Protéines cours 8 - Techniques immunologiques (Martin) Flashcards
Quelle molécule est marquée dans un dosage compétitif et non compétitif? (immunoessais pour doser un analyte, pas un Ab)
- Compétitif : Ag*
- Non-compétitif : Ab*
Vrai ou faux : Les méthodes immunométriques sont des immunoessais qui utilisent 2 Ab dans la méthode
VRAI
Quelle est la différence entre un immunoessais en phase homogène et en phase hétérogène?
Phase homogène :
- Phase liquide
- Aucune séparation requise
- Plus rapide
- Plus facile à automatiser
Phase hétérogène :
- Phases solide/liquide
- Étapes de séparation du complexe immun marqué du marqueur libre
- Lavage
- Précipitation
- Plus long
Vrai ou faux : Les immunoessais compétitifs ont toujours une relation inversement proportionnelle
FAUX
TRÈS majoritairment inversement proportionnel, mais pas toujours
Quel est le principe d’un radioimmunoessai (RIA)?
Utilisation d’un isotope radioactif pour détecter et quantifier la réaction immunologique Ac-Ab
- Courbe réponse : % de lié sur total (inversement prop)
Quels sont les avantages du RIA?
Avantages RIA :
- Meilleure sensibilité analytique que la néphélométrie
- Peu d’effet de HIL sur le signal
- Marquage a peu d’effet sur les molécules
- Ab conserve son immunoréactivité lorsque marqué
- Ag est faiblement altéré par le marquage radioactif
Quels sont les désavantages du RIA?
Désavantages RIA :
- Phase hétérogène requise (séparation nécessaire)
- Réactifs instables (t1/2 des radioisotopes)
- Surveillance étroite de la courbe d’étalonnage
- Validation biochimiste
- Hétéroscédasticité
- Technique manuelle
- répétitif : blessures techno
- Formation
- Délai de réponse
- Retrait préventif
- Permis et mesures de radioprotection
- Gestion des radioisotopes (déchets, stockage, …)
- Besoin d’un compteur gamma
- Alternativec non-isotopiques encouragées (ALARA)
- Fournisseurs ont abandonné trousses
Qu’est-ce que l’hétéroscédasticité (immunoessais)?
CV variable le long de la courbe réponse
- EN opposition avec homoscédasticité : même précision, même SD sur toute la courbe
Quel est le principe analytique d’un dosage immunoenzymatique (EIA)?
Méthode qui utilise la propriété catalytique d’une enzyme pour détecter et quantifier la réaction immunologique Ab-Ag
- Des conjugués stables Ab-Enzyme ou Ag-Enzyme doivent être préparés sans altérer la réactivité immunologique
- Production d’un signal via l’activité enzymatique du marqueur
- Production d’un produit détectable par photométrie
Nommer les marqueurs enzymatiques les plus utilisés pour les immunoessais enzymatiques (EIA)
- Horse Radish Peroxidase
- Phosphatase alcaline
- Bêta-galactosidase
- Glucose-6-phosphate déshydrogénase
Nommer 3 types de dosage immunoenzymatique (EIA)
-
CEDIA : Cloned enzyme donor immunoassay
- bêta-galactosidase
- Homogène
-
EMIT : Enzyme multiplied immunoassay technique
- Glucose-6-phosphate déshydrogénase
- Homogène
-
ELISA : Enzyme-linked immunosorbent Assay
- Hétérogène
Décrire le principe et les caractéristiques d’un immunoessais EMIT
EMIT : Enzyme multiplied immunoassay technique
- Un Ag est marqué avec une enzyme
- Lorsque Ag* lié à Ab (Ag*-Ab), l’enzyme n’a pas d’activité (aucun signal)
- Lorsque l’analyte est présent (Ag), il y a compétition et libération de Ag* de Ab lié. Production de signal
- Signal inversement proportionnel
- Méthode en phase homogène
- Méthode compétitive
*Surtout utilisé pour dosage Rx et dépistage drogues de rue (urine)
Nommer quelques avantages et inconvénients de la méthode EMIT (immunoessais)
Avantages :
- S’adapte aux analyseurs de chimie générale (photométrie)
- Fabrication peu couteuse
- Largement utilisée
Désavantages :
- Dosage limité aux petites molécules (Rx, stéroïdes, vitamines)
Décrire le principe et les caractéristiques d’un immunoessais CEDIA
CEDIA : Cloned enzyme donor immunoassay
- L’enzyme est en 2 fragments. Elle devient active lorsque les 2 fragments sont réunis
- bêta-galactosidase ou phosphatase alcaline
- 1 fragment est lié à Ag (ED-Ag)
- Si ED-Ag est lié à un Ab, pas de signal
- Analyte compétitionne avec ED-Ag pour Ab.
