Laboratorio N°4: Electroforesis Flashcards
Para que se utiliza la electroforesis
La electroforesis es una técnica utilizada para separar ADN, ARN o proteínas en base a su tamaño y carga eléctrica
La mayoría de las biomoléculas posee una____________, cuya magnitud depende del __________ en el que se encuentran; como consecuencia, pueden desplazarse cuando se ven sometidas a un campo eléctrico hacia el polo de carga ___________ al de la molécula
Carga eléctrica
pH del medio
Opuesta
En cuanto a la carga eléctrica que poseen las biomoléculas ¿En que se diferencian las proteínas de los ácidos nucleicos?
Las proteínas pueden poseer carga negativa o positiva, sin embargo el ADN posee carga negativa la cual esta dada por el grupo fosfato
Como funciona la electroforesis
Se utiliza una corriente eléctrica para mover las moléculas y que se separen a través de un gel. Los poros del gel permiten que las moléculas más pequeñas se muevan más rápido que las de mayor tamaño.
Previo a la electroforesis de proteínas ¿Cuál es el tratamiento que se realiza con esta biomolécula?
En el caso de las proteínas se realiza pretratamiento con detergentes, como el dodecilsulfato de sodio (SDS), que les confiere carga negativa; con ello se homogenizan las proteínas de la muestra y todas migrarán hacia el polo positivo, y sólo se separarán por tamaño
Que permite el análisis de ácidos nucleicos a través de la electroforesis
Permite caracterizar, identificar y aislar DNA o RNA. Ademas permite visualizar la integridad de DNA y/o para evaluar el éxito de la amplificación lograda por reacciones en cadena de la polimerasa (PCR)
Que genera el uso de buffer de carga en la visualización de la electroforesis
Los buffers de carga facilitan la visualización y sedimentación del producto de
PCR o de ácidos nucleicos.
Mencione los elementos necesarios para realizar una electroforesis
- Cámara de electroforesis y fuente de poder
- Gel y peine para pocillos
- Colorante
- Buffer de corrida
- Buffer de carga
- Marcador de peso molecular
- Transiluminador
De que depende el voltaje que se aplica en los geles de agarosa
Depende de la resolución requerida y del tamaño de los fragmentos a separar.
A mayor voltaje, se _________ la velocidad de la corrida del ADN, pero se _____
resolución
Aumenta
Pierde
Porque es importante el uso de una fuente de poder en la electroforesis
Esta entrega corriente eléctrica para separar moléculas eléctricamente cargadas, las cuales se mueven bajo la influencia de un campo eléctrico uniforme.
Los fragmentos de ADN al tener carga negativa se mueven hacia el________
Polo positivo, es decir, el anodo
De que suelen estar hecho los geles que se utilizan en la electroforesis
Suelen estar hechos de un polisacárido llamado agarosa, el cual es extraído de algas de los géneros Gellidium y Gracillaria
A mayor concentración de agarosa __________________
Menor será el tamaño de los poros que conforman la rejilla de agarosa y menor la movilidad del ADN.
Cual es la concentracion del gel de agarosa recomendada para ver la integridad del ADN o amplificacion por PCR
Es de 0.8% a 1.2%
Cual es la utilidad de los ‘‘peines’’
Se hacen ranuras llamadas pozos, en uno de los extremos del gel, en los cuales se colocarán las muestras de ADN
Además del gel de agarosa, ¿ De que otro elemento se pueden elaborar los geles?
La acrilamida. El gel de poliacrilamida es el resultado de la polimerización química de una mezcla de acrilamida y bisacrilamida
Que determina el tamaño de los poros en un gel de poliacrilamida
La concentración total de acrilamida presente (acrilamida + bisacrilamida), que generalmente se maneja en una proporcion de 19:1
Que cuidados se debe tener con la acrilamida
Es esencial almacenarla en un lugar refrigerado, seco y oscuro para reducir la autopolimerización y la hidrólisis. Ademas es una neurotoxina por lo que debe manejarse con suma precaucion
Cual es la forma mas habitual para detectar el ADN en los geles de agarosa
Es añadiendo algún compuesto fluorescente (colorante) que se una específicamente a los ácidos nucleicos.
Cual es el colorante mas usado para visualizar el ADN en la electroforesis
El bromuro de etidio (BrEt), compuesto con la propiedad de intercalarse entre pares de bases contiguas del ADN,
Como se observa el ADN en la electroforesis cuando el gel se tiñe del colorante
Los fragmentos de ADN pueden verse como bandas, las cuales representan un
grupo de fragmentos de ADN del mismo tamaño.
Porque se debe tener cuidado al utilizar el Bromuro de etidio
Porque es un compuesto mutagénico
Por cual otro colorante se ha reemplazado el uso de Bromuro de etidio
GelRed, que permite la tinción fluorescente de ácidos nucleicos (dsADN, ssADN o RNA
Cuales son las ventajas de usar GelRed en lugar de Bromuro de etidio
No es mutagénico ni citotóxico y seguro para el medio ambiente, sin requerir modificaciones en los sistemas de fotodocumentación tanto para la excitación como emisión.
Cual es la función del Buffer de corrida
Éste proporciona el medio para la transmisión de la corriente eléctrica y mantiene el pH sin variaciones mientras se realiza la corrida electroforética
Que buffers de corrida pueden utilizarse para los acidos nucleicos
TBE o TAE como buffer. El buffer TBE contiene Tris base, ácido bórico y EDTA, y se maneja a un pH de 7.2. El buffer TAE contiene Tris base, ácido acético y EDTA, ajustado a pH 8.5.
Para que sirve el buffer de carga
Es un amortiguador tiene como fin brindar peso, densidad y color a la muestra, lo que facilita su depósito en el pocillo y evita su salida del gel; permite, además, monitorear la corrida de la muestra en el gel.
Cual es la finalidad de tener marcadores de peso molecular en una electroforesis
Son moléculas de ADN que permiten determinar por comparación el tamaño de los fragmentos de ácidos nucleicos contenidos en las muestras sometidas a electroforesis.
De que forma se puede desarrollar una corriente electroforetica
Puede ser desarrollada de forma horizontal o vertical:
La corrida electroforética vertical se usa exclusivamente con
Gel de poliacrilamida
Para que se utiliza la corrida electroforética vertical
Se utiliza para proteínas o ácidos nucleicos de pequeño tamaño.
Que es un transiluminador ultravioleta
Equipo que emite luz en el espectro UV, con un espectro de longitudes de onda que varía entre los 100 y 400 nm
