Photobiophysik: fertig? (ZSM) Flashcards
was verseht man unter lichtabsorbtion und wie kommt diese zu stande?
Lichtspeicherung: biolog. moleküle absorbieren licht im bereich von 200-900nm über molekulare DB
- e- übergänge von pi -> pi*
- proteine und DNA (wellenlänge < 300nm), basen oder aromat. AS
- chromophore: retinal flavine, chlorophyll (tetrapyrole, wellenlänge 0 300nm) -> ausgedehnt pi-systeme
welche funktionen übernimmt licht in der natur/ im labor?
- energieversorgung (PS)
- informationsvermittlung (sensorische Photorezeptoren)
im Labor:
- Analytik (absorption, fluoreszenz)
- > alalyse von biomolekülen
Extiktion E
= abnahme der Lichtintensität
- berechnung mit dem lambert-beerschen-gesetzt
E = log(I_0/I) = epsilon(molarer extinktionskoeffizient) x c(onzetration) x s(chichtdicke) - je niedriger E, desto niedriger die lichtabnahme, desto größer ist der verlust (transmission)
- je höher E, desto höher die lichtabnahme, desto niedriger der verlust ( transmission)
lambert beersches gesetz
dient der berechnung der extinktion
E = log(I_0/I) = epsilon(molarer extinktionskoeffizient) x c(onzetration) x s(chichtdicke)
I_0: einfallende lichtintensität
I: verminderte lichtintensität nach druchdrinken des materials
Transmission
= anteil des lichtes, der bei durchgang durch die küvette nicht absorbiert wird (verlust)
T = I/I_0 oder über E = log(1/T)
- je niedriger T, desto höher die lichtabnahme, desto größer ist E
- je höher T, desto niedriger die lichtabnahme, desto niedriger ist E
Absolutspektrum
auftragung von E/sigma gegen lambda, dh die wellenabhängigkeit von sigma
- schwer zu realisieren, da photomultiplier und lichtquelle geeicht werden müssen
wie nennt man: auftragung von sigma/epsilon gegen lambda, dh die wellenabhängigkeit von sigma ?
Absolutspektrum
- schwer zu realisieren, da photomultiplier und lichtquelle geeicht werden müssen
wie nennt man: auftragung von E gegen lamda?
Relativspektren
- schwer zu realisieren, da photomultiplier und lichtquelle geeicht werden müssen
Absorptionsspektren
=Exzitationsspektren
- Sigma und Epsilon sind wellenlängenbereich abhängig
- Absolutspektren, molare Absolutspektren
- > schwer zu realisieren, da photomultiplier und lichtquelle geeicht werden müssen
- Relativspektren
realtivspektren
E gegen lambda -> relative wellenlängen-abhängigkeit von E
lambda in [nm oder 1/cm]
1/cm:Energie -> Spektren sind für die verschiedenen varianten eines chromophores gleich breit.
übergangsdipolmoment
maß für die fähigkeit eines atoms elektromagnet. strahlung zu absorbieren (maß für Ladungsumverteilung bei übergang)
M_12 = Summe{psi_2×mü× psi_1×dV
IC
internal conversion
- 10^-12s
- von S2 -> S1
- meist strahlungslose Rückkehr in den GZ
- Wärmeabgabe
ISC
intersystem crossing
- S In T
- 10^-8s
- von S1 -> T1
T1 = quantenmechanisch verboten, sehr langsam
- e- der energiereichen S-Zustände können durch spinumkehr in den energieärmeren, stabileren T-Z gebracht werden
Fluoreszenz
strahlende Inaktivierung
- 10^-9s
- von S1 -> S0
- spontan emittierte Strahlung klingt sofort wieder ab, wenn die anregende Strahlung abgeschaltet ist
- wenn die Inaktivierung n_2,v_1 -> n_1,v_3 strahlend erfolgt (fluoreszenz), ist die fluoreszenzwellenlänge langwellige verschoben (rot) gegenüber Der Absorption (blau) -> stokes shift
- die Intensität der Übergänge ist proportional dem Quadrat des Übergangszustandes
I_Abstand = |mü_ik|^2
Phosphoreszenz
= Primärprozess wie bei Fluoreszenz, jedoch mit Existenz eines triplettzustandes
= ist die Eigenschaft eines Stoffes, nach einem Beleuchten mit (sichtbarem oder UV-) Licht im Dunkeln nachzuleuchten. Ursache ist strahlende Desaktivierung.
