Chromatographie

Question 1

Definieren Sie die Chromatographie!

Answer 1

→ physikalische Methode bei der eine Trennung chemischer Substanzen durch die Verteilung zwischen einer ruhenden = stationären und einer bewegenden = mobilen Phase erlogt

Question 2

Beschreiben Sie die Funktionsweise der Chromatographie!

Answer 2

2 Phasensystem: stationäre und mobile Phase nicht mischbar, mobile Phase bewegt sich an stationärer vorbei

• transportiert gelöste Stoffe an der stationären Phase entlang
• unterschiedlich starke Wechselwirkungen der gelösten Stoffe mit der stationären Phase

Question 3

Beschreiben Sie das Trennprinzip der Chromatographie!

Answer 3

• verschiedene Stoffe haben unterschiedliche Wandergeschwindigkeiten, da ihre Aufenthaltswahrscheinlichkeiten in der stationären Phase unterschiedlich sind
• > art der Wechselwirkungen vom Molekül abhängig (Größe, Ladung, Löslichkeit)

Question 4

Welche Chromatographie-Techniken gibt es?

Answer 4

Papier-, Dünnschicht-, und Säulenchromatographie!

Question 5

Was beinhaltet die Säulenchromatographie?

Answer 5

• Glas- oder Metallsäule gefüllt mit stationärer Phase
• Probe wird oben aufgetragen und mit Hilfe der mobilen Phase durch die stationäre Phase bewegt
• Fluss der mobilen Phase mittels Überdruck
• am unteren Ende wird mobile Phase mit Probekomponenten aufgefangen

Question 6

Nennen Sie wichtige Aspekte/Punkte in der praktischen Anwendung der Chromatographie!

Answer 6

Probenvorbereitung: Sterilfiltration/Zentrifugation
- Entgasung der Sterilfiltration des Elutionsmittels

• Auflösungsverhalten einer Säule
• Durchflussgeschwindigkeit des Elutionsmittels

Question 7

Nennen Sie die verschiedenen Elutionsformen!

Answer 7

1. isokratische Elution: Lösungsmittel als mobile Phase
2. Gradienten-Elution: Veränderung des Elutionsmittels durch Mischung von 2 Elutionsmitteln, so dass Gradient entsteht (pH, Salz, Polarität)

Question 8

Wie entsteht ein Chromatogramm ? Was sind die Inhalte?

Answer 8

Durchflusszelle (UV/Vis-Photometer) misst die Absorption der eluierten Stoffe -> Schreiber-> Chromatogramm:

• eluierte Stoffe = Peaks
• Peakfläche : proportional zur Stoffmenge
• Elutionszeit= Retentionszeit (Zeit zwischen Probeninjektion und Peakmaximum)

Question 9

Wofür steht “HPLC”

Answer 9

High Performance Liquid chromatography

Question 10

Welche Vorteile hat die HPLC im Vergleich zu anderen chromatographischen Methoden?

Answer 10

• Automatisierung , hohe Auflösung, gute Reproduzierbarkeit, Schnelligkeit

Question 11

Wo findet die HPLC ihre Anwendung?

Answer 11

Labormedizinische Anwendung:

• klinische Chemie
• Endokrinologie , Toxikologie

Arbeitsmedizin:
- Antibiotika…

Question 12

Wie ist eine HPLC-Anlage aufgebaut?

Answer 12

Pumpe-> Einspritzsystem-> Trennsäule-> Detektor-> Auswertesystem

Question 13

Was sind die Besonderheiten der HPLC ?

Answer 13

• Trennpartikel mit kleiner Porengröße (3-10 mykrometer) in dünner Trennsäule-> relativ hoher Gegendruck beim Transport der mobilen Phase
• Teile ohne Totvolumen verbinden (Kapilarverbindungen) und Druckstabil bis 300bar

Question 14

Welche Eigenschaften hat eine Kolbenpumpe der HPLC?

Answer 14

• Hochdruckpumpen aus einem Exzenter mit variabler Drehzahl-> Antrieb des Kolben -> Ansaug- und Verdrängung mittels Kugelventilen
• > Doppelkolbenpumpen für konstante pulsationsfreie Strömung

Question 15

Welche Eigenschaften hat das Probenauftragsventil der HPLC?

Answer 15

• 6-Wege-Ventil

- Umschaltung zwischen Laden der Probeschleife und Injizieren auf die Säule möglich

Question 16

Welche Anforderungen bestehen an Detektoren der HPLC?

Answer 16

Hohe Messempfindlichkeit, geringe Veränderungen in der Basislinie, keine Bandenverbreiterungen, geringes Rauschen

Question 17

Was sind mögliche Ursachen für Rauschen der Detektoren der HPLC? und was kann man daraus entnehmen?

Answer 17

• Elektronik des Detektors
• Schwankungen der Umgebungstemperaturen
• Gasblasen im Eluentenstrom
• Änderungen des Durchflusses

Detektorrauschen bestimmt Nachweisgrenze: Signale die 3-6-fach größer sind als Rauschen, werden erkannt!

Question 18

Welche Detektorarten gibt es der HPLC gibt es ?

Answer 18

1. UV-Detektor:
   - häufigster Detektor: sehr empfindlich, großer linearer Bereich, relativ unempfindlich gegenüber Temperaturschwankungen
   Prinzip des UV/Vis-Spektrometers: Messung der Absorption durch die eluierte Substanz in Durchflussküvette mit kleinem Volumen
2. Photodiodenarray-Detektor:
   - besitzt viele kleine Photodioden
   - Prinzip : gleichzeitige Messung der Absorption bei verschiedenen Wellenlängen-> vollständiges Spektrum zu jedem Zeitpunkt des Chromatogramms-> 3D-Chromatogramme
3. RI-Detektor:
   - bestimmt Brechungsindex
   - relativ unempfindlich
   - empfindlich gegenüber Temperaturschwankungen (gute Thermostatisierung notwendig )
   - Anwendung bei Stoffen ohne UV-absorbtion (zb. Zucker)
4. Fluoreszens Detektor:
   - Zelle mit Anregungswellenlänge bestrahlt und ermitteltes, länger-welliges licht wird senkrecht zur einstrahlungsrichtung detektiert
   - Vorteil: Empfindlichkeit bis 1000x größer als mit UV-Detektoren
   - Nachteil große Zellvolumina
5. Elektrochemischer Detektor:
   - spurennachweis leicht oxidierbarer oder reduzierbarer organischer Verbindungen

Question 19

Was macht ein Fresnel-Refraktometer?

Answer 19

• > Fresnelsches-Gesetz: Die an einer Grenzfläche reflektierte Lichtmenge ist abhängig vom Einfallswinkel und den Brechungsindices beider Medien
• > Prinzip: Eingestrahltes Licht via Prisma durch Probe , Reflexion an Grundplatte durch das Prisma zur Photodiode
• > Vorteil: kleines Zellvolumen 3-5 mykroliter

Question 20

Was macht ein Ablenkungs-Refraktometer?

Answer 20

• > Zelle mit schräger Trennwand: eine Seite als Referenzzelle, andere Seite als Messzelle
• > Licht durch die Doppelzelle hin und zurück durch die Linse zur Photodiode
• > Vorteil : höhere Empfindlichkeit, größerer linearer Bereich
• > Nachteil: größeres Zellvolumen (8-10) -> Bandenverbreiterung bei schmalen Peaks