MoG del 2: CRISPR-Cas9 Flashcards
Vad är CRISPR ursprungligen?
Det är en del av bakteriers och arkéers adaptiva immunförsvar som präglas av att de identifierar inkommande virus och bakteriofager med hjälp av sparat DNA.
Hur fungerar CRISPR-systemet i immunsystem-syfte?
Det kodande CRISPR-genomet är beroende av intilliggande CAS-gener som kodar för bl.a enzymet Cas9.
Fag-DNA sparas genom att det klyvs till mindre fragment och sätts in direkt i CRISPR-genen som en s.k spacer. Mellan alla spacers (en spaders per dag-DNA) finns repetitiva sekvensen som skiljer dem åt. Däter transkriberas CRISPR-genen till crRNA (CRISPR-derived RNA). crRNA associerar sedan med Cas9-nukleas och basparar med inkommande fag-DNA, vilket neutraliserar DNAt.
Hur används CRISPR-systemet i genmodifieringssyfte?
När systemet används i syfte för genmodifiering använder man sig av en PAM-sekvens, som Cas9 klipper 3 nt uppströms från. Ett single guide RNA (sgRNA) används för specificitet. Denna är därför designad utifrån den DNA-sekvens som man vill klyva och modifiera. Därefter klyvs målsekvensen av Cas9. När dubbelsträngsbrotten ska ligeras ihop igen använder man sig av antingen enzymet NHEJ eller HDR. Den förstnämnda är riskabel då den kan orsaka slumpmässiga insertioner och deletioner som förstör genen. M.h.a HDR kan en redan modifierad gen fogas in i klyvningen