- 0,1 -100s
-von T1 -> S0 (erfordert erneute Spinumkehr)
Absorbtion
- energieaufnahme
- 10^-15s
- von S0 -> S1 // S0 -> S2
jablonski diagramm
Darstellung verschiedener strahlenden/strahlungslosen Prozessen, die i Molekülen vorkmmen können
Absorbtion:
- energieaufnahme
- 10^-15s
- von S0 -> S1 // S0 -> S2
internal conversion:
- 10^-12s
- von S2 -> S1
- spin umkehr
Fluoreszenz:
strahlende Inaktivierung
- 10^-9s
- von S1 -> S0
intersystem crossing Übergang von S in T - 10^-8s - von S1 -> T1 - T1 = quantenmechanisch verboten, sehr langsam
Phosphoreszenz:
= ist die Eigenschaft eines Stoffes, nach einem Beleuchten mit (sichtbarem oder UV-) Licht im Dunkeln nachzuleuchten. Ursache ist strahlende Desaktivierung.
- 0,1 -100s
-von T1 -> S0
Fluoreszenz lebenszeit
k_tot = k_rad + k_ic + k_isc + k_rk
k: Geschwindigkeitkonstante
k_rad: Geschwindigkeitskonst. fürStrahlunsinaktivierung
zeitkonstante: tau_fl = 1/(k_rad + k_ic + k_isc + k_rk) = 1/k_tot
die summe aller inaktivierungsprozesse trägt zur überlebenszeit der fluoreszenz bei
tau_fl «_space;tau_rad
Fluoreszenz(quanten)ausbeute
phi_fl
= verhältnis emittierter photonen zu absorbeirten photonen
phi_fl = I_fl/I_abs
oder
phi_fl = tau_fl/tau_rad -> tau_fl = tau_rad x phi_fl
was bedeutet es wenn andere wege schneller sind als k_rad?
k_rad: Geschwindigkeitkonstante der strahlungsinaktivierung
- > lebenszeit von S1 = kurz
- > tau_fl klein (niedrige zeitkonstante der fuorenszenz)
- > phi_fl klein ( wenig fluoreszenzausbeute)
- >
Auswahlregeln für Uv-Vis-Spektroskopie
Spinverbot
Paritätsregel
Überlappungsverbot
Spinverbot
= keine Spinumkehr
(Übergangs)verbot von Singulett zu Triplettzuständen/ ungepaarten Elektronenspins
Paritätsregel
Nur Übergänge zwischen Molekülorbitalen erlaubt mit unterschiedlichen Symmetrieeigenschaften bzgl des Symmetriezentrums
übergang von pi zu pi: + -> - (VZWechsel/ungerade u)
übergang von pi zu pi*: + -> + (kein VZWechsel/gerade g)
-> Übergang ist möglich
Überlappunsverbot
Abstand zum Kern muss konstant/gleich sein!
Verboten sind Übergänge die nicht genügend überlappen
zB n/pi*- Übergnag in Carbonylverbindungen
Übergangsmoment mü_ik
Wahrscheinlichkeit für ein e- des Zustandes psi_i auf den Zustand psi_k überzugehen
mü_ik = e {psi_i |summe(r_n)| psi_k}
e: elementarladung
r: lokaler übergangsvektor
-> Berechnung unmöglich
Born-oppenheim-näherung
(Frank-codon-prinzip)
Welche Übergang ist am wahrscheinlichsten?
Annahme:
beim Übergang eines e- von S_0 nach S_1 bleiben die kernkoordinaten konstant, weil der Übergang schnell ist
Psi_mol = psi_n,v = psi_n(r,R) × k_n,v(R)
- R: konstante. Bri elektr. Anregung
- Psi: e-e-WW (Coloumb WW) + e-kern-WW
- K: kern-kern-WW
- n,v: elektronische und schwingungszustände (vibrational states)
FCF
Frank-codon-faktor
- abhängig von der Änderung der kern-Kern-gleichgewichtsabstände
- > je größer die Änderung (R_2 - R_1), desto stärker ändern sich die schwingungsniveaus v_n
Was beschreibt die elektronische Änderung der wellefkt?
