Prot Et Purification 2 Flashcards
Principe chromatographie d’affinité ?
Utilisa la spécificité de reconnaissence entre un protéine et son ligand
→ inconvénien : nécessite de connaîtrepartenaire / ligand de la protéine
Chromatographie d’affinité = immune absorption ?
L anticorps est immobilisé sur un support
Elution à pH acide
Avantage: 1 étape
Désavantage: nécessite une purification préalable
(anticorps dans ce cas)
Chromatographie d’affinité = Les étiquettes (ou tags) ?
- «Tag His-6 » étiquette de 6 histidines
Interaction spécifique avec le nickel
Elution par l’imidazole - GFP (green fluorescent protein)
- «Flag peptide» octapeptide
Interaction spécifique avec un Ac
Principe chromatographie hydrophobe ?
Interactions hydrophobes entre la résine et les acides aminés hydrophobes de la protéine
Principe chromatographie d’exclusion de taille ?
Les protéines sont séparées selon leur taille (masse moléculaire)
Aussi appelée chromatographie par gel filtration :
- Les protéines + petites passent dans tous les pores et vont moins vite
- Les protéines + grosses ne peuvent pas entrer dans les pores et sortent plus vite
- Une protéine de taille moyenne entre dans une partie des pores
Loi de Beer-Lambert ?
A = ε.c.l
A = absorbance à 280 nm
ε = coeff d’extinction M-1.cm-1 ou (g/L)-1.cm-1 on %.cm-1 ( avec % : g/100mL)
On déduit la concentration de protéine dans la solution en fonction de quoi ?
en fonction de la quantité de lumière absorbée
Electrophorèse sur gel de polyacrylamide ?
du % d’acrylamide =>
séparation de molécules de + en + petites
Migration dans un champ électrique
Electrophorèse en gel natif ?
Séparation selon la charge et la masse moléculaire (MM)
Les protéines qui migrent le plus sont :
- Chargées négativement
- De faible MM
Coloration des bandes de protéines avec :
* Bleu de Coomassie (+ courant)
* Nitrate d’argent (+ sensible)
Electrophorèse en gel dénaturant et réducteur ?
On dénature les protéines avec un détergent : le SDS
En général, on réduit aussi les ponts disulfures
• Toutes les protéines sont chargées négativement.
• Migration uniquement selon le poids moléculaire.
Isoélectrofocalisation ?
- Création d’un gradient de pH dans le gel
- Séparation des protéines en fonction du pHi
Objectifs d’un protocole de purification ?
- Bon rendement
- Bon degré de pureté
- Conserver structure et fonction intactes
- Utiliser des techniques :
- reproductibles
- rapides et faciles à mettre en œuvre
A chaque protéine peut correspondre un protocole différent !
