Photometrie Flashcards
Was sind die Hauptanwendungsbereiche der Photometrie?
- Qualitative Bestimmung der Absorbtion zur Identifizierung
- Quantitative Bestimmung der Konzentration mittels Eichkurve oder bekanntem ε
- Kinetische Messungen zur Bestimmung der Enzymaktivität
Auf welchem Prinzip basiert die Photometrie?
Monochromatisches Licht wird durch eine farbige, flüssige Probe geleitet und die Absorbtion dieses Lichtes durch die Farbstoffe bestimmt
- Absotion ist umso größer je höher die Farbstoffkonzentration ist
In welchem Wellenlängenbereich hält sich die Vis-Spektrometrie auf?
Im Spektrum des sichtbaren Lichts: 380-750nm
In welchem Wellenlängenbereich hält sich ein Photometer auf?
Häufig 340-700nm (erweiterter Bereich: UV 200-900nm)
Welche Besonderheit der Photometrie besteht, bezüglich der Absorbtion?
- die Absorbtion ist Wellenlängenabhängig
- die Lösung zeigt die Farbe des Restlichtes (Rote Lösungen absorbieren grünes Licht)
Aus welchen Bestandteilen besteht ein Photometer?
Lichtquelle, Kollektor, Monochromator, Filter, Küvette, Detektor, Anzeige
Erleutern Sie die Eigenschaften der Lichtquellen von Photometern!
- hohe Intensität bei kleiner Abmessung der Quelle
- weiter Spektralbereich
- keine scharfen Emissionsbanden die das Spektrum unterbrechen
- gleichmäßige Intensität
- lange Brenndauer mit geringen Kosten
- UV-Bereich: Wasserstoffhochdruck oder Deuteriumlampe
- Emissionsspektrum: 375nm - 250 (Glas) bzw. 375-160nm (Quartz)
Erleutern Sie die Eigenschaften des Monochromators von Photometern!
- teilt weiße Strahlung in ihre farbigen Anteile auf
- > durch Brechung durch ein Prisma oder Beugung am Gitter
- möglichst geringe Eigenabsorbtion
- große Genauigkeit bei der Wellenlängen-Auswahl
- Abgabe von monochromatischem Licht über ein weites Spektrum
Erleutern Sie die Eigenschaften der Probenkammer (mit Küvettenschacht) von Photometern!
- Aufnahme der Küvetten oder Durchflussküvetten
- Temperierung des Küvettenhalters mit Wasser oder Ethylenglykol-Lösung
- steuerbarer Kyvettenschlitten bzw. Rondell für mehrere Küvetten
- Vermeidung von Streulicht: schwarze, nicht reflektierende Farbe in der Probenkammer
- vor der Probenkammer: Breitbandfilter zum Abfangen des Streulichts
Erleutern Sie die Eigenschaften des Detektors von Photometern!
- (Multipler-)Foto-Verstärker-Röhre → Umwandlung des Lichtsignals in ein elektrisches Signal: in Geräten mit großem Spektralbereich → zwei Fotoverstärker: (200-600nm und 600-1000nm)
Erläutern Sie die Berechnung der Absorption!
Absorbtion = log(I_0 : I_1)
- monochromatisches Licht der Intensität I_0 IN die Küvette
- abgeschwächte Intensität I_1 AUS der Küvette
Geben Sie ein Bsp. an indem Sie eine Abschwächung um die Hälfte vorfinden.
A = log (2/1) = log(2)=0,3
Wie berechnet man die Transmission?
T=I_1/I_0
- YY
- > A = log(I_0/I_1) = -log(T)
Nennen Sie die Formel des Lambert-Beerschen-Gesetzes!
A = ε ∙ c ∙ d
A=Absorbtion (Extinktion)
c=Konzentration
ε=molarer Extinktionskoeffizient
d=Schichtdicke (in cm)
Wie führt man eine photometrische Messung durch?
- Wellenlänge einstellen
- Nullabgleich gegen Wasser oder Reagenziengemisch ohne Probe
Welche Fehlermöglichkeiten bei der photometrischen Messung gibt es?
Temperatur der Küvette → temperierbare Küvettenschlitten und vortemperierte Reagenzien
Küvettenfehler → ungleiches Absorptionsverhalten in den Küvetten
Durchführung der photometrischen Messung → Einstellung der Wellenlänge, Photometerabgleich gegen Wasser oder Reagenzgemisch ohne Probe
Wie legt man ein Absorbtionsspektrum an?
→ Messund der Absorbtion eines Chromophors bei verschiedenen Wellenlängen → graphische Darstellung (y-Achse: Absorbtion/ x-Achse: Wellenlänge)
Welche Informationen gibt das Absorbtionsspektrum? Welche bedeutung haben diese für die Praxis?
→ Spektrum dient zur Identifizierung einer chemischen Substanz durch Vergleich mit Spektren Bibliothek
→ Auswahl der Messwellenlänge nach maximaler Absorbtion der zu messenden Substanz
Welche Besonderheiten bezüglich der Absorbtion gibt es bei enzymatischen Reaktionen?
Substrate und Produkte vieler enzymatischer Reaktionen zeigen selbst keine Absorption
Welche Lösungen gibt es Bezüglich der Besonderheiten der Absorbtion der Enzymreaktionen?
- → Kopplung mit weiteren enzymatischen Reaktionen unter Beteiligung von Cofaktoren = Coenzyme (sehr gute Chromophore: NADH, NAD, NADP, NADPH)
- → Verwendung von künstlichen chromophoren Substraten
