Chromatographie Flashcards
Definieren Sie die Chromatographie!
→ physikalische Methode bei der eine Trennung chemischer Substanzen durch die Verteilung zwischen einer ruhenden = stationären und einer bewegenden = mobilen Phase erlogt
Beschreiben Sie die Funktionsweise der Chromatographie!
2 Phasensystem: stationäre und mobile Phase nicht mischbar, mobile Phase bewegt sich an stationärer vorbei
- transportiert gelöste Stoffe an der stationären Phase entlang
- unterschiedlich starke Wechselwirkungen der gelösten Stoffe mit der stationären Phase
Beschreiben Sie das Trennprinzip der Chromatographie!
- verschiedene Stoffe haben unterschiedliche Wandergeschwindigkeiten, da ihre Aufenthaltswahrscheinlichkeiten in der stationären Phase unterschiedlich sind
- > art der Wechselwirkungen vom Molekül abhängig (Größe, Ladung, Löslichkeit)
Welche Chromatographie-Techniken gibt es?
Papier-, Dünnschicht-, und Säulenchromatographie!
Was beinhaltet die Säulenchromatographie?
- Glas- oder Metallsäule gefüllt mit stationärer Phase
- Probe wird oben aufgetragen und mit Hilfe der mobilen Phase durch die stationäre Phase bewegt
- Fluss der mobilen Phase mittels Überdruck
- am unteren Ende wird mobile Phase mit Probekomponenten aufgefangen
Nennen Sie wichtige Aspekte/Punkte in der praktischen Anwendung der Chromatographie!
Probenvorbereitung: Sterilfiltration/Zentrifugation
- Entgasung der Sterilfiltration des Elutionsmittels
- Auflösungsverhalten einer Säule
- Durchflussgeschwindigkeit des Elutionsmittels
Nennen Sie die verschiedenen Elutionsformen!
- isokratische Elution: Lösungsmittel als mobile Phase
- Gradienten-Elution: Veränderung des Elutionsmittels durch Mischung von 2 Elutionsmitteln, so dass Gradient entsteht (pH, Salz, Polarität)
Wie entsteht ein Chromatogramm ? Was sind die Inhalte?
Durchflusszelle (UV/Vis-Photometer) misst die Absorption der eluierten Stoffe -> Schreiber-> Chromatogramm:
- eluierte Stoffe = Peaks
- Peakfläche : proportional zur Stoffmenge
- Elutionszeit= Retentionszeit (Zeit zwischen Probeninjektion und Peakmaximum)
Wofür steht “HPLC”
High Performance Liquid chromatography
Welche Vorteile hat die HPLC im Vergleich zu anderen chromatographischen Methoden?
- Automatisierung , hohe Auflösung, gute Reproduzierbarkeit, Schnelligkeit
Wo findet die HPLC ihre Anwendung?
Labormedizinische Anwendung:
- klinische Chemie
- Endokrinologie , Toxikologie
Arbeitsmedizin:
- Antibiotika…
Wie ist eine HPLC-Anlage aufgebaut?
Pumpe-> Einspritzsystem-> Trennsäule-> Detektor-> Auswertesystem
Was sind die Besonderheiten der HPLC ?
- Trennpartikel mit kleiner Porengröße (3-10 mykrometer) in dünner Trennsäule-> relativ hoher Gegendruck beim Transport der mobilen Phase
- Teile ohne Totvolumen verbinden (Kapilarverbindungen) und Druckstabil bis 300bar
Welche Eigenschaften hat eine Kolbenpumpe der HPLC?
- Hochdruckpumpen aus einem Exzenter mit variabler Drehzahl-> Antrieb des Kolben -> Ansaug- und Verdrängung mittels Kugelventilen
- > Doppelkolbenpumpen für konstante pulsationsfreie Strömung
Welche Eigenschaften hat das Probenauftragsventil der HPLC?
- 6-Wege-Ventil
- Umschaltung zwischen Laden der Probeschleife und Injizieren auf die Säule möglich
Welche Anforderungen bestehen an Detektoren der HPLC?
Hohe Messempfindlichkeit, geringe Veränderungen in der Basislinie, keine Bandenverbreiterungen, geringes Rauschen
Was sind mögliche Ursachen für Rauschen der Detektoren der HPLC? und was kann man daraus entnehmen?
- Elektronik des Detektors
- Schwankungen der Umgebungstemperaturen
- Gasblasen im Eluentenstrom
- Änderungen des Durchflusses
Detektorrauschen bestimmt Nachweisgrenze: Signale die 3-6-fach größer sind als Rauschen, werden erkannt!
Welche Detektorarten gibt es der HPLC gibt es ?
- UV-Detektor:
- häufigster Detektor: sehr empfindlich, großer linearer Bereich, relativ unempfindlich gegenüber Temperaturschwankungen
Prinzip des UV/Vis-Spektrometers: Messung der Absorption durch die eluierte Substanz in Durchflussküvette mit kleinem Volumen - Photodiodenarray-Detektor:
- besitzt viele kleine Photodioden
- Prinzip : gleichzeitige Messung der Absorption bei verschiedenen Wellenlängen-> vollständiges Spektrum zu jedem Zeitpunkt des Chromatogramms-> 3D-Chromatogramme - RI-Detektor:
- bestimmt Brechungsindex
- relativ unempfindlich
- empfindlich gegenüber Temperaturschwankungen (gute Thermostatisierung notwendig )
- Anwendung bei Stoffen ohne UV-absorbtion (zb. Zucker) - Fluoreszens Detektor:
- Zelle mit Anregungswellenlänge bestrahlt und ermitteltes, länger-welliges licht wird senkrecht zur einstrahlungsrichtung detektiert
- Vorteil: Empfindlichkeit bis 1000x größer als mit UV-Detektoren
- Nachteil große Zellvolumina - Elektrochemischer Detektor:
- spurennachweis leicht oxidierbarer oder reduzierbarer organischer Verbindungen
Was macht ein Fresnel-Refraktometer?
- > Fresnelsches-Gesetz: Die an einer Grenzfläche reflektierte Lichtmenge ist abhängig vom Einfallswinkel und den Brechungsindices beider Medien
- > Prinzip: Eingestrahltes Licht via Prisma durch Probe , Reflexion an Grundplatte durch das Prisma zur Photodiode
- > Vorteil: kleines Zellvolumen 3-5 mykroliter
Was macht ein Ablenkungs-Refraktometer?
- > Zelle mit schräger Trennwand: eine Seite als Referenzzelle, andere Seite als Messzelle
- > Licht durch die Doppelzelle hin und zurück durch die Linse zur Photodiode
- > Vorteil : höhere Empfindlichkeit, größerer linearer Bereich
- > Nachteil: größeres Zellvolumen (8-10) -> Bandenverbreiterung bei schmalen Peaks
