Laboratorio N°3: Fundamentos de la PCR Flashcards
Porque se caracteriza la técnica de PCR
Se caracteriza por ser una técnica de alta sensibilidad, reproducibilidad y
eficiencia, que genera resultados confiables en poco tiempo y fáciles de analizar
Cual es la misión u objetivo de la PCR?
Copiar millones de veces una secuencia especifica de DNA, a traves de la enzima Taq polimerasa
La PCR se considera una tecnica de tipo ________
Cuantitativa
¿Qué es la PCR según el articulo ‘‘Fundamentos de PCR’’?
Es una reacción enzimática in vitro que amplifica millones de veces una secuencia específica de ADN durante varios ciclos repetidos en los que la secuencia blanco es copiada fielmente
Si la reacción utiliza un sustrato genómico, esta se denomina
PCR convencional
Si la reacción utiliza ADN complementario (ADNc) proveniente del ARNm se le conoce como:
RT-PCR
Como se logra la conversión de ARNm en ADNc
Esta conversión se logra mediante una reacción conocida como transcripción reversa y controlada por la enzima transcriptasa reversa, capaz de convertir el ARNm en una molécula de ADNc
Cuales son los elementos importantes en la reacción de PCR
Templado o molde (ADN o ADNc), La enzima, Taq polimerasa Los oligonucleótidos o primers, Los desoxirribonucleótidos trifosfatados (dNTPs: A, T, C y G), El ión magnesio (Mg +), Una solución amortiguadora o buffer y H2
Cuales son las etapas de la PCR
desnaturalización, hibridación y extensión
Como se llaman los equipos en donde se ejecuta la reaccion de PCR
Son llamados termocicladores, los cuales están diseñados para establecer un sistema homogéneo en donde las condiciones de temperatura y tiempo necesarios no se modifiquen en cada uno de los ciclos
Al final de la reacción ¿Cómo se corrobora si se amplifico la muestra?
Los productos de la PCR o también llamados amplicones son analizados en geles de agarosa para confirmar si la reacción fue exitosa
Cual es el elemento principal en la PCR segun el articulo Fundamentos de la PCR
El ADN, el cual esta compuesto por azucar, fosfato y bases nitrogenadas
Cuales son las propiedades del ADN que se aprovechan para la PCR
La complementariedad de las bases nitrogenadas, la cual esta dada por puentes de hidrógeno e interacciones hidrofóbicas, generando estabilidad a la doble hélice,
Porque esta dada la carga negativa del DNA
Esta dada por los grupos fosfatos
Cual es la funcion de la ADN polimerasa en la PCR
Se encarga de la catálisis de la reacción, sintetizando las nuevas cadenas de ADN que llevan la secuencia blanco
Cual es la enzima mas usada en la PCR
La Taq ADN polimerasa que proviene de una bacteria termófila llamada Thermus aquaticus, ya que, es capaz de soportar altas temperaturas
Que son los primers
Son secuencias de oligonucleótidos que flanquean y delimitan la secuencia blanco que se desea amplificar y son complementarios a ésta.
Que características poseen los primers
Generalmente su tamaño oscila entre 15-25 pares de bases y la cantidad de G-C no debe ser más del 55% de la secuencia
Que ocurre si no se respetan las características de los primers
Existe la posibilidad de la formación de dímeros de primers, es decir, de productos inespecíficos. Esto repercutiría en el rendimiento de la reacción, así como en la especificidad del producto esperado.
Como se denomina el par de primers que se utilizan en la PCR
Una denominada «forward» o sentido y otra «reward» o antisentido; ambas deben estar diseñadas para que hibriden con el templado y las cadenas de ADN puedan
ser extendidas por la Taq polimerasa en dirección 5’-3
En que consiste la etapa de desnaturalizacion?
En esta etapa, las cadenas de ADN son calentadas y separadas a una temperatura de 95 °C durante 20-30 segundos
En que consiste la etapa de Hibridacion
En esta etapa, los primers se alinean al extremo 3’ del templado previamente separado e hibridan con su secuencia complementaria. Temperatura 55°C
En que consiste la etapa de Extensión
En esta etapa, la Taq polimerasa actúa sobre el complejo templado-primers y empieza su función catalítica a una velocidad muy rápida; agrega dNTP’s complementarios para crear las cadenas completas de ADN. Temperatura optima 92°C
En que consiste la electroforesis
Consiste en la separación de grandes moléculas como los ácidos nucleicos a través de una matriz sólida que funciona como un filtro para separar las moléculas en un campo eléctrico de acuerdo a su tamaño y carga eléctrica
Que facilita la identificación de los amplicones
Deben ser cargados junto con un marcador molecular que contenga un número determinado de segmentos de ADN conocidos
La visualizacion de los amplicones se realiza mediante
Se lleva a cabo tomando una foto digital al gel de agarosa expuesto a luz UV; adicionalmente un procesador de imágenes se encarga de analizar las bandas observadas
Cual es la cantidad de ciclos que se realizan en una PCR
20-35 ciclos
Que ha permitido el desarrollo de la técnica de PCR
Esta técnica ha disminuido el tiempo de trabajo requerido para producir suficiente
material de experimentación, comparado con el tiempo empleado cuando se utilizan los métodos tradicionales de amplificación biológica.
Mencione 3 aplicaciones de la PCR
Diagnóstico precoz de determinados tipos de cáncer
Monitorear la quimioterapia del cáncer
La detección de bacterias y virus es posible por ejemplo VIH-1