- Signal directement proportionnel [analyte]
- Méthode homogène compétitive
*Méthode possible grâce au génie génétique (clonage)
Quel est le principe et les caractéristiques d’un ELISA?
2 principes possibles :
- Ab lié à support solide et Ag* compétitionne avec analyte. (COMPÉTITIF)
- Ag lié à support solide (via Ab) et utilisation d’un Ab* (formation d’un sandwich, NON-COMPÉTITIF)
Dans tous le cas, c’est un immunoessais hétérogène
Nommer quelques avantages et inconvénients des ELISA
Avantages :
- Essais adaptés aux immuno-analyseurs à haute cadence
Désavantage :
- essai hétérogène : Plus long!
Vrai ou faux : Les méthodes photométriques sont plus sensible que les méthodes non-chromogéniques (fluorescence, chimiluminescence)
FAUX
Chimiluminescence et fluorescence parmi les méthodes de détection des plus sensibles!
Qu’est-ce que la luminescence?
Phénomène d‘émission de photons à partir d’un atome ou d’une molécule dans un état électronique excité. En retournant à son état fondamental à partir de son état excité, l’énergie perdue se transforme en photon
- Bioluminescence : É produite par rxn enzym dans des organismes vivants
- Chimiluminescence : É est apportée par une rxn chimique exothermique
- Photoluminescence : É provient de l’absorption de photon (inclu fluorescence et phosphorescence)
Quel est le principe d’un immunoessai immunofluorescent (FIA)?
Utilisation d’un marqueur fluorescent pour détecter et quantifier la réaction immunologique (Ab-Ag)
- Fluorophore est excité à une longueur d’onde donnée (courte et énergétique) et réémet à une longueur d’onde plus longue et moins énergétique
- Méthode en phase homogène
Nommer des fluorphores pouvant être utilisés en immunofluorescence
- Fluorescéine
- Rhodamine
- Europium
Nommer 2 méthodes d’immunofluorescence utilisées en immunoessais
- Fluorescence polarisée (FPIA)
- Time-resolved fluorescence
Quels sont le principe et les caractéristiques des dosages FPIA?
FPIA : Fluorescent polarisation immunoassay
- Mesure d’émission de fluorescence polarisée lorsque fluorophore excité avec lumière polarisée
- Ag* (*=fluorophore) seul = fluorescence non-polarisée (rotation libre)
- Ag*+Ab=Ag*-Ab : Émission de fluorescence polarisée (rotation lente)
- Analyte compétitionne avec Ag* pour Ab
- Signal inversement proportionnel [analyte]
- Méthode compétitive homogène
Quel est le principe d’un dosage en immunochimiluminescence?
Utilisation d’un marqueur chimiluminescent pour détecter et quntifier la réacrtion immunologique (Ag-Ab)
Nommer 2 marqueurs utilisés en immunochimiluminescence
- Ruthénium
- Ester d’acridinium
Quel est le principe et les caractéristiques de la méthode ECLIA?
ECLIA : Electrochimiluminescence immunoassay
- Immunoessais hétérogène non-compétitif
- 2 Ab spécifiques à Ag : Formation d’une sandwich
- Liaison à un support solide (billes magnétiques avec streptavidine)
- “quasi-homogène”
- Complexe immun concentré vers une électrode (particule paramagnétique) : oxydation du * et Émission lumière
- Ruthénium émet de la lumière
(!) Aussi possible d’être compétitif
Quel est le principe et les caractéristiques d’un immonoessai LOCI?
