operonu), stanowiące barierę dla procesu elongacji i umożliwiające rozpad kompleksu DNA-RNA-polimeraza RNA
wyróżnia się
- terminatory właściwe - niezależne od czynników terminacyjnych
- terminatory Rho-zależne - zależą od aktywności białka Rho
89
terminacja transkrypcji
szybkość uwalniania transkryptu z kompleksu transkrypcyjnego przewyższa szybkość dodawania następnego nukleotydu
90
Terminatory właściwe
• znajduje się na końcu 3’ transkryptu RNA (mRNA)
• sekwencja palindromowa bogata w pary G-C
• następujący po niej ciąg reszt dA (deoksyadenozyny)
• tworzy drugorzędową strukturę podobną do spinki do włosów – typu pętla i łodyga z ciągiem U
• jak dochodzi do zatrzymania elongacji transkrypcji?
o wydłużenie pauzowania polimerazy RNA -> osłabienie wzajemnych oddziaływań pomiędzy polimerazą RNA a transkryptem
• struktura mało stabilna
91
Białko NusA - Terminatory właściwe
* zwiększa wydajność terminacji
| * wiąże rdzeń polimerazy i zwalnia szybkość elongacji – wydłuża czas przerw transkrypcyjnych
92
Terminatory Rho-zależne
* występują zarówno u bakterii jak i u bakteriofagów
* występują nie tylko na końcach genów ale również w obrębie genów, w odcinkach liderowych (pomiędzy promotorem, a pierwszym genem)
* białko Rho wchodzi w fizyczny kontakt z zatrzymanym kompleksem transkrypcyjnym i powoduje oddysocjowanie transkryptu
* miejsce terminacji nie jest stałe i takie samo dla wszystkich transkryptów
93
Białko Rho
* aktywna forma – heksamer
* domeny wiążące RNA (3 silne wiązania i 3 10-krotnie słabsze) i domeny wiążące ATP
* posiada aktywność ATPazy – aktywność ta jest stymulowana przez jednoczesne wiązanie ATP i RNA
* posiada aktywność helikazy – rozwijanie heteroduplesów DNA-RNA
* związanie się RNA do Rho stymuluje aktywność RNA – zależnej ATPazy a następnie aktywność helikazową zależną od ATPazowej aby rozwinąć hybrydy RNA-DNA i uwolnić RNA z kompleksu elongacyjnego
* wykorzystując energię pochodzącą z hydrolizy ATP białko Rho przesuwa się jednokierunkowo po RNA od miejsca rut do miejsca terminacji transkrypcji
* białko Rho nie traci kontaktu z sekwencją rut
94
Białko NusG
* kofaktor Rho-zależnej terminacji
* prawdopodobnie umożliwia związanie Rho z kompleksem na początku elongacji – ułatwienie związania się Rho z sekwencją rut, silnie zwiększa aktywność Rho in vitro i in vivo
95
Atenuatory transkrypcji
to terminatory znajdujące się w obrębie operonów
• terminacja transkrypcji w obrębie operonu – atenuacja transkrypcji
• atenuatory leżące za promotorem – kontrola transkrypcji całego operonu
• atenuatory leżące między poszczególnymi genami – kontrolują grupę genów położonych za nimi
96
supresja (zniesienie, osłabienie) terminacji, antyterminacja
1. białka antyterminacyjne - głównie białka wiążące RNA
> modyfikacja polimerazy RNA -> strategia o zakresie globalnym
> modyfikacja drugorzędowej struktury RNA -> strategia o zakresie lokalnym (w obrębie operonu)
2. translacja, potranslacyjna modyfikacja RNA
97
Białka antyterminacyjne - modyfikujące polimerazę RNA - mechanizm pozytywnej kontroli ekspresji genów bakteriofaga λ
• białko N:
o małe białko zasadowe
o umożliwia supresje terminatorów właściwych i terminatorów Rho-zależnych
o wiąże się z RNA w obrębie sekwencji nut
o umożliwia transkrypcję wczesnych genów
o ograniczenie pauz w obrębie terminatorów
• sekwencja nut
