Mikroorganizmy a stres środowiskowy Flashcards
Ogólna odpowiedź na stres
• w koordynacji ekspresji genów „odpowiedzi na stres” biorą udział różne czynniki transkrypcyjne np. Msn2/4p, które regulują ekspresję genów tzw. ogólnej odpowiedzi na stres
• w obronę przed szlakiem termicznym zaangażowane są białka Hsp kontrolowane przez czynnik transkrypcyjny Hsf1p
• Wiele z indukowanych genów znajduje się pod kontrolą czynników transkrypcyjnych Msn2p i Msn4p, które realizują program ogólnej odpowiedzi na stres
Ekspresja genu
• MSN2 jest konstytutywna niezależnie od warunków środowiska
• MSN4 zależy od czynników transkrypcyjnych Msn2/4p i jest indukowana stresem
• Aktywacja genów obrony przed perturbacjami środowiskowymi zależy od jądrowej lokalizacji czynnika transkrypcyjnego
• W warunkach optymalnych dla komórki czynniki transkrypcyjne Msn2p i Msn4p znajdują się w cytoplazmie ale pojawienie się sygnałów stresowych indukuje akumulację czynników transkrypcyjnych w jądrze
Czynniki te (Msn2p i Msn4p) regulują ekspresję genów docelowych w odpowiedzi min na
Szok termiczny Szok osmotyczny Zmiany pH Stres oksydacyjny Głodzenie glukozowe Wysokie stężenie etanolu Obecność inhibitorów wzrostu np. fungicydów, detergentów leków antynowotworowych
Transportery ABC
• To rodzina białek posiadających kasetę wiążącą ATP. Energia uwalniana przez nie w wyniku hydrolizy ATP jest wykorzystywana do transportu substancji przez błonę.
• Dzieli się je na trzy główne kategorie
o Białka nie będące transporterami – zaangażowane w procesy translacji i naprawy DNA
o Eksportery – występują u porkariota i eukariota – usuwają z komórki substancje toksyczne, u bakterii gram-ujemnych transportują lipidy i polisacharydy z cytoplazmy do przestrzeni peryplazmatycznej
Układ TMD-NBD-TMD-NBD
o U prokariontów tzw. importery, biorą udział w pobieraniu składników odżywczych do wnętrza komórki (transportowane są jony, białka, peptydy, cukry, inne cząsteczki hydrofilowe)
Wymagana jest obecność białka SBP, które wiąże substraty
Układ NBD-TMD-NBD-TMD
• Białka ABC działają jako transportery ale również jako receptory kanały regulatory kanałów i proteazy
Białka ABC ze względu na topologię rozdzielono na klasy:
• pełne transportery posiadające 2 domeny NBD i 2 domeny TMD, z których każda ma 5-10 regionów wiążących w błonie
• transportery połowiczne – 1 domena NBD i 1 domena TMD
• białka nieposiadające TMD i mające 1 lub 2 NBD
Transportery drożdży S.cerevisiae zawierają się w 6 podrodzinach:
- ABCB/MDR
- ABCC/MRP/CFTR
- ABCD/ALDP
- ABCE/RLI
- ABCF/YEF
- ABCG/PDR
Podrodzina PDR - Transportery ABC
białka warunkujące oporność komórek na inhibitory
Pdr5p - oporność na wiele różnych związków, np azole, leki przeciwnowotworowe i ludzkie hormony steroidowe
Snq2p - oporność na N-tlenek-4nitrochinoliny (4NQO)
Pdr15p - udział w detoksykacji komórki podczas stresu metabolicznego, nadaje komórkom oporność na chloramfenikol i eter laurylowy polioksyetylenu,
aktywność silnie indukowana przez różne czynniki stresowe m.in.: stres osmotyczny, szok termiczny, niskie pH, głodzenie, obecność słabych kwasów. Jego ekspresja jest regulowana przez Pdr1p Pdr3p i Pdr8p oraz związana z systemem ogólnej odpowiedzi na stres. W promotorze tego genu jest sekwencja STRE, z którą wiąże się Msn2p
Pdr10p -utrzymanie prawidłowego rozmieszczenia i funkcji kilku białek,
Pdr12p - oporność na słabe kwasy organiczne, • ekspresja PDR12 regulowana jest negatywnie przez czynniki transkrypcyjne Pdr1p i Pdr3p oraz pozytywnie przez War1p. Białko War1 jest przyłączone konstytutywnie do sekwencji WARE w promotorze PDR12. Obecność słabych kwasów indukuje fosforylację War1p, co aktywuje transkrypcje PDR12
Nagły wzrost temperatury powoduje zatrzymanie
cyklu komórkowego w fazie G1. W tym czasie zachodzą zmiany warunkujące tolerancję komórkową na wzrost w wysokości temperatury.