LOCI : Luminescent Oxygen Channeling Immunoassay
- Homogène non compétitif
- 2 Ab qui reconnaissent Ag
- 1 Ab lié à une particule “sensibilisateur”
- 1 Ab lié à une particule chimiluminescente
- Lorsque particules sensibilisateur et chimiluminescente à proximité via liaison Ab:Ag:Ab, signal luminescent
- Irradiation UV pour produire oxygène singulet
- O2 singulet active particule chimiluminescente et produit chimiluminescence (mesurée)
- Directement proportionnel
Quel système de pontage est largement utilisé dans l’architecture de plusieurs techniques immunologiques pour fixer l’Ab ou l’Ag* à un support solide?
Biotine-streptavidine
Vrai ou faux : La biotinylation des protéines ou des petites molécules ne change pas ou très peu leur activité biologique et leur immunoréactivité
VRAI
Pourquoi la normalisation des méthodes de dosage est-elle importante?
La normalisation est importante pour :
- Évaluer et suivre la concentration d’un constituant A chez un patient dans n’importe quel labo
Quelles sont les difficultés auxquelles nous faisons face et qui limitent la normalisation des méthodes de dosage?
- Conditions pré-analytiques différentes
- Appareils différents
- Principes d’analyse différents
- VR différentes
- Unités de meure différentes
Pourquoi faut-il normaliser les méthodes de dosage (s’harmoniser)?
- Traçabilité métrologique
- Justesse de mesure
- Accréditation
- Comparabilité des résultats et des VR
- Guides de pratique cliniques (seuils de décision médicale)
- Sécurité des Ptx
- Confiance du public
- Harmonisation SIL et DSQ
Que devrait-on harmoniser dans nos laboratoires?
- Protocoles de laboratoire
- Technologie, traçabilité et commutabilité
- Prélèvement, stabilisation et conservation des éch
- Rapport d’analyse et transmission des résultats
- Nom des tests
- Unités, VR, Vc
Qu’est-ce que la traçabilité métrologique?
Propriété d’un résultat de mesure selon laquelle ce résultat peut être relié à une référence (étalon international, matériel de référence) par l’intermédiaire d’une chaîne ininterrompus et documentée d’étalonnages sont chacun contribue à l’incertitude de mesure
- Chaine de traçabilité métrologique : Succession d’étalons et d’étalonnages qui est utilisée pour relier un résultat de mesure à une référence
Qu’est-ce qu’un matériel de référence?
Matériau dont les propriétés physiques et/ou chimiques sont suffisamment bien déterminées pour permettre son utilisation dans :
- Étalonnage des instruments
- Validation des méthodes
- Assignation de valeurs (fabricants)
- Évaluation de la comparabilité de résultats
Qu’est-ce qu’un matériel de référence certifié?
Matériel de référence certifié : Matériel de référence accompagné d’une documentation délivrée par un organisme faisant autorité et fournissant une ou plusieurs valeurs de propriétés spécifiées avec les incertitudes et les traçabilités associées
Qu’est-ce que la commutabilité d’un matériau de référence?
Propriété d’un matériau de référence qui indique dans quelle mesure le matériau imite les caractéristiques d’échantillons cliniques typiques dans les procédures de mesure pour un mesurande indiqué
**Même justesse que s’il s’agit d’un échantillon patient (pour avoir confiance en nos contrôles!)
**CQi/e doivent être commutables aux échantillons patients!
Nommer des substances interférentes endogènes pour les immunoessais
- Hémolyse
- Ictère
- Lipémie
- Ab et Auto-Ab anti-analyte
- Protéine de liaison
- Ab hétérophiles
- HAAA : Ab humaine anti-animaux
- Réactivité croisée (molécules apparantées)
Nommer des substances interférentes exogènes pour les immunoessais
- Additifs ajoutés aux échantillons en cours d’analyse
- Ab administrés aux Ptx (Tx)
- Rx
- Suppléments alimentaires et produits naturels
- Substances radioactives ou fluorescentes présentes dans l’échantillon
- Rémanence (carryover)
- Additifs utilisés dans la fabrication des tubes de prélèvements
Vrai ou faux : L’effet crochet est une interférence qui peut arriver avec tous les types d’immunoessais
FAUX
- Essais immunométriques (non-compétitifs)
- Néphélémétrie
- Turbidimétrie
Que sont les Ab hétérophiles?
Ab qui réagissent contre différentes parties de l’Ab réactif de la méthode immunologique (faible affinité)
- Ab naturels ou auto-immuns
Qu’est-ce qu’un Ab idiotypique?
