MoG del 2: Detektion av genetiska sjukdomar Flashcards
Vad är RFLP?
En metod (Restriction Fragment Length Polymorphism) som används för detektion av genetiska sjukdomar sok orsakats av punktmutationer. Baseras på konceptet att restriktionsenzymer klyver olika beroende på hur en gen ser ut. T.ex så klyver RE inte en muterad sekvens där den normalt skulle klyvt och producerat två fragment istället för ett. Metoden måste kombineras med Southern blottning då en radioaktiv märkt prob känner igen sekvensen. Proben är en ssDNA.
Efter gelelektrofores kan man se storleken på fragmenten och därav avgöra om individen är homo-eller heterozygot för en viss gen och detektera mutationer.
Vad är ASO?
Allel-specifika oligonukleotider. Det är ett altenativ till RFLP då punktmutationer inte alltid kan detekteras av RE.
Denna metod baseras på radioaktivt märkta ASOs som binder till specifika sekvenser, men ger ifrån sig olika starka signaler ifall 1) ASOs binder till alla alleler och ger ifrån sig en stark signal (homozygot för frisk gen), 2) binder till hälften av allelerna och ger ifrån sig en halvstark signal (heterozygot för frisk gen) eller 3) inte binder till någon allel och ej ger ifrån sig någon signal alls (homozygot för muterad gen).
ASO är på flera sätt en effektivare metod än RFLP eftersom den används för snabb screening av sjukdomar som orsakats av många olika punktmutationer. Dock kräver den att minst en del av den undersökta genen är sekvenserad (känns till).
Varför lämpar sig DNA-typning baserat på STRs (mikrosatelliter) bättre i brottsmålsundersökningar än t.ex detektion av genetiska sjukdomar och faderskapsbestämning?
STRs utgörs av kortare repetitiva sekvenser än VNTRs. På grund av att VNTRs är så pass stora (15-100 bp) och normalt kommer i så många repetitioner krävs en stor mängd DNA, som dessutom ska vara relativt intakt. Detta kan vara svårt att extrahera från väldigt små cellmängder som oftast finns vid brottsplatser (t.ex endast ett par hårstrån eller några droppar blod). Därför analyserar man istället STRs som utgörs av mycket kortare sekvenser och lämpar sig bättre för PCR.
Vad är Southern blotting?
Metod för inmärkning av specifika DNA-sekvenser, man vill studera ett specifikt fragment i en stor mängd DNA. Efter klyvning med RE produceras en stor mängd fragment med liknande storlek, vilket gör att många av fragmenten inte kan separeras.
Då används blotting. Genomet körs på gel, varpå fragmenten blottas till ett membran. Därefter tillsätts en radioaktivt märkt prob som hybridiserar med den specifika sekvens man vill undersöka. Film eller Phosphor imager används för detektion av den märkta sekvensen.
Vad är hybridisering?
Reaktionen då två enkelsträngade komplementära nukleinsyror binder till varandra med vätebindningar.
Varför används blotting?
Vid klyvning av en stor mängd DNA produceras många sekvenser med liknande storlek, vilket innebär att de får svårt att separera i gelelektrofores. Därför används blotting, där fragmenten blottas över till ett membran varpå en märkt prob tillsätts (enkelsträngad oligonukleotid) som endast binder till sekvensen av intresse. Alla irrelevanta fragment sållas således bort.
Hur gör man för att effektivisera DNA-profilering med STR?
I ‘‘vanlig’’ DNA-profilering med STRs amplifieras loci I samma rör, primersen förlänger olika långt. Längden på PCR-fragmenten reflekterar antalet repeats vilket ger en unik DNA-profil för varje individ. Att upprepa denna process för många olika individer är tidskrävande.
Istället amplifierar man STR med lokus-specifika primers som är inmärkta med fluorescerande färg (en individ i taget). En laserdetektor kopplad till en dator detekterar antalet repeats för varje lokus och individ.
