Prot Et Purification 1 Flashcards
Les différentes matières vivantes à partir desquelles on peut extraire des protéines ?
Tissus animaux, sang, plantes, microorganismes
Récupération des cellules à partir d’un milieu de culture par ?
filtration ou centrifugation
purification d’une protéine d’intérêt avec ?
Purification avec des méthodes de fractionnement utilisant les différentes propriétés physico- chimiques de la protéine pour l’isoler des autres constituants macromoléculaires cellulaires
Les différentes propriétés physico-chimiques de la protéine utilisées pour la purification ?
- Solubilité
- Charge ionique
- Taille moléculaire
- Propriétés d’adsorption et de liaison spécifiques à d’autres macromolécules biologiques
Propriété physico-chimiques d’une protéine d’intérêt ?
- solubilité
- Charge ionique
- Taille, poids moléculaire
- spécificité
Technique de séparation d’une protéine d’intérêt ?
- précipitation
- Chromatographie échangeuse d’ions
- Ultracentrifugation
-chromatographie par gel filtration - chromatographie d’affinité
Technique d’analyse d’une protéine d’intérêt ?
- Électrophorèse
- isoélectrofocalisation
- Électrophorèse
Comment doivent être les protéines tout au long de la purification ?
il faut conserver les protéines dans un état fonctionnel tout au long de la purification
mécanismes qui mènent à l’inactivation des protéines ?
- Dénaturation
- modifications d’aa essentiels à l’activité
- protéolyse
Dénaturation des protéines ?
des protéines par des conditions extrêmes de ToC, pH ou sels ou par des agents
dénaturants (urée, solvants).
La dénaturation mène à une perte de structure, donc d’activité.
Solution : utiliser une solution tampon avec pH (exemple phosphate à pH 7,1), à température donnée (en
général 4∘C), sans dénaturants
Modifications d’aa essentiels à l’activité ?
Ex: Action de l’O2 et ses dérivés => oxydation de Cys et Met
Solution : utiliser des agents réducteurs
Protéolyse ?
Protéolyse par les protéases => hydrolysent des liaisons peptidiques
Solution: utiliser des inhibiteurs de protéases
Les étapes grossières de purification ?
( Domination du volume de échantillon)
- centrifugation
- centrifugation différentielle
- précipitation (pH, sels d’ammonium)
- dialyse
À chaque étape, on doit s’assurer de quoi par rapport à la présence de la protéine d’intérêt ?
De la présence de :
- activité biologique (si enzyme)
- pureté (électrophorèse)
- quantité (dosage des protéines)
Si protéines intracellulaires nécessité de quoi ?
nécessité de rompre les membranes = lyse cellulaire
Lyse cellulaire méthodes ?
• Méthodes douces :
- choc osmotique (globule rouge)
- traitement au lysozyme (bactérie): digère la paroi bactérienne
• Méthodes fortes :
- presse de French (pression)
- sonication (ultrasons)
Séparation des débris cellulaires et protéine d’intérêt après lyse par ?
Centrifugation
Techniques de précipitation ?
En fonction de la solubilité de la protéine d’intérêt selon différentes conditions: pH, Température, Force ionique (i.e. concentration en sels).
Utiliser des conditions expérimentales permettant de précipiter de nombreuses de protéines de l’extrait brut, tout en laissant la protéine d’intérêt en solution (ou l’inverse)
Que permet la technique de précipitation ?
Permet de se débarrasser d’une bonne partie des «cochonneries » ou contaminants présentes dans l’extrait brut.
Précipitation en fonction du pH ?
(précipitation fractionnée)
Principe : solubilité des protéines minimale au pHi
Précipitation en fonction du sel ?
(précipitation fractionnée)
Principe : on diminue la quantité d’eau disponible pour solubiliser les protéines
Les sels ajoutés prendront la place de l’eau autour de la protéine et neutraliseront les charges des chaînes latérales de la protéine.
Ces deux évènements favoriseront l’agrégation et la précipitation des protéines
Précipitation en fonction du sel ?
(précipitation fractionnée)
Principe : on diminue la quantité d’eau disponible pour solubiliser les protéines
(Ex: Sulfate d’ammonium concentré AmSO4: (NH4)2SO4)
Dialyse ?
Extrait protéique dans un sac de dialyse
(= membrane avec des pores +/- grands)
Seuil de rétention ~ 5 kDa :
Les protéines sont retenues, les sels passent
Elimination des petites molécules de l’extrait protéique
Inconvénient : augmentation du volume final (dilution)
La chromatographie permet quoi ?
permet de séparer les molécules en fonction de leur affinité pour la phase stationnaire ou la phase mobile
