MoG del 2: Gentekniker 2

Question 1

Vilka komponenter behövs för att klona en gen (inte PCR)?

Answer 1

De komponenter som behövs är:

• Plasmid (dubbelsträngat, cirkulärt DNA) - kloningsvektor
• Bakterie eller annan värdcell
• Restriktionsenzym (sax)
• DNA-sekvens av intresse (som ska klonas)
• DNA-ligas

Question 2

Hur ser delstegen ut för kloningen av ett DNA-segment?

Answer 2

1. Restriktionsenzymet detekterar de DNA-sekvenser som ska klyvas (plasmiden har s.k restriktions-sites som är utformade för specifika restriktionsenzym), både i plasmiden och hos DNA-sekvensen som ska klonas.
2. RE klyver de dubbla strängarna hos både plasmiden och DNA-sekvensen. Man använder samma restriktionsenzym för att restriktions-fragmentet hos DNA-sekvensen ska passa ihop med plasmiden
3. Det kluvna segmentet basparar komplementärt med plasmidens ‘‘öppning’’.
4. DNA-ligas legerar ihop de resterande hål som blir kvar i strängarnas ryggrader.

Question 3

Hur ligeras DNA in i vektorer?

Answer 3

DNA-ligas är ett enzym som ligerar ihop plasmidens och DNA-segmentets ändar. När RE klyver plasmid och DNA bildas överhängande ändar, dvs där en av enkelsträngarna behåller några fler nukleotider än de andra. Dessa är kohesiva och basparar lättare med andra, överhängande ändar. När komplementär basparning har skett legerar DNA-ligas ihop de resterande ‘‘hålen’’ i strängarnas ryggrader, dvs mellan pentosen och fosfatgrupperna.

Question 4

Vilka är de olika element som måste finnas i en klonings-vektor för att insättning av DNA och
selektion ska kunna ske?

Answer 4

• Restriktions-sites som RE binder till
• En resistensmarkör som tillåter selektion av de celler som tagit upp plasmiden. Vanligast är en antibiotika-resistent gen. Cellerna med plasmiden odlas på agarplattor med antibiotika, där endast celler med plasmiden överlever. ‘‘vanliga’’ celler utan plasmiden dör, vilket är önskat då man vill undvika kopior av icke-rekombinanta plasmider.
• Vanligt är att man placerar in OriC som är komplementärt för värdcellen, eftersom att cellen inte replikerar plasmiden annars.

Question 5

Ursprung och övergripande funktion hos restriktionsenzymer?

Answer 5

Restriktionsenzymer är ursprungligen en bakteriell försvarsmekanism mot främmande DNA. RE detekterar DNA i cellen och märker ifall det är främmande eller inte. Främmande DNA förstörs.

Question 6

Principen för och hur att utföra Southern, Northern och Western blot, inklusive vad man
analyserar med respektive metod?

Answer 6

Southern Blotting - för att studera specifikt fragment i stora delar DNA, t.ex ett helt genom. Eftersom att fragmenten är av så stort antal har många liknande storlek och kan inte separeras med vanlig gelelektrofores.

1. DNA-sekvens (stort) klyvs med restriktionsenzymer
2. Fragmenten körs i agarosgel - oftast inget tydligt resultat, blir endast långa strängar då fragmenten är för många
3. Fragment blottas till membran
4. I membranet finns enkelsträngade prober som basparar endast till sekvenserna av intresse
5. Proberna är markerade med fluorescenta ämnen som detekteras av film