Photometrie

Question 1

Was sind die Hauptanwendungsbereiche der Photometrie?

Answer 1

• Qualitative Bestimmung der Absorbtion zur Identifizierung
• Quantitative Bestimmung der Konzentration mittels Eichkurve oder bekanntem ε
• Kinetische Messungen zur Bestimmung der Enzymaktivität

Question 2

Auf welchem Prinzip basiert die Photometrie?

Answer 2

Monochromatisches Licht wird durch eine farbige, flüssige Probe geleitet und die Absorbtion dieses Lichtes durch die Farbstoffe bestimmt
- Absotion ist umso größer je höher die Farbstoffkonzentration ist

Question 3

In welchem Wellenlängenbereich hält sich die Vis-Spektrometrie auf?

Answer 3

Im Spektrum des sichtbaren Lichts: 380-750nm

Question 4

In welchem Wellenlängenbereich hält sich ein Photometer auf?

Answer 4

Häufig 340-700nm (erweiterter Bereich: UV 200-900nm)

Question 5

Welche Besonderheit der Photometrie besteht, bezüglich der Absorbtion?

Answer 5

• die Absorbtion ist Wellenlängenabhängig

- die Lösung zeigt die Farbe des Restlichtes (Rote Lösungen absorbieren grünes Licht)

Question 6

Aus welchen Bestandteilen besteht ein Photometer?

Answer 6

Lichtquelle, Kollektor, Monochromator, Filter, Küvette, Detektor, Anzeige

Question 7

Erleutern Sie die Eigenschaften der Lichtquellen von Photometern!

Answer 7

• hohe Intensität bei kleiner Abmessung der Quelle
• weiter Spektralbereich
• keine scharfen Emissionsbanden die das Spektrum unterbrechen
• gleichmäßige Intensität
• lange Brenndauer mit geringen Kosten
• UV-Bereich: Wasserstoffhochdruck oder Deuteriumlampe
• Emissionsspektrum: 375nm - 250 (Glas) bzw. 375-160nm (Quartz)

Question 8

Erleutern Sie die Eigenschaften des Monochromators von Photometern!

Answer 8

• teilt weiße Strahlung in ihre farbigen Anteile auf
• > durch Brechung durch ein Prisma oder Beugung am Gitter
• möglichst geringe Eigenabsorbtion
• große Genauigkeit bei der Wellenlängen-Auswahl
• Abgabe von monochromatischem Licht über ein weites Spektrum

Question 9

Erleutern Sie die Eigenschaften der Probenkammer (mit Küvettenschacht) von Photometern!

Answer 9

• Aufnahme der Küvetten oder Durchflussküvetten
• Temperierung des Küvettenhalters mit Wasser oder Ethylenglykol-Lösung
• steuerbarer Kyvettenschlitten bzw. Rondell für mehrere Küvetten
• Vermeidung von Streulicht: schwarze, nicht reflektierende Farbe in der Probenkammer
• vor der Probenkammer: Breitbandfilter zum Abfangen des Streulichts

Question 10

Erleutern Sie die Eigenschaften des Detektors von Photometern!

Answer 10

• (Multipler-)Foto-Verstärker-Röhre → Umwandlung des Lichtsignals in ein elektrisches Signal: in Geräten mit großem Spektralbereich → zwei Fotoverstärker: (200-600nm und 600-1000nm)

Question 11

Erläutern Sie die Berechnung der Absorption!

Answer 11

Absorbtion = log(I_0 : I_1)

• monochromatisches Licht der Intensität I_0 IN die Küvette
• abgeschwächte Intensität I_1 AUS der Küvette

Question 12

Geben Sie ein Bsp. an indem Sie eine Abschwächung um die Hälfte vorfinden.

Answer 12

A = log (2/1) = log(2)=0,3

Question 13

Wie berechnet man die Transmission?

Answer 13

T=I_1/I_0

• YY
• > A = log(I_0/I_1) = -log(T)

Question 14

Nennen Sie die Formel des Lambert-Beerschen-Gesetzes!

Answer 14

A = ε ∙ c ∙ d

A=Absorbtion (Extinktion)
c=Konzentration
ε=molarer Extinktionskoeffizient
d=Schichtdicke (in cm)

Question 15

Wie führt man eine photometrische Messung durch?

Answer 15

• Wellenlänge einstellen

- Nullabgleich gegen Wasser oder Reagenziengemisch ohne Probe

Question 16

Welche Fehlermöglichkeiten bei der photometrischen Messung gibt es?

Answer 16

Temperatur der Küvette → temperierbare Küvettenschlitten und vortemperierte Reagenzien

Küvettenfehler → ungleiches Absorptionsverhalten in den Küvetten

Durchführung der photometrischen Messung → Einstellung der Wellenlänge, Photometerabgleich gegen Wasser oder Reagenzgemisch ohne Probe

Question 17

Wie legt man ein Absorbtionsspektrum an?

Answer 17

→ Messund der Absorbtion eines Chromophors bei verschiedenen Wellenlängen → graphische Darstellung (y-Achse: Absorbtion/ x-Achse: Wellenlänge)

Question 18

Welche Informationen gibt das Absorbtionsspektrum? Welche bedeutung haben diese für die Praxis?

Answer 18

→ Spektrum dient zur Identifizierung einer chemischen Substanz durch Vergleich mit Spektren Bibliothek
→ Auswahl der Messwellenlänge nach maximaler Absorbtion der zu messenden Substanz

Question 19

Welche Besonderheiten bezüglich der Absorbtion gibt es bei enzymatischen Reaktionen?

Answer 19

Substrate und Produkte vieler enzymatischer Reaktionen zeigen selbst keine Absorption

Question 20

Welche Lösungen gibt es Bezüglich der Besonderheiten der Absorbtion der Enzymreaktionen?

Answer 20

1. → Kopplung mit weiteren enzymatischen Reaktionen unter Beteiligung von Cofaktoren = Coenzyme (sehr gute Chromophore: NADH, NAD, NADP, NADPH)
2. → Verwendung von künstlichen chromophoren Substraten