Molekylärbiologisk diagnostik i klinisk bakteriologi

Question 1

1. Generellt - vid vilken allvarlghetsgrad av infektioner ska molekylärbiologisk diagnostik användas?
2. När kan typning av bakterier bli aktuellt?

Answer 1

Vid allvarliga infektioner där man snabbt behöver svar.
- CNS-infektioner framför allt.

T.ex. myobakterier också bra då det är svårodlat

2. Typning - vid smittspårning, virulensfaktorer, antibiotikaresistens

Question 2

1. Alla prover används i princip för odling - men vilket provmaterial som är vanligt inom vården används inte för odling?
2. Vilka specifika antigen är vanligt att detekera i urin idag i diagnostik?

Answer 2

1. Serum eller plasma
2. legionella och pneumokocker

Question 3

Real time PCR är den PCR som dominerar idag.

1. Vad kan denna metod vara till hjälp för i diagnostik? 3 saker
2. Beskriv metoden kort. begrepp: primers, CT-värde

Answer 3

1. • detektion av nukleinsyror
     - kvantifiera (mängdbestämma)
     - Karaktärisera t.ex. mutationer
2. Primers binder komplementärt till den specifika DNA eller RNA-sekvensen man har i provet. Amplifiering sker av provet. För varje cykel sker en fördubbling.

Med känt antal nukleinsyror i provet (kontrollprov) - kan man skapa en standardkurva med. Denna tror jag man jämfört med patientprovet för att få en uppfattning om hur mycket nukleinsyra som finns i provet.

CT-värde: Den cykel där man kommer ovanför bakgrundsbruset?!
- ju lägre CT-tal - ju fler nukleinsyra finns i provet - dvs avgöra hur många kopior som finns i provet.

Question 4

1. Vilken diagnostisk metod dominerar för chlamydia?
2. I Sverige för några år sedan använde många lab samma metod och primers för detektion av chlamydia. Detta visade sig sedan ge många falskt negativa provsvar kom man fram till. Detta var pga primern - varför hände detta?

Answer 4

1. PCR-metod
2. Många lab i Sverige använde samma metod antingen Abbot eller Roche. Denna primer som dessa metoder hade band in till en region på chlamydia DNA som hade MUTERATS - och då band inte denna primer in längre och man kunde inte detektera chlamydia.

Därmed har man nu gjort primers som binder till DNA som är essentiella för chlamydia (som inte kan muteras pga dö klarar sig inte chlamydia)

Question 5

Mycoplasma är en svårodlad bakterie

1. Vilken metod används i praktiken idag?
2. Ofta utförs combotest idag - vilka 2 mycoplasmabakterier gör man detta för?

Answer 5

1. PCR
2. Mycoplasma pneumoniae, mycoplasma genitalium

Question 6

VRE
1. Vilka 2 bakterier kan bära på denna resistensmekanism?
2. Hur gör man på lab för att veta om bakterien har VRE? Och hur konfirmerar man detta sedan?

Answer 6

1. E faceium. E facealis
   - van A eller van B -genen
2. Odla bakterierna med Vancomycin. Om bakterien lever fortsatt analuserar man med PCR på bakteirens DNA och ser om det finns vanA eller vanB

Question 7

1. När används 16 S RNA sekvensering?
2. Vad kan det uppstå för tolkningsproblem av svaret på analysen?

Answer 7

Bestämma okänd bakterieart!

16S -genen finns i alla bakteriers ribosomer. Är en konsverderad sekvens. När man sekvenserar fram 16 S får man samtidigt mellanlggande variabla delar i 16 S (mellan primers) - dessa är unika för olika bakteriearter.

Därmed kan arten bestämmas med 16S analys.

Vidare finns det databaser för väldigt många bakterier som sekvenserats.

2. Tolkningsproblem
   - Sekvenseringen av 16S gör man en tolkning av på labbet. Dvs vilken art det troligen är. Som kliniken som ska tolka svaret måste man tänka på
   - kan det vara denna bakterien med tanke på lokal och klinik? t.ex. kolera inte sannolikt i luftvägar
   - kan det vara kontamination?
   - är det denna bakterie som orsakar infektionen?

T.ex. 4 av 5 16S prover visar pos för samma bakterie - då är det ett relevant fynd förmodligen. Annars kanske en kontamination om bara 1 av 5 prover pos.

Question 8

Vad kan man göra för analys om en bakterie är multiresistent för att veta exakt resistensbestämning?

Answer 8

Helgenomsekvensering - görs på folkhälsomyndigheten

Question 9

Vid meningit utförs PCR för detektion bakterier som kan orsaka meningit, samtidigt som man skickar för odling. Nämn 3 bakterier

Answer 9

meningokocker, pneumokocker och HI.

Question 10

Utbrottsutredningar

1. I Lidköping skedde ett utbrott av Legionella för några år sedan. Vilken metod har hög känslighet för detektion av legionellaarter?
2. För att veta om det är samma stam som dem flesta smittats av i ett utbrott - vad gör man då för analys?

Answer 10

1. PCR
2. MLST - sekvensering av houskeepergener hos legionella och se om dem matchar identiskt eler nästan. En annan metod är helgenomsekvensering

Question 11

Kan helgenomsekvensering användas för detektion av antibiotikaresistens?

Answer 11

Ja :) Bara vet att man kan det.

Men - kliniskt används mest fortfarande resistensbestämning klassiskt med MIC besämning och zondiameter om det inte är helt galen multiresistent bakterie

Question 12

Multiplex detekering
1. En nyare metod. Vad bygger denna metod på för teknik?
2. Vad kan vara ett kliniskt problem med multiplex-analyser?

Answer 12

1. PCR. Man gör PCR på flera agens samtidigt i samma prov och får då fram snabbt vilka bakterier som finns i provet och vilka resistenser dem har.
2. T.ex. om flera patogener hittas i ett prov - kan bli svårt att veta vilken av dem som orsakar infektionen och vilka som bara koloniserar lokalen som provet är taget från.

Question 13

Quantitative -PCR är en annan PCR jämfört RT-PCR

1. Var används Q-PCR främst inom för områden inom mikrobiologi?
2. Om antalet kopior av DNA eller RNA understiger 1000 - kan du uttala dig då om antalet?
3. Kan man jämföra labvärden för samma prov mellan olika lab som utför samma analys?
4. Vad är en felkälla man måste tänka på med PCR-tekniker gällande primers och DNA/RNA som man har för primern?

Answer 13

1. Virologi. För att kvantifiera mängden virus vid t.ex. behandling av HIV.
2. Det blir osäkrare. Så man ska vara försiktig då med att kvantifiera. Däremot kan man säga att ja det finns virus i provet.
3. Ibland. Vissa analyser är stanardiserade över hela världen.
4. Virus DNA och RNA kan mutera - om primer binder in i just den muterade sekvensen kan det bli falskt låga svar

Question 14

Q-PCR

CMV är ett virus man kvantifierar hos immunsupprimerade patienter. Hur vet man egentligen om viruset är signifikant nivå i provet eller om det är “normalt”?

Answer 14

1. Det finns olika gränsvärden för olika patientkategorier t.ex. immunsupprimerade.
2. Om virusnivåerna stiger så indikerar det ev att man ska börja behandla helt enkelt.

Question 15

Identifiering av agens

MALDI TOF är en metod som har revolutionerat diagnostiken. Det är en masspektrometri som kan artbestämma med högre sannolikhet än förr med t.ex. seotypning och morfologi i mikroskopi.

Answer 15

Ja det var bara det :)