Stres cieplny wpływa na zmiany dotyczące głównie
błony komórkowej - wraz ze wzrostem temperatury rośnie płynność błony. Może to prowadzić do dezintegracji dwuwarstwy fosfolipidowej i w konsekwencji śmierci komórki.
Białka Hsp
- Białka Hsp działają jako białka opiekuńcze odpowiedzialne za prawidłowe zwijanie się innych białek, ich oligomeryzację, translokację i degradację.
- Biorą udział w podziałach komórkowych, syntezie DNA, transkrypcji, translacji, fałdowaniu i transporcie białek
- Pełnią również rolę opiekuńczą – zapobiegają denaturacji i wtórnej agregacji białek pod wpływem warunków stresowych
Pod wpływem szoku temperaturowego i innych warunków stresowych m.in. niskich temperatur, stresu osmotycznego i etanolowego w komórkach drożdży akumulowane są
duże ilości trenalozy.
Białko Hsp104p
- Białko Hsp104p to główny chaperon w systemie obronnym komórek drożdżowych, odpowiedzialne jest za rozpuszczanie białek, prawidłowe fałdowanie białek oraz reaktywację splincingu mRNA po inaktywacji cieplnej.
- Białko Hsp104p jest niezbędne i wystarczające do zapewnienia przeżywalności komórek eksponowanych na temperatury subletalne
- Brak białka Hsp104p powoduje utratę tolerancji etanolowej, toleracji cieplnej i rolerancji na etanol indukowanej przez szok temperatury. W temperaturze 40oC syntetyzowane są białka Hsp104 jak i Hsp70.
- Ekspresja białka Hsp104p znajduje się w komórkach na niskim poziomie w warunkach fizjologicznych
- Za indukcję wytwarzania białka Hsp104p odpowiadają czynniki Msn2/4p oraz czynnik Hsf1p
Temperatura jako czynnik wzrostowy
• Działanie temperatury na mikroorganizm może mieć charakter
o bezpośredni – wpływa na szybkość wzrostu, aktywność enzymów, skład chemiczny komórki, wymagania pokarmowe
o pośredni – reguluje rozpuszczalność związków wewnątrzkomórkowych, transport jonów, dyfuzję substancji chemicznych, zmianę wartości osmotycznych błon komórkowych
• każdy gatunek mikroorganizmu charakteryzuje się trzema kardynalnymi temperaturami rozwoju – temperatura optymalna, minimalna i maksymalna
• ze względu na wymagania temperaturowe drobnoustroje podzielono na
o termofile rosnące w temperaturze >45oC
o mezofile rosnące w temperaturze 20-45oC
o psychrofile rosnące w temperaturze 7-20oC
o psychrotrofy rosnące w temperaturze <7oC
Drobnoustroje termofilne (ciepłolubne)
• charakteryzują się wysoką optymalną temperaturą wzrostu w zakresie 45-50oC, a nawet powyżej 60oC
• większość to bakterie Gram-dodatnie przetrwalnikowe
o Geobacillus stearothermophilus, Bacillus coagulans
o To również niektóre gatunki fermentacji mlekowej
Lactobacillus delbrueckii subsp. delbrueckii
Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus, Streptococcus thermophilus
Drobnoustroje mezofilne (obojętnolubne)
- Rozwijają się w temperaturach umiarkowanych
- Optymalną temperaturą wzrostu jest 20-45oC
- Są to organizmy saprotroficzne, większość to patogeny człowieka takie jak Salmonella spp., czy Staphylococcus aureus
Drobnoustroje psychrofilne (zimnolubne)
- Rosną już w temperaturze 0oC, ich temperatura optymalna nie przekracza 15oC, a temperatura maksymalna -20oC
- Wzrost w niskich temperaturach jest uwarunkowany aktywnością enzymów katalizujących reakcji metaboliczne w tych temperaturach
- Wykazują dobre warunki do rozwoju w warunkach podbiegunowych, na szczytach gór, w jeziorach, morzach, oceanach strefy umiarkowanej
- Są to głównie bakterie z rodzaju Alcaligenes, Bacillus, Pseudomonas, Flavobacterium i Arthrobacter
Drobnoustroje psychrotrofowe
• Bez względu na swoje temperatury kardynalne wykazują zdolność rozwoju w temperaturze ≤7oC – są to wszystkie psychrofile i część mezofili
Temperatura jako czynnik zabójczy
• W temperaturze przekraczającej maksymalną temperaturę wzrostu następuje termiczna inaktywacja mikroorganizmów. Pod wpływem ogrzewania zachodzi mechanizm śmierci cieplnej drobnoustroju. Prowadzi to do powstania letalnych nieodwracalnych zmian w komórkach. Zniszczeniu ulega struktura przestrzenna białek komórki i kwasów nukleinowych.