o struktura pętli i łodygi – związanie białka N prowadzi do zapętlenia transkryptu -> umożliwia to trwały kontakt pomiędzy nutRNA a polimerazą RNA
o sekwencja wzmacniająca, umożliwia modyfikację polimerazy w odległych miejscach – nawet 10kpz od nut
• modyfikacje polimerazy RNA
o związanie się białka N z sekwencja nut zwiększa jego lokalne stężenie co ułatwia oddziaływanie z polimerazą RNA
o modyfikacje przez białko N wymagają współdziałania białek NusA, NusB, NusE, NusG – rola stabilizacyjna
• białko Q
o wydajniejsza transkrypcja genów późnych
o wiąże się z sekwencją qut
o białko wiążące się do DNA
o antyterminacja stymulowana przez białko NusA
o białko Q jest rekrutowane do polimerazy RNA jako podjednostka i modyfikuje enzym do formy opornej na terminacje
98
Antyterminacja transkrypcji genomu bakteryjnego
• na drodze modyfikacji polimerazy RNA-7 operonów kodujących stabilne RNA (wydajnie są supresorowane jedynie Rho-zależne terminatory)
• poprzez białka wiążące RNA i modyfikujące jego strukturę – 9 operonów (funkcje kataboliczne, asymilacja azotynów i azotanów)
o Białka wiążą się z mRNA świeżo powstałego transkryptu – uniemożliwiają utworzenie drugorzędowej strutury terminatora – często powstaje struktura antyterminatora
o pętla i łodyga po której nie ma ciągu reszt urydynowych a więc nie dochodzi do rozpadu kompleksu transkrypcyjnego
• poprzez czynnik regulujący transkrypcję – tRNA (nieaminoacylowane tRNA umożliwia utworzenie struktury terminatora – antyterminacja – brak tego rodzaju tRNA) - 18 operonów u bakterii gram-dodatnich
99
Atenuacja transkrypcji
* proces, w którym w odpowiedzi na sygnały metaboliczne dochodzi do terminacji transkrypcji, w specyficznych regionach operonu, nazywanych atenuatorami mechanizmy różne, pewne cechy wspólne
* atenuatory – Rho-niezależne terminatory transkrypcji
* antyterminatory (częściowo zachodzą na odcinki „pauzowania” oraz na terminatory)
100
Kontrola transkrypcji poprzez translację
* operony te zaczynają się od sekwencji liderowej – koduje peptyd liderowy – bardzo bogaty w aminokwas, który będzie syntetyzowany „przez” operon np. 8 treonin pośród 16 pierwszych aminokwasów w sekwencji liderowej operonu treoniny
* sekwencja liderowa posiada też atenuator (może zastopować lub nie syntezę białek z danego operonu)
101
Utworzenie się jednej z dwóch struktur – terminacyjnej lub antyterminacyjnej prowadzi do
terminacji transkryptu lub przejścia kompleksu elongacyjnego na dalsze odcinki operonu
102
Atenuacja transkrypcji w operonie tryptofanowym E.coli
• atenuacja transkrypcji najczęściej ma funkcję regulującą poziom ekspresji całych operonów lub pojedynczych genów
• przedwczesna terminacja zależy od wewnętrznego poziomu tRNATrp
• hamowanie terminacji i transkrypcja genów strukturalnych:
o zmniejszające stężenie tRNATrp (głodzenie tryptofanowe, zaburzenia w aminoacylacji RNA, wzmożona synteza białek)
o lub obniżające wydajność translacji kodonów tryptofanowych
103
Dojrzewanie bakteryjnych RNA
* mRNA – wyjściowy transkrypt większości genów kodujących białka jest funkcjonalny i może od razu ulegać translacji
* tRNA, rRNA – najpierw transkrybowane jako pre-RNA – funkcjonalny dopiero po serii cięć i modyfikacji chemicznych
104
rRNA
* cząsteczki kwasu rybonukleinowego wchodzącego w skład rybosomów
