notas imp Flashcards
Caracteristicas que diferenciam as modificacoes epigeneticas das restantes alteracoes
- alt estrutura da cromatina ( e nao do dna)
- reversiveis
- padrao de metilacao mantem se na replicacao e mitoses
delecao inframe vs frameshift
inframe
- ins ou del numero bases mult de 3
- delecao ou ins de alguns aa mas resto da ptn igual
frameshift
- grelha de leitura alterada
- ptn diferente a partir desse ponto
- associada a ptn truncada e a perda de funcao
nao sabemos se o aa q falta na inframe é imp ou nao mas frameshift tem um impacto funcional pior pois a ptn e toda diferente a partir do ponto onde a variante ocorre
HAPLOINSUFICIENCIA
- alelo mutado da origem a perda de funcao da ptn e a ptn codificada pelo alelo normal é insuf p garantir a funcao da celula no organismo
- manif em heterozigotia
- só ocorre em genes sensiveis à dosagem genica ( nos restantes a doenca so ocorre se recessiva)
- heterogeneidade alelica frequente ( dif var em dif locais podem originar este mecanismo molecular, basta originarem perda de funcao de uma das ptn)
- ocorre por exemplo:
-nmd deteta codao stop prematuro e degrada esse mrna e 50% da ptn normal do outro alelo nao e suf
EFEITO DOMINANTE NEGATIVO
- ptn mutada é nao funcional e inibe a funcao da ptn normal
- associado freq a ptn que atuam como dimeros ou multimeros
- heterozigotia, com menos de 50% ptn normal
- associada a ptn truncadas (nonsense e frameshift) mas tmb a missense em localizacoes especificas de ptn multimericas
- nao ocorre se variante consistir na delecao completa do gene ( dai a variante missense ser pior que variante nula)
5 e 3 UTR
5
- extremo 5 mrna
- transcrito mas nao traduzido
- envolvido:
*mec epigeneticos
*lig aos ribossomas
*lig a ptn reguladoras
3
- ext final do mrna
- transc mas nao trad
- imp p:
*lig aos ribossomas
*eficacia da traducao e estabilidade
*ligacao a ptn reguladoras (ex: miRNA)
em ambos os locais:
- alt leva alt taxa de transcricao e na quantidade do produto
- lig a ptn na 5 inibe traducao e na 3 inibe degradacao do mrna
NGS VS SANGER
- NGS maior escala (milhares de fragmentos ao mm tempo, sendo possivel estudar varios pacientes ao mm tempo)
- NGS é quantitativo, sendo possivel quantificar mosaicismos de baixa expressao ( sanger nao consegue inf a 20%)
- NGS mais indicado para casos de heterogeneidade alélica ou de locus ( custo elevado e demasiado tempo de execução no sanger)
- Sanger mais ultilizada, pe, quando já sabemos a variante causadora (em estudos familiares)
UV e NER
- radiacao UV provoca dimero de pirimidinas, que leva a delecoes e apoptoses
- mecanismo de reparacao associado : NER ( que remove cerca de 30 nucleotidos) q entre outras coisas, remove dimeros
- associaco explica q mtacoes em genes do sistema NER estejam associados a cancro da pele
%
15 var estruturais
+90 mC em CpG e seq DNA repetitivo
45-50 DNA repetitico
2 de STR no genoma
1-2 genoma codificante (ou seja, q forma ptn, pq muito dna é transcrito mas fica por ai)
MUTACAO DINAMICA
- associadas a rep de tripletos
- quando rep passa um limiar, pode associar se a patologia
- DNA fica instavel e com tendencia p aumentar n rep das meioses maternas ( p geracao seguinte)
- 3 grupos de alelos:
*normais
*pre mutacao ( n de rep da instabilidade, pode expandir na meiose mas nao ha manif clinica) (no sexo feminino, associado falencia ovaria precoce; no sexo masculino associado a sindrome do tremor e ataxia)
*mutacao ( ha manif clinica) - expansao pode ocorrer por emparelhamento anormal por deslizamento durante replicacao
“mutacoes dinamicas sao STRs expandidos em locus especficos que atravessam um limiar de reps”
EXEMPLOS:
5 UTR - SINDROME X FRAGIL
- rep CGG em 5utr gene FMR1 (se +200 rep)
- hipermetilacao regiao reguladora