• Wzrost temperatury powoduje również dezaktywację enzymów podtrzymujących metabolizm komórki
• Uszkodzeniu ulegają również funkcje błony komórkowej – zostaje zwiększona przepuszczalność białek i kwasów nukleinowych
• Ze względu na specyficzną odporność na działanie wysokich temperatur mikroorganizmy dzieli się na:
o Ciepłooporne – formy przetrwalne (spory) laseczek Bacillus i Clostridium
o Ciepłowrażliwe – komórki wegetatywne
Czas śmierci cieplnej
czas potrzebny do zabicia drobnoustrojów w określonej temperaturze i określonym podłożu
Punkt śmierci cieplnej
temperatura zabijająca komórki w ciągu 10 minut
Alkohol etylowy (etanol)
- To inhibitor wzrostu uszkadzający mitochondrialne DNA w komórkach drożdżowych oraz inaktywuje niektóre enzymy (heksokinazy, dehydrogenazy)
- Wpływa również na organizację lipidów błon oraz zaburza funkcje transporterów. Prowadzi to do zwiększenia przepuszczalności błony komórkowej i zmian gradientu elektrochemicznego
- Etanol silnie oddziałuje z cząsteczkami wody, odciągając je od białek kwasów nukleinowych i polisacharydów oraz zakłóca ich aktywność fizjologiczną
Stres etanolowy
• Pod wpływem szoku etanolowego u szczepów opornych następuje zwiększanie stosunku ergosterolu do fosfolipidów oraz poziomu fosfatydylocholiny, a obniżeniu ulega zawartość fosfatydyloetanoloamina, a także następuje wzrost ilości nienasyconych kwasów tłuszczowych
• Stres etanolowy indukuje
o ekspresję genów TPS1 i TPS2 odpowiedzialnych za produkcję białek szlaku trehalozy
Trechaloza pełni fukncję ochroną i determinuje oporność na etanol
o Ekspresję białek szoku termicznego – Hsp104p, Hsp70p i Hsp26p przez działanie etanolu o stężeniu do 10%
o ekspresję białka Hsp30p, które negatywnie reguluje H+ATP-azę błonową
• ekspresja genów odporności na etanol znajduje się pod kontrolą czynników Msn2/4p
Wrażliwość drożdży na pH
- drożdże wydajniej rosną na pH kwaśnym niż w warunkach neutralnego lub alkalicznego pH
- alkalizacja środowiska zaburza homeostazę składników odżywczych, wpływa na ekspresję genów pobierania metabolizmu glukozy
- wysokie pH powoduje przejściowy spadek stężenia cAMP oraz zahamowanie aktywności kinaz PKA. W wyniku inhibicji PKA czynniki Msn2/4p ulegają szybkiej akumulacji w jądrze komórkowym oraz aktywują geny odporności na stres, związane z syntezą trehalozy i aktywują gen ENA1 (ATPaza sodowa)
- pH wpływa na aktywność enzymów w błonie komórkowej drożdży – H+ATPazy błony komórkowej, która jest odpowiedzialna za gradient elektrochemiczny błony, integralność oraz transport substancji odżywczych do komórki