* rRNA towarzyszą w rybosomach białka rybosomalne, jednak to rRNA ma aktywność katalityczną (rybozym), białka działają jako kofaktory zwiększające wydajność reakcji
* struktura przestrzenna jest bardzo rozbudowana
* bakterie syntetyzują 3 rodzaje: 5S rRNA, 16S rRNA oraz 23S rRNA
* aby uwolnić dojrzałe rRNA prekursorowa cząsteczka RNA musi zostać pocięta
* Pre-RNA zawiera kopie wszystkich trzech rRNA (E. coli)
105
tRNA
* transportujący RNA – przyłączanie wolnych aminokwasów i transportowanie ich do rybosomów, gdzie w trakcie procesu translacji zostają włączone do powstającego łańcucha polipeptydowego
* Wysoka specyficzność tRNA w stosunku do aminokwasów, każdy z aminokwasów może być transportowany przez 1, tylko niektóre przez kilka różnych tRNA
* Aminoacylo-tRNA – kompleks tRNA z aminokwasem
* U bakterii geny tRNA znajdują się na całym obszarze genomu, pojedynczo lub w tandemach, czasem też w obrębie rRNA
* Wszystkie pre-RNA podlegają dojrzewaniu w sposób podobny
* Struktura drugorzędowa – liść koniczyny
budowa:
- ramię akceptorowe
- ramię TΨc - rybotymidowe psi, to modyfikowana zasada [pseudouracyl], łączenie się z rybosomem i umocowanie tRNA na matrycy
- ramię zmienne
- ramię DHU - struktura spinki, jaki rodzaj aminokwasu może być przyłączony do tRNA
- pętla antykodonowa - rozpoznanie i związanie z kodonem w mRNA
106
Modyfikacje chemiczne nukleotydów tRNA i rRNA
* większość z nich zmienia bezpośrednio nukleotyd w obrębie transkryptu
* zamiana nukleotydu – odpowiedni nukleotyd jest wycinany i nukleotydy – keozyna i wyozyna są wstawiane (u bakterii)
* najbardziej modyfikowanym transkryptem jest tRNA
* np. metylacja [-CH3], deaminacja [=O], podstawienie siarki [=S], izomeryzacja zasady, nasycenie wiązania podwójnego, zamiana nukleotydu
107
w tRNA modyfikacjom chemicznym podlega co 10 nukleotyd – prawdopodobna rola:
o rozpoznawaniu poszczególnych tRNA przez enzymy, które dołączają do nich aminokwasy
o umożliwieniu pojedynczej cząsteczce tRNA rozpoznanie więcej niż 1 kodonu
108
rRNA modyfikowane jest poprzez
o poprzez dodawanie grup metylowych głównie do grupy OH cukru w nukleotydzie,
o przekształcenie urydyny w pseudourydynę
• takie same modyfikacje zachodzą w tych samych pozycjach wewnątrz wszystkich kopiach rRNA – pozycje te odpowiadają sobie w dużej mierze u różnych gatunkach
• funkcja nie do końca poznana – być może modyfikacje są istotne dla aktywności cząsteczek rRNA w rybosomach
109
Poliadenylacja transkryptów bakteryjnych
ciągi reszt adeninowych dodawane na końcu 3’
• reakcja katalizowana przez:
o u E. coli – poli(A) polimerazę I i poli(A) polimerazę II
• rola poliadenylacji RNA
o stabilizacja RNA (czy jest możliwa degradacja cząsteczek)
o translacja
o kontrola replikacji plazmidów (ich liczby)
110
Degradacja bakteryjnych RNA
• proces szczególnie ważny w kontekście mRNA – regulacja ekspresji genów i obecności konkretnych białek
• bakteryjne mRNA degradowane są bardzo szybko, okres półtrwania to maksymalnie kilka minut
o zidentyfikowane enzymy biorące udział w degradacji RNA:
RNazę E i RNazę III – endonukleazy które dokonują cięcia wewnątrz cząsteczki RNA
RNazę II – endonuklezę, usuwa nukleotydy w kierunku 3’->5’
fosforylację polinukleotydową (PNPazę), usuwa nukleotydy od końca 3’mRNA i wymaga fosforu nieorganicznego jako kosubstratu
o bakteryjne mRNA są degradowane w kierunku 3’->5’