Mü_ik =mü_el,ik × S_iv,kv’
S_iv,kv’: Frank-codon-faktor
Idealisiertes Moleküle als schwingender Ozillator mit nur einem kern-kern-abstand
Energetik
Der Übergang (Absorption) von n_1,v_1 -> n_2,v_3 ist größer als der Übergang von n_2,v_1 -> n_1,v_3
Stokes shift
wenn die Inaktivierung n_2,v_1 -> n_1,v_3 strahlend erfolgt (fluoreszenz), ist die fluoreszenzwellenlänge langwellige verschoben (rot) gegenüber Der Absorption (blau)
- die Intensität der Übergänge ist proportional dem Quadrat des Übergangszustandes
I_Abstand = |mü_ik|^2
Fluoreszenzspektren
Emisionsspektren
Fluoreszenzdepolarisation
Größenbestimmung von fluorophoren
- kleine Moleküle rotieren schnell
- Proteine rotieren langsam
1) anregen mit polarisiertem Licht I_FII
2) Messung der fluoreszenzdepolarisation
- Messung der fluoreszenzabnahme mit und ohne polarisationsfilter tau_dep = 1 / k_dep + k_rad
- vgl von tau_dep mit tau_f:
tau _dep < tau_f -> kleine Moleküle
tau_dep = tau_f -> große Moleküle
Große mol/Prot.: Strahlen polarisiertes Licht ab
Kleine mol: Strahlen depolar. Licht ab
Fluoreszenzquenching
Fluoreszenzlöschung = Reaktion mit biomolekülen, die die fluoreszenz reduzieren
- > GZ: statisches quenching
- > angeregter Z: dynam. Quenching
Was sind WW die biologische Moleküle mit Licht eingehen?
Absorption, streuung
Abnahme der Intensität in dr küvette
- exponentielle Abnahme
- I = I_0 × e^[-(Sigma × n × s)]
Sigma: proportionalitätsfaktor, der die absorptionswahrscheinlichkeut eines Moleküle angibt
n: teilchen/Volumen =1/cm^3
S: schichtdicke der küvette
Tau_f
Der gemessene fluoreszenzerfall einer Funktion aller inaktivierungsprozesse
K_tot
Fluoreszenzlebensdauer
Schwingender oszillator
Das angeregte e- landet im S2 zustand unter beibehaltung der kernkoordinaten
GFP
= Grün fluoreszierendes Protein
- aus fluoreszierenden zellen wurde lumineszenz-protein aequorin und GFP isoliert
- in Qualle: aequorin gibt E an GFP weiter, regt dieses entweder an oder aequorin inaktiviert mit blauer fluoreszenz
- wenn AQ-S1-E an GFP abgibt, fluoresziert es Grün, GFP inaktiviert durch Grüne fluoreszenz
- isoliertes GFP fluoresziert nach Anregung mit licht
Grün
- Sauerstoff abhängig -> ohne: keine fluoreszenz
- fluoresziert nur depolarisiert
- stark temperaturabhängig, braucht hohe T
- aus Beta faltblättern
Aequorin
Enthält coelentrazin als kofaktor
FRET
Förster resonance Energie Transfer
Donor* + Akzeptor
-> Donor gibt strahlungs Anregung an Akzeptor ab
- sehr stark distanzabhängig
- zur Untersuchung von protein-protein interaktionen
Dexter Energietransfer
Kollisionen Energie transfer
- abhängig von großer überlappung (distanz < 20nm)
Fermis goldene regel
Elektronenübertragung ist proportional der elektronischen Kopplung & linear proportional der kernkopplung
K_ET = 2×pi/h × |H_AB|^2 × FC
k: elektronische transferierte
h: plancksches wirkumsquantum
FC: Frank Cordon Faktor (kernkopplungselement)
|H_AB|: Elektron. Kopplungselement der wellenfkt
Wildtyp GFP
A Form: protonierte
B: Depot. Form
Warum ist die S2-Lebensdauer kürzer als die S1-LD?
da das E-Niveau höher ist, ist das bestreben des e- höher die E wieder abzustrahlen, daher kürzere verweildauer im S2
Welche Möglichkeiten gibt es die wellenfunktionen der 1s orbitale miteinander zu verknüpfen?
Addition- bindendes Orbital
Subtraktion- antibindendes Orbital
termschema für einfache Molekül-Orbitale
zwei Atomorbitale = eine Molekül-Orbital
UV-Vis-Absorbtionsbereich
200-800 nm
Was passiert mit den Elektronisch angeregten Zuständen?
1) strahlende Desaktivierung: energieüberschuss wird als Photon abgestrahlt (Fluoreszenz/Phosphoreszenz)
2) strahlungslose Desaktivierung: Energieumwandlung in Rotations/Schwingungs/Translationsenergie der Umgebendenmoleküle
Triplettzustand
(ungepaarte e- mit parallelem spin)
Haut-Sonnenschutz
Melaniozyten reagieren auf UV-Strahlung -> mehr Eumelanin-Produktion
Eumelanin: Kann UV-Licht absorbieren