- ausencia de transcricao levando a defice de ptn
1 exao - doenca Huntigton
- doenca autossomica odminante
- rep CAG 1 exao gene HTT (patologico se mais d 36)
- forma seq poliglutamina terminal amina da ptn, ficando esta mais longa
- agregados dsa ptn no nucleo e citoplasma
- morte neuronios
- reducao peso cerebral
- !! doenca ocorre sempre por esta variante
3 UTR- distrofia miotonica tipo 1
- autossomica dominante
-CTG +50 em 3 UTR gene DMPK
-formacao estruturas na ansa da regiao expandida do mrna com aifnidade p ptn imp p splicing de outros genes
- causa sliciopatia de outros genes
motivos para ngs nao informativo
- Variante não é identificada pelo tipo de protocolo (inserção ALU, mutações dinâmicas, CNV´s);
- Eliminarmos a variante com os filtros que usámos (por exemplo, variante sinónima);
- Variante causal pode estar numa região não sequenciada1 (sem cobertura ou com pouca profundidade de cobertura);
mutacoes em regioes intergnicas podem fazer um gene distante nao se expressar
- há seq reguladoras com localização distante do gene (várias Kb, a montante ou a jusante do promotor principal), onde se ligam proteínas que regulam a transcrição, intensificando-a (enhancers) ou inibindo-a (silencers)
estudos de STRs com PCR seguido de eletroforese capilar
- ident numero de copias de cada str em cada alelo
- med forense ( regioes nao condficantes)
- dissomia uniparental
- gel de agarose nao distingue fragmentos com pequenas diferencas de nucleotidos por isso e que esta é melhor opcao (pg 15 sebenta pratica)
ncRNA: RNA nao codificante (exemplos)
-
miRNA :
-inibem traducao atraves do complexo miRISC ( associacao com ptn RISC), ligam se a ext 3 e destroiem o mRNA - LncRNA : regulacao da expressao genica nomeadamente epigenetica da transcricao,, inibindo-a
- CeRNA: transcritos não codificantes com efeito de captação/competição p miRNAs
mecanismo molecular associado a fenotipo dominante que habitualmente nao pse associe a heterogeneidade alelica
- tinha pensado em huntignton mas acho q doenca nao e bem um mecanismo molceular
- talvez efeito dominante negativo porque é frequenemente causado por nonsnese e var com frameshift, podendo tmb ser missense em ptn multimericas
como se deteta uma epimutação ( no caso, metilacao de citosinas)
- tratamento de dna com bissulfuto
- bissulfito de sodio reage com citosinas nao metiladas convertendo em U
- por sequenciamente, vemos quais a citosinas q estavam metiladas (continuam C) e as que nao estavam (no seq leem se T)
2 indicacoes para RT PCR
- extrair o mrna de celulas q expressem o gene (nem todos os genes sao de expressao ubiquitaria)
- localizacao dos primers (p nao amplificar dna):
-em exoes dif (mrna so com os exoes, dna com introes mt longos nao e amplificado)
-entre dos exoes consecutivos ( disposicao exclusiva do mrna, no dna sao introes)
inicio e fim:
-transcricao
-traducao
transcricao
- TSS (transcription starting site) até sinal poli A)
traducao
- codao iniciaçao ate codao stop
doenca monogenica
- doenca causada por uma alteracao num gene especifico
- variantes raras mas com elevada penetrancia
exemplos de doencas mono na pag39
relacao entre envelhecimento, perda de metilacao de transposoes e perde de expressao de genes supressores tumorais
- envelhecimento
- diminuicao da mCpG (especialmente a nivel dos transposoes)
- genoma instavel
(e neste caso em especifico)
- possibilidade de ins de um transposao perto gene supressor tumoral
- interferencia com regiao reguladora, pe, inibindo expressao do gene
associação CNV e patologia
- CNV intragenico com alt n copias de grandes sequencias intragenicas (englobando um ou mais exoes e introes)
- associado a ptn truncada ou ausencia de ptn (perda de funcao)
- elevada probabilidade de serem patologicas