111
Translacja – synteza polipeptydów na matrycowym RNA
* inicjacja wszystkie reakcje przed utworzeniem wiązania peptydowego między dwoma pierwszymi aminokwasami w białku. Rybosom wiąże się z mRNA a następnie do rybosomu przyłączany jest aminoacylo-tRNA
* elongacja – zdarzenia od momentu syntezy pierwszego wiązania peptydowego do przyłączenia ostatniego aminokwasu do białka
* terminacja - odłączenie łańcucha polipeptydowego i oddysocjowanie rybosomów od mRNA
112
Rybosomy
• u E. coli zawierają 66% RNA (część aktywna) i 34% białek (zwiększają jedynie aktywność RNA)
• przestrzenna konformacja rRNA jest zmienna i zależy od procesu translacji
• rybosomowy RNA pełni funkcję katalityczne np. 23S rRNA ma aktywność transferazy peptydowej (katalizuje utworzenie wiązania peptydowego)
• białka rybosomowe:
o wiążą się do rRNA i wpływają na konformację tych cząsteczek
o rola w przyłączeniu się mRNA i inicjatorowego tRNA do małej podjednostki rybosomu
o rola w przyłączeniu się rRNA do podjednostek rybosomu (5S rRNA do dużej podjednostki rybosomu)
o udział w translokacji rybosomu podczas translacji
113
Inicjacja translacji
• bakteryjny translacyjny kompleks inicjacyjny składany jest bezpośrednio w rejonie kodony inicjacyjnego – wewnętrzne miejsce wiązania rybosomu – miejsce rozpoczęcia syntezy białka
• bakteryjne miejsce wiązania robosomu
o położone między 3 a 10 nukleotydu powyżej kodonu inicjacyjnego,
o znajduje się sekwencja najwyższej zgodności
• rybosomy, które w danym momencie nie biorą aktywnego udziału w translacji rozdysocjowują na podjednostki aż do momentu ich wykorzystania
• Bakteryjny mRNA jest policistronowy co oznacza, że zawiera informację dla syntezy więcej niż 1 białka -> gdy długość odcinków międzycistronowego nie przekracza kilku zasad, rybosomy związane z mRNA rozpoczynają translację kolejnego cistronu bez ponownego wiązania się z mRNA
114
regulacja inicjacji translacji
• regulacja specjalna – mechanizmy działające tylko na konkretny transkrypt lub małą grupę transkryptów np. operony kodujące białka rybosomalne u E. coli
• białko kodowane przez operon może przyłączyć się do:
o lidera w cząsteczki mRNA powstałej po transkrypcji operonu
o rybosomowego RNA (rRNA)
• łączenie się z RNA – faworyzowane, gdy w komórkach znajdują się wolne cząsteczki rRNA
• gdy rRNA wmontowany w robosomy
o białko wiąże się ze swoim mRNA -> blokowanie inicjacji translacji i wyłączenie dalszej syntezy białek rybosomowych z tego operonu
115
Regulacja inicjacji translacji przez krótkie RNA
* krótkie RNA mogą przyłączać się do sekwencji wewnątrz transkryptów mRNA jednak co ciekawe nie zawsze prowadzi to do zahamowania translacji
* może prowadzić do zahamowania translacji jednych białek i aktywacji innych białek – kompleksy wyglądają podobnie – badania trwają
116
Elongacja translacji
1. antykodon rozpoznaje kodon w mRNA związanym z miejscem A podjednostki 30S
2. koniec aminoacylowany wchodzi w miejsce A podjednostki 50S
3. hydroliza GTP -> odłączenie kompleksu EF-Tu-GDP od miejsca A
4. ponowne utworzenie formy aktywnej EF-Tu-GTP wymaga czynnika elongacyjnego EF-Ts
117
Terminacja translacji
odłączenie się polipeptydu od tRNA , odłączenie tRNA i mRNA od rybosomu i rozpad rybosomu na podjednostki
• najlepiej opisany u E. coli
• występują kodony nonsensowne UAG – amber, UAA – ochre, UGA – opal