Ab qui reconnait la partie Fab de l’Ab de la méthode
- Interférence avec la partie des sites de liaison à l’Ag
Quels types d’ab hétérophiles peuvent causer des interférences?
- Facteur rhumatoïde
- Ab itiodype
- Ab anti-animaux
Quel est le mécanisme d’interférence causé par les Ab hétérophiles et les Ab anti-animaux?
- Peuvent interférer en créant un pont entre l’Ab de capture et l’Ab marqué (fausse augmentation)
- Peuvent interférer en neutralisant un ou les 2 Ab empêchant leur réaction (fausse diminution)
Comparer les Ab hétérophiles et les Ab anti-animaux (blocage de l’interférence)
Ab anti-animaux :
- Interférence plus facile à bloquer
- Ajouter aux réactifs des protéines sériques de même source animale que celle des Ab
Ab hétérophiles :
- Interférences plus difficiles à bloquer
- Ab peuvent réagir avec plusieurs types d’Ab
Comparer les Ab hétérophiles et les Ab anti-animaux (provenance/origine)
Ab anti-animaux :
- Ab spécifiques produits chez des individus après une exposition à des préparations d’origine animale ou suite à un contact prolongé avec des animaux
Ab hétérophiles :
- Ab naturels non spécifiques présents chez tous les individus
- Certains types sont associés à des maladies auto-immunes
Comparer les Ab hétérophiles et les Ab anti-animaux (spécificité/affinité)
Ab anti-animaux :
- Ab dirigés spécifiquement contre les protéines d’espèce animale en cause
- Affinités élevées
- Peuvent interférer dans tous les types d’IE
Ab hétérophiles :
- Ab de faible affinité
- Généralement pas spécifiques
- Interfèrent surtout dans les Ie de type immunométriques
Quelle est la fréquence estimée des Ab hétérophiles?
Environ 0,05%. Peut être plus, peut être moins
- Dépend aussi de la population/clientèle de l’hôpital
- Ex : beaucoup de maladie auto-immune, hopital en région avec des agriculteurs…
Comment détecter une interférence?
- Dépister l’erreur
- Résultat incohérent avec la clinique (CLINICIEN)
- Dilutions sériées qui ne concordent pas (LABO)
- Différente avec une autre technique
- Confirmer le bon résultat
- Résultat alternatif conforme à la clinique
- Éliminer l’interférence
- Techniques physiques ou agents bloquants
- *Certaines compagnies ont déjà des agents bloquants dans leur préparation
- Techniques physiques ou agents bloquants
Comment éliminer les interférences hétérophiles?
- Par élimination des Ab avant dosage
- Ultracentri
- Chauffage 90°C
- PEG
- Par blocage non-spécifique des Ab pendant le dosage
- Globulines non immunes
- Sérum animal (> 2 espèces)
- Dilution sériées avec sérum animal
- Par blocage spécifique des Ab pendant le dosage
- Ig anti Ab hétérophile et HAMA
- IgG monoclonales de souris anti IgM humaines
Nommer des interférences possibles avec le système indicateur (sinal) en IE
- Radioactivité dans le spécimen
- Augmentaiton pathologique de l’enzyme utilisée dans un EIA (Ex : PAL)
- Ab anti-ruthénium
- Substances fluorescentes ou atténuantes en FIA
- Substances atténuantes dans les CIA
Discuter de l’interférence de la biotine avec les dosages hormonaux
Biotine exogène peut interférer avec le système de détection utilisant la liaison biotine-streptavidine
- Interférences peuvent causer des profils pathologiques!
- TSH dosée en sandwich. Biotine = fausse diminution du signal. Signal directement proportionnel. TSH diminuée
- T4L dosée en compétitif. Biotine = fausse diminution du signal. Signal inversement proportionnel. T4L augmentée
- Dx d’hyperthyroïdie crée par une interférence à la biotine!!!
Quelles sont les utilisations pharmacologiques de la biotine?
- Déficience génétique en biotinidase
- Maladies métaboliques mitochondriales
- Crampes chez les hémodialysés
- Sclérose en plaque évolutive
- Syndromes de malabsorption
- Nutrition parentérale totale