- freq baixa na populacao
onde mutacoes sao mais ‘frequentes
regioes nao cosidifcantes
- nao sao transcritas logo nao sao reparadas c tanta freq p mec de reparacao
- acumulacao
polimorfismos não estão sempre na origem de ptn polimórficas
- mts sao silenciosos
- uns ocorrem em regioes intergenicas
perda de funcao de uma ptn associado a fenotipos dominantes ou recessivos
- maioritariamente a recessivos, isto pq maioria dos genes nao sao sensiveis a dosagem genica
- tmb se pode associar a dominantes (haplo e efeito dominante negativo
ganho de funcao associado a mutacoes em genes e locus…
especificos (baixa heterogeneidade alelica)
manutencao do perfil epigenetico
DNMT1 (manutencao)
- de manutencao
- atividade preferencial p CpG hemimetiladas
- assegura padrao de metilacao na sintese de dna q antecede a divisao celular
DNMT3 (metilacao de novo)
- diferenciação celular
- resposta a estimulos ambientais
polimorfismos tem penetrancia…
BAIXA
- é o efeito cumulativo que causa patologia (doencas multifatoriais)
- probabilidade de uma determinar doenca é muito baixa
doenças multifatoriais/complexas
- doenca causada por alt em varios genes
- ambiente com papel crucial
- fenotipo complexo com variantes frequentes na populacao mas com baixa penetrancia
Patologia genetica
SEM PROD DE PTN MUTADA
- variante na regiao reguladora q altera taxa de transcricao
- alt quantidade da ptn
- ptn normal mas ao ser menos causa fenotipo patogenico
SEM ALT SEQ BASES
- epimutacoes
se a um doente com criterios para uma certa doenca nao for detetado a variante por ngs significa que a situacao familiar nao e monogenica
FALSO
pode ser um falso negativo
CpG hotspots
p metilacao e desaminacao
maioria das mutacoes com causa…
endogena
importancia dos pseudogenes
- Cópias defeituosas de genes funcionais contendo vários exões desse gene
- apresentam várias mutações comparativamente ao gene funcional que se foram acumulando ao longo da evolução da espécie humana
- num protocolo de pcr ou rt pcr e imp saber se o gene tem pseudogenes para que os primers nao os amplifiquem ( ai iriamos encontrar muitas mutacoes)
no cancro, inibicao da desacetilacao (OU SEJA ESTA ACETILADO) …
permite expressao de genes supressores tumorais
sistema MMR
- repara erros de emparelhamento
- variantes relacionadas com erros de emparelhamentos e pequenas e medias ins e delecoes
- falencia sistema leva a erros de replicacao de microssatelites por ins ou delecao - instabilidade de microsatelites (ou seja, qnd celulas se replicam o n rep de str e sempre dif, sendo maior ou menor)
variante associada a variablidade fenotipica individual
SNP
- grande densidade no genoma (tem muitas localizacaoes ao longo do genoma; maioria das variantes sao snp);
- modificações simples que (podem acontecer de forma espontanea) que alteram expressao genica sem ser de forma mt drastica, nao dando patologia mas contribuindo para variabilidade fenotipica
características da cromatina quando a transcrição não esta ativa
- dna hipermetilado
- histonas desacetiladas
- cromatina muito condensada
procedimento analise p se saber se variante sinonima interfere com expressao genica
- extracao rna de cels onde é expressa
- rt pcr (p sintese do cdna atraves do rna)
- amplificar cdna p pcr
. sequenciar com sanger e comparar com controlo normal
. (ou) eletroforese p comparar tamanho dos fragmentos
STR mais informativo
- motivo (tem ate 10pb) repete n vezes variavel e o proprio motivo e variavel, dai existirem diversos alelos possiveis numa populacao para um determinado locus
- heterozigotia + freq que em SNP
- aplicacao, pe, med forense, testes exckusao de paternidade\
variante do dna pode ser causa de doenca monogenica quando localizada antes codao inicacao, depois codao stop e em regioes intergenicas?