– nie posiadają one swoich odpowiedników w tRNA – są bezpośrednio rozpoznawane przez białkowe czynniki uwalniające RF (RF1-UAA, UAG RF2-UGA, UAA)
• czynniki RF1 i RF2:
o wiążą się i działają w miejscu A tylko gdy miejsce P jest zajęte przez peptydo-tRNA, aktywują rybosom do hydrolizy peptydylo-tRNA (akceptorem reszty peptydylowej jest woda, a nie aminoacylo)
o aktywują rybosom do hydrolizy peptydylo-tRNA – akceptorem reszty peptydylowej jest woda, a nie aminoacylo-tRNA
o do ich odłączenia od rybosomu wymagany jest czynnik RF3
• RRF – białko biorące udział w rozpadzie rybosomu na podjednostki
• IF3 – odłączenie tRNA od rybosomu i hamowanie ponownego przyłączania się podjednostek
118
nietypowe zdarzenia w czasie elongacji
1. zaprogramowana zmiana fazy odczytu - rybosom zmienia fazę odczytu w specyficznym miejscy transkryptu
2. poślizg rybosomu - kiedy dochodzi do końca jednej sekwencji kodującej, uwalnia białko i ślizga się do następnego kodonu inicjacyjnego i rozpoczyna syntezę
3. pominięcie translacyjne - pomijana jest duża część transkryptu i elongacja translacji pierwotnego białka zachodzi w sposób ciągły po tym pominięciu
119
aminoacylacja tRNA
- syntaza aminoacylo-tRNA
- proces bardzo dokładny, a wierność zależy od zdolności syntetaz aminacylo-tRNA do naprawy błędów
> kontrola kinetyczna - dobre tRNA wiąże się szybko, oddysocjowuje powoli, indukuje zmiany konformacyjne: szybka reakcja minoacylacji
- złe tRNA wiąże się wolno, nie indukuje zmian konformacyjnych, odłącza się od enzymu
> kontrola chemiczna - blokowanie pierwszego lub drugiego etapu tej reakcji przez hydrolizę aminoacyloadenylanu lub produktu końcowego
>aminokwas błędnie przyłączony jest przekształcany w aminokwas odpowiedni
120
potranslacyjna obróbka białek - fałdowanie białek
- umożliwia polipeptydom utworzenie prawidłowej struktury trzeciorzędowej i uzyskanie prawidłowej aktywności
- małe białka - spontanicznie
- duże białka - przy pomocy chaperonów
> kompleks DnaK-DnaJ-GrpE - rola w metabolizmie bakterii, transport białek przez błony, fałdowanie białek de novo, degradacje źle zwiniętych oraz tworzenie kompleksów białkowych
> rodzina GroEL i GroES - chaperoniny
121
etapy PCR
1. denaturacja - rozplecenie podwójnej helisy matrycowego DNA w wysokiej temp. ok 95oC
2. annealing - hybrydyzacja odcinków starterowych, polega na tworzeniu odcinków dwuniciowych składających się z starterów i matrycowego DNA, temp. 45-60oC - ściśle określona dla starterów
3. elongacja - właściwa synteza DNA i amplifikacja genu. Temp. 72oC powoduje utworzenie kompleksu z polimerazą DNA, rozpoczyna się synteza nici komplementarnej do matrycy
122
elektroforeza produktów reakcji PCR
- identyfikacja produktu poprzez rozdział materiału w żelu agarozowym
- nanoszone są również standardy masowe - na podstawie położenia badanego genu w stosunku do standardów masowych określamy jego wielkość
123
standardy masowe
fragmenty DNA o znanych masach cząsteczkowych wyrażonych w ilości par zasad
124
PCR pozwalana zwielokrotnienie
pożądanego odcinka łańcucha DNA
125
nukleotydy w PCR chelatują ..
jony magnezowe, dlatego też dodaje się ich nadmiar
126
BSA, siarczan amonu, Triton, DTT w reakcji PCR są odpowiedzialne za ...
stabilizację polimerazy, modyfikację oddziaływań matryca-primer
127
startery wykorzystywane w reakcji PCR ...
