Molekularbiologische Techniken

Question 1

Was bedeutet PCR? Und Beschreiben sie das Prinzip

Answer 1

Polymerase –Kettenreaktion (PCR)

PCR-Prinzip:
1. Denaturierungsschritt (94°C): Trennung der beiden Stränge der Template-DNA

2. Annealingschritt (55°C primerabhängig): Hybridisierung der Oligonukleotidprimer an die einzelsträngige Template-DNA
3. Elongationsschritt (72°C, polymeraseabhängig): Verlängerung der Primer → Erzeugung doppelsträngiger Template-DNA

vielfache Wiederholung des Zyklus erzeugt vielfache Menge der ursprünglichen Template-DNA

Question 2

Definieren Sie den Begriff Elongationszeit!

Answer 2

• abhängig von Länge des erwarteten Produktes und von verwendeter Polymerase
• sollte Länge des erwarteten Produktes angepasst sein:
• zu kurz: Polymerase kann Job nicht beenden
• zu lang: Polymerase hat zu viel Zeit für „Unsinn“

• üblicherweise: 0,5 – 1 min je kb Länge bei Verwendung von Taq
2 min je kb Länge bei Verwendung von Pfu

Question 3

Definieren Sie den Begriff Annealingtemperatur!

Answer 3

• richtet sich hauptsächlich nach den Primern
• etliche Programme auf dem Markt (z.B. www.idtdna.com oder frodo.wi.mit.edu/) berechnen nicht nur die (theoretische) Schmelztemperatur (Tm) des Primers, sondern auch potentielle Sekundärstrukturen
• zur Berechnung existieren verschiedenste Gleichungen (unterschiedlich gut und unterschiedlich einfach)

Question 4

Definieren Sie die Elektrophorese!

Answer 4

• Gelelektrophorese trennt Makromoleküle auf Basis ihrer Wanderungsgeschwindigkeit unter Einfluss eines elektrischen Feldes
• bei DNA: Wanderungsgeschwindigkeit umgekehrt proportional zur Molekülgröße
• Nukleinsäuren tragen negative Ladung (an den Phosphatgruppen), deren Anzahl proportional zu ihrer Länge ist

Question 5

Welche Elektrophorese-Arten gibt es?

Answer 5

I. Agarose-Gelelektrophorese (Auftrennung von DNA)

II. SDS-PAGE

III. Native Gele

Question 6

Definieren Sie die Agarose-Gelelektrophorese !

Answer 6

1. verwendete Polymermatrix = Agarose
   Proben mit Mischungen von DNA-Molekülen werden in die Vertiefungen eines dünnen Agarose-Gels gefüllt. Durch den Laufpuffer wird an beiden Enden über Elektroden eine Spannung am Gel angelegt.
2. Die negativ geladenen DNA-Moleküle wandern auf die positiv geladene Elektrode (Anode) zu. Die Wanderungsgeschwindigkeit wird hauptsächlich durch ihre Länge bestimmt; längere Moleküle wandern langsamer durch das Gel.
3. Wenn der Strom abgeschaltet wird, sind die DNA-Moleküle in jeder Probe entlang einer „Spur“ nach Größe in Banden angeordnet. Die kürzesten Moleküle, die am weitesten gelaufen sind, bilden die Banden im unteren Teil des Gels.

Question 7

Definieren Sie die SDS-PAGE. Inkl. Wirkung!

Answer 7

SDS = Sodiumdodecylsulfat; PAGE = Polyacrylamid-Gelelektrophorese
• Analyse von Proteingemischen
• schnelle Molekulargewichtsbestimmung

Wirkung des SDS

• Bindung durch meisten Proteine zu negativ geladenen SDS-Protein-Komplexen mit konstantem Ladungs- zu Masse-Verhältnis (1,4 g SDS/g Protein in 1% SDS-Lösungen)
• Denaturierung von Proteinen
• Unterbindung von Protein-Protein-Wechselwirkungen
• SDS-Protein-Komplexe verschiedener Proteine unterscheiden sich nur noch in ihrer Größe und haben vergleichbare hydrodynamische Eigenschaften
• SDS-Protein-Komplex wandert im elektrischen Feld zum Pluspol
• Bei Wanderung: Molekularsiebeffekt einer porösen Polyacrylamidmatrix trennt SDS-Protein-Komplexe nach ihrem Stokes-Radius und damit ihrem Molekulargewicht auf
• Verschiedene SDS-PAGE-Systeme unterscheiden sich u.a. in verwendeten Puffern

Question 8

Was beinhaltet das Lammlisystem?

Answer 8

• am häufigsten verwendet
• diskontinuierliches System
• Verwendung von Tris-Glycin-Puffern
• Sammelgel (pH 6,8; 3-4 Acrylamid) überschichtet ein Trenngel (pH 8,8; 5-20% Acrylamid)
• Je länger Trenngel, desto besser Trennung
• Je dünner Gel, desto schöner die Banden und desto weniger kann geladen werden
• Prozentigkeit des Trenngels richtet sich nach Molekulargewicht der analysierten Proteine
• Gradientengele: breiterer Trennbereich und etwas schärfere Banden

Question 9

Definieren Sie die nativen Gele! (Vor- NAch-Teile usw.)

Answer 9

• Gelsysteme enthalten kein SDS
• Ladung der Proteine richtet sich nach isoelektrischem Punkt und pH-Wert des verwendeten Puffers
• im elektrischen Feld wandert Teil der Proteine zum Plus- der andere zum Minus-Pol
• Wanderungsgeschwindigkeit der Proteine abhängig von Größe, Ladung, Porösität der Gelmatrix und pH-Wert von Trenngel und Laufpuffer
• Vorteile:

 viele Proteine „überleben“ Elektrophorese → können in aktiver Form wieder aus Gel eluiert werden

 Manche Enzyme direkt im Gel durch enzymatische Reaktion nachweisbar
• Nachteile:

 Elektrophorese dauert Stunden

 hydrophobe (integrale) Membranproteine schmieren in konventionellen nativen Gelen

Question 10

Was ist Blotten?

Answer 10

• Elektrophoretische Übertragung von Proteinen eines SDS-Gels oder nativen Gels auf eine Membran
• Fixierung des Proteins genutzt für:

o Anfärbungen
o Ansequenzierungen
o Reaktion mit Antikörpern
o Umsetzung mit Enzymen
o Bestimmung von Derivatisierungen (Phosphorylierung? Glykosylierung?)

• Blotkammer: Halbtrockenzelle mit Platin/Edelstahl-Elektroden (früher: Kohle-Elektroden)

Question 11

Beschreiben Sie den Blottaufbau!

Answer 11

1. Blotter (angefeuchtet)
2. 3 Lagen in Blotpuffer getränktes Filterpapier
3. SDS-Gel (angefeuchtet)
4. Membran (angefeuchtet)
5. 3 Lagen in Blotpuffer getränktes Filterpapier
6. Blotter (angefeuchtet)