SIM
o que origina uma variante em sequencias intronicas envolvidas no splicing
- retencao introes
- elimnacao exoes
- associado a framshit e ptn truncadas
VARIANTE
GERMINATIVA VS SOMATICA VS MOSAICO
GERMINATIVA
- origem num dos gametas q formou o zigoto
-presente em todas as cels do organismo
- 50 % dos seus gametas com mutacao
-50% chance de passar mutacao p descendencia
SOMATICA
-presente num grupo restrito de celulas (num tecido especifico)
- nenhum gameta com mutacao
-sem possibilidade de passar p descendencia
MOSAICO
- mutacao pos zigotica no embriao
- % diferente nos dif tecidos, podendo uns ter e outros nao
- sem motivo p estudar os pais
- probabilidade de os pais terem outro filho com a mutacao é nula
- menos de 50% dos gametas com mutacao, logo probabilidade de passar p descendencia sera sempre inferior a 50
- no gonadal, variante so existe em algumas cels germinativas, menos de 50, e so so suspeita quando um pai com gonadal, depois de varios ngs sem detetar mutacao em quakquer tecido, tem mais de um filho com a variante em heterozigotia
mutacao missense
- subst de uma base por outra, levando a codificacao de um aa diferente
- pode originar ganho, perda (diminuicao ou ausencia) ou nova funcao
- verificação do seu significado patológico pode não ser fácil
- para encontrar uma, se for especifica e soubermos a sua localizacao, SANGER, se for em muitos individuos, QPCR (discriminacao alelica com duas sondas TaqMan)
PCR com primers marcados com fluoróforos e deteção por eletroforese
capilar em sequenciador automático
. tecnica para avaliar niveis de rejeico ao transplante
- med forense (strs zona nao codif)
- teste pais
- p mutacoes dinamicas
na utilizacao de arrays…
- estudam se milhares de fragmentos
- nao tem a ver com estudo de genes especificos;
- caro
- justificado em casos como ver que genes estao aumentados num tecido tumoral, screening etc etc
neomutacoes de origem paterna
- na espermatogenese, ha muitas mitoses antes da diferenciacao em espermatezoide
- muitas opurtunidades de p ocorrer erro na formacao de dna
(problema na gametogenese feminina é a possibilidade de nao disjuncao cromossomica)
CNV intragenico vs CNV incluindo genes
INTRAGENICO
- alt n copias de longas seq intragenicas podendo engolbar um ou mais exoes e introes
- associado a ausencia de sintese de ptn ou a ptn alteradas e truncadas, com perda de funcao
incluindo genes
- tera alteracao a nivel da funcao se gene for sensivel a dosagem genica ( so 5-10% sao)
desiquilibrio da expressao alelica - mecanismos envolvidos
- variacoes da sequencia em cis q interferem com perfil epigeneto, transcriscao…
- outros mecanismos (imprinting genomico, intaivacao por parte do x…)
confirmacao da situacao de mosaico por diagnostico molecular?
-estudar tecido afetado e o nao afetado
-variante pode n existir em alguns tecidos
-freq da var é dif, sendo maior nos afetados
-suspeitar se freq inf a 30
-variante nao existe nos progenitores
Variantes sinónimas podem ser patogénicas. Porquê?
- ativar seq critica de splicing
- alt estabilidade do mrna
- alt taxa de traducao
sequencia do splicing
GT e AG
- extremidade do intrao
- regioes dadoras/recetoras de splicing
estudos GWA
- snp
- array de snp
caso menino com defice intelectual, podem existir cnvs grandes ou pequenas delecoes; realizou se hcg e nada… oq fazer a seguir
pcr?
mecanismo de reparação do dna para manter a integridade
mais utilizado
BER
- repara alt + freq
- cerca 20000 bases alt por dia
Escolha múltipla em que houve aumento da proliferação. O que pode
estar presentes em genes cancerígenos
MISSENSE
o que explica a diversidade celular
- cada tipo de célula tem um padrão (perfil) de expressão génica característico (regulacao da expressao genetica)
microrna
- pequenos rna
- nao codificantes
- transcritos por
*genes de mirna
*introes de genes de ptn ou de transcritos nao codificantes
*seq line e sine
*seq antisense de exoes de outros genes - inibem traducoa de mrna de outros genes
p identificar cnv
- pcr (se em homozigotia)
- array de hcg
para fazer sanger precisamos de pcr
- pcr p amplificar o segmento
- confirmar que na eletroforese temos apenas uma banda, oq siginfica que todos os frgmentos amplificados sao do mm tamanho
imp da regulacao da expressao genica
- diferenciacao celular ( cada celula com padrao de expressao genetica)
- diversidade interindividual
passos da pcr
desnaturacao
- separar dupla cadeia
annealing
- ligacao dos primers
extensao
- sintese nova cadeia
cnv
numero variavel cópias de longas
sequências
atrofia muscular espinhal - genes modificadores
- SMN1 determina se ha ou nao patologia
- SMN2 (n copias determina gravidade da patologia)\
PCRs com primers marcados com
fluoróforos e a eletroforese capilar