- powinny składać się ze wszystkich możliwych kombinacji kodonów dla danego aminokwasu
- nie powinny mieć sekwencji palindromu - może dojść do hybrydyzacji w obrębie starterów
128
stopień zdegenerowania jest iloczynem
możliwej liczby kodonów dla wybranej sekwencji aminokwasowej
129
temperatura topnienia jest to
temp dysocjacji dupleksu primer-matryca w PCR
130
gorący start w reakcji PCR służy
ograniczeniu hybrydyzacji niespecyficznej, polega na dodaniu ostatniego odczynnika (polimerazy) po uprzednim ogrzaniu próbki
131
wartość temperatury topnienia rośnie wraz ze wzrostem
zawartości cytozyny i guaniny w łańcuchu - powód: pomiędzy tymi zasadami występują po 3 wiązania wodorowe
132
polimeraza Taq
popełnia dużo błędów
nie polecana do klonowania i tworzenia konstrukcji genowych
brak aktywności egzonukleolitycznej 3'-5'
nie generuje tępych końców - pozostawia dwie adenozyny
133
co zmniejsza szybkość i wydajność PCR?
aktywność egzonukleolityczna, dlatego stosuje się mieszaniny polimeraz np. Taq + Tfu
134
dlaczego w PCR używa się nadmiaru primerów?
aby zapobiec renaturacji matrycowego DNA
135
RT-PCR
- mRNA jako matryca
- zastosowanie dwóch par starterów różniących się temp. topnienia
- startery zewnętrzne - amplifikacja znacznie dłuższego fragmentu
- startery wewnętrzne - powielenie krótszego fragmentu w brębie fragmentu starterów zewnętrznych
- pozwala wyeliminować możliwość kontaminacji
136
multipleksowy PCR
- kilka par starterów
- jednoczesne powielenie kilku regionów genomu
- do wykrywania nieswoistych produktów
137
ASA-PCR
- specyficzne startery, dzięki którym możliwe wykrycie alleli zmutowanych i prawidłowych
- wykrywanie mutacji punkowych poza miejscami restrykcyjnymi
138
SSCP-PCR
- wykrywanie mutacji punktowych
- poddanie produktu reakcji PCR denaturacji do pojedynczej nici -> elektroforeza w żelu poliakrylamidowym w warunkach niedenaturujących
- różnice w strukturze wywołane mutacją spowodują odmienną ruchliwość
139
PCR-RFLP
- wykrycie mmutacji punktowych w obrębie sekwencji rozpoznawanych przez enzymy restrykcyjne lub mutacji prowadzących do powstania nowych miejsc restrykcyjnych
- analiza fragmentów DNA po cięciu enzymem restrykcyjnym
140
RACE-PCR
- szybkie amplifikacje końców cDNA
| - poznanie sekwencji jednego z końców badanego fr mRNA, w zależności od analizowanego końca : 3'RACE lub 5'RACE
141
konkurujący PCR
- pozwala określić początkową ilość DNA
142
qPCR
- pozwala monitorować ilość DNA amplifikowanego w czasie rzeczywistym
143
metoda pokazu różnicowego
- pozwala na badanie różnic w ekspresji wielu genów jednocześnie w badanej populacji
- polega na amplifikacji produktów na matrycy jednoniciowego cDNA przepisanego z mRNA pochodzącego z dwóch różnych populacji komórek za pomocą różnych kombinacji starterów oligonukleotydowych. produkty są rozdzielane na żeli poliakrylamidowym
144
markery oparte na hybrydyzacji DNA
PCR
RFLP - polimorfizm długości fragmentów restrykcyjnych
145
RFLP - polimorfizm długości fragmentów restrykcyjnych
- trawienie DNA enzymami restrykcyjnymi -> rozdział produktów na żelu agarozowym
- dodatkowo transfer na membranę i hybrydyzacja DNA z specyficzną sondą znakowaną radioaktywnie lub fluorescencyjnie
- analiza specyficznych loci lub alleli
- wysoka wiarygodność
- wymaga dużo DNA do trawienia
146
markery oparte na PCR z zastosowaniem arbitralnego startera
RAPD - losowo amplifikowany polimorficzny DNA
| ISSR - polimorfizm sekwencji mikrosatelitarnych
147
RAPD - losowo amplifikowany polimorficzny DNA
- starter o przypadkowej sekwencji
- starter hybrydyzując do matrycy DNA zapoczątkowuje amplifikację w wielu rejonach genomu jednocześnie
- małe ilości DNA
148
ISSR - polimorfizm sekwencji mikrosatelitarnych
- identyfikacja polimorfizmu długości obszarów DNA zawartych między przeciwlegle skierowanymi identycznymi sekwencjami mikrosatelitarnymi
- startery odpowiadają motywom mikrosatelitarnym
- względna prostota techniki
- wysoka powtarzalność wyników
- markery mikrosatelitarne mogą być sprzężone z obszarami kodującymi
149
markery oparte na PCR z zastosowaniem specyficznych starterów
SSR - mikrosatelitarny polimorfizm krótkich tandemowych powtórzeń
SCAR - polimorfizm sekwencyjnie charakteryzowanych regionów DNA
SNP - polimorfizm pojedynczych nukleotydów
150
SSR - mikrosatelitarny polimorfizm krótkich tandemowych powtórzeń
- analiza sekwencji mikrosatelitarnych DNA, składającego się z powtarzalnego motywu długości 1-4 nukleotydów
- biblioteki genomowe
- wysoka częstotliwość identyfikacji polimorficznych sekwencji, wynikająca ze zmiennej liczby powtórzeń motywu nukleotydowego
- możliwa ocena homo- lub heterozygotyczności analizowanego osobnika na podstawie profilu genetycznego
151
SCAR - polimorfizm sekwencyjnie charakteryzowanych regionów DNA
- sekwencjonowanie końcowych odcinków RAPD, na bazie których projektowane są startery stosowane do amplifikacji specyficznego locus
- identyfikuje różnice sekwencyjne dziedziczone dominacyjnie
- dodatkowe poddanie produktów PCR trawieniu restrykcyjnemu i rozdziałowi denaturującemu na żelu poliakrylamidowym -> określenie homo- lub heterozygotyczności
152
SNP - polimorfizm pojedynczych nukleotydów
- wykrycie polimorfizmu pojedynczego nukleotydu w obrębie badanej sekwencji
- amplifikacja danego fragmentu genomu w PCR i sekwencjonowanie produktu -> porównanie obrazów elektroforetycznych -> określenie czy mutacja miała miejsce
- wysoka wydajność identyfikacji polimorfizmu w obrębie badanej sekwencji
- duży koszt
153
markery oparte na PCR i trawieniu restrykcyjnym
AFPL - polimorfizm długości amplifikowanego fragmentu
| CAPS [PCR-RFLP] - polimorfizm trawionych amplifikowanych sekwencji
154
AFPL - polimorfizm długości amplifikowanego fragmentu
- trawienie matrycowego DNA enzymami restrykcyjnymi -> poddanie uzyskanych fragmentów 2 rundom amplifikacji - niespecyficznej i specyficznej
- kombinacja dwóch enzymów restrykcyjnych - uzyskanie lepkich końców niezbędnych do połączenia produktów trawienia z oligonukleotydowymi odcinkami - adaptorami
- wysoka rozdzielczość generowanych wzorów prążkowych
- możliwość szybkiej detekcji polimorfizmu
- nie wymaga znajomości badanych sekwencji
- możliwe zautomatyzowanie
155
CAPS [PCR-RFLP] - polimorfizm trawionych amplifikowanych sekwencji
- łączy PCR z trawieniem restrykcyjnym
- startery konstruowane na podstawie znanych sekwencji DNA, cDNA lub klonowanych produktów RAPD oraz wybierane tak aby powielały produkty zawierające introny
- identyfikacja zmienności w sekwencji DNA
156
markery oparte na polimorfizmie pojedynczych nukleotydów
PCR
SSCP - polimorfizm konformacji pojedynczych nici DNA
157
SSCP - polimorfizm konformacji pojedynczych nici DNA
- detekcja polimorfizmu z zastosowaniem elektroforezy denaturowanego jednoniciowego DNA, którego konformacja ule zmianie pod wpływem mutacji
- identyfikacja heterozygotyczności organizmów i określenie różnic strukturalnych DNA wpływających na ruchliwość produktu w żelu poliakrylamidowym
- detekcja chorób genetycznych człowieka
- analiza polimorfizmu i detekcja mutacji w obrębie genomów roślin hodowlanych
