Laboratorio N°1: Extracción de DNA de hongos y bacterias y su cuantificación Flashcards
¿Qué limitaciones entrega el aislamiento de bacterias y hongos para analisis de DNA?
Mayor tiempo para obtener resultados
Cultivo mas complejo para algunos microorganismos
¿A través de qué enlace se unen los nucleotidos?
Enlaces fosfodiester entre gurpo fosfato y azucar
¿En que se basa el aislamiento y purificación de moléculas de ADN?
En las características fisicoquímicas del DNA
¿Qué le confiere al ADN una carga neta negativa?
Los grupos fosfatos por su carga negativa y polaridad. Estos tienden a repelerse, lo que permite disolver al ADN en soluciones acuosas y formar una capa hidratante alrededor de esta
¿Qué estructura adquiere el DNA mediante la union por puentes de hidrogeno?
Estructura helicoidal
¿Que pasa cuando el DNA entra en contacto con etanol?
Se rompe la capa hidratante y quedan expuestos los grupos fosfato uniendose a cationes como Na+ que reducen la fuerza negativa haciendo que el DNA precipite
¿En qué consiste la extracción del DNA?
En el aislamiento y purificación de moléculas de ADN
Mencione algunas metodologías de extracción de ADN
Hervir en agua destilada Uso de detergentes con o sin aplicación de calor Hidróxido sódico con calor Ciclos de congelación-descongelación SDS-proteinasa K Ácido perclórico Enzimas (lisozima) Sonicación
En el caso de microorganismos, ¿Qué metodologías son mayormente utilizadas para la extracción?
Salting
Fenol - cloroformo
Extracción con solventes orgánicos
¿Cómo se fundamenta la extraccion de DNA en MO con solventes organicos?
En la lisis celular y la eliminación de restos proteicos y lipídicos
presentes.
¿Cuales son los beneficios de a metodología de fenol
cloroformo o extracción con solventes orgánicos?
Posee una alta capacidad de eliminación de sales, utiliza poca cantidad de muestra y se obtiene gran cantidad de ADN de buena calidad
Para la extracción de ADN de hongos, ¿qué procedimiento se agrega?
Se agrega una fase de lisis de la pared fúngica a través de una destrucción mecánica utilizando perlas de vidrio
¿Cuáles son las etapas clave en el proceso de extracción de ADN?
1) Lisis celular
2) Separación de proteínas y lípidos
3) Precipitación del ADN
4) Resuspensión del ADN
¿Qué sucede en la etapa de la lisis celular?
La pared, membrana celular y nuclear se modifican o destruyen permitiendo que los ácidos nucleicos se liberen
¿Qué elementos pueden utilizarse para la etapa de lisis celular?
Soluciones básicas, detergentes o agentes caotrópico, inhibidores de enzimas que degradan el DNA, compuestos con EDTA (impide funcion de DNAsas), centrifugacion (para material fibroso y proteínas que siguen en la solucion)
¿Que sucede en la etapa de Separación de proteínas y lípidos?
Se separa el ADN de las proteínas y lípidos mediante solventes orgánicos y ciclos de centrifugación
¿Que solventes se utilizan en la etapa de Separación de proteínas y lípidos?
Fenol, el cloroformo y el alcohol isoamílico
¿Como se separan las proteinas, lipidos y demas en la etapa de separacion?
Las proteínas y los lípidos se separan con solventes orgánicos
La fase acuosa (donde se encuentran los fosfatos) y la orgánica se separan por centrifugación
¿Como se realiza la etapa de Precipitación del ADN?
Se adiciona etanol y soluciones con altas concentraciones de iones de sodio o amonio uniendose a grupos fosfato, reduciendo las fuerzas repulsivas entre las cadenas y permite que el ADN se pliegue sobre sí mismo haciéndolo insoluble
¿Por qué es importante la centrifugacion en la etapa de Precipitación del ADN?
Porque permite que el ADN permanezca en el fondo del tubo y el etanol pueda ser desechado mediante lavado (etanol al 70%)
¿Que sucede en la etapa de Resuspensión del ADN?
Se hidrata el ADN para mantenerlo en solución
¿En que consisten los kits de extracción?
Utilizan matrices inorgánicas cargadas positivamente capaces de retener mg de ADN y separarlo del resto de las biomoléculas
¿Que pueden contener los kits de extracción?
Membranas de sílice o perlas magnéticas
Nombre dos caracteristicas de las membranas de sílice:
- Insertada dentro de un microtubo de polipropileno
- Formadas por una resina
Nombre dos caracteristicas de las perlas magneticas
- Consisten en un centro de hierro recubierto por resina
- Se encuentran suspendidas en una solución amortiguadora
¿Cuales son los pasos para el protocolo de extracción DNA en bacterias?
- Disponer de una placa con el cultivo bacteriano creciendo en estado puro
- Encender el Termoblock a 100 ºC
- Adicionar a un tubo eppendorf de 1.5 mL, 500 uL de agua destilada estéril, 10 uL de SDS
(sodio dodecil sulfato) al 10 % y una asada del cultivo bacteriano. - Colocar el tubo eppendorf durante 10 minutos a 100ºC
- Dejar enfriar a temperatura ambiente
- Adicionar 500 uL de fenol cloroformo y centrifugar a 13000 rpm por 5 min.
- Trasferir la capa superior a un nuevo tubo eppendorf de 1.5 mL
- Adicionar 1 mL de isopropanol frío (precipitación del ADN)
- Centrifugar a 13000 rpm por 10 min
- Descartar el sobrenadante y resuspender el pellet con 50 uL de agua destilada estéril
- Congelar a -20 ºC.
¿Cuales son los pasos para el protocolo de extracción DNA en hongos?
- Disponer de una placa de medio de cultivo con crecimiento fúngico puro
- Encender el Termoblock a 65 ºC
- Para cada muestra rotular 2 tubos eppendorf de 1,5 mL (uno de ellos conteniendo perlas
de vidrio) - Adicionar al tubo con perlas de vidrio 500 uL de buffer de lisis
- Con ayuda de un bisturí o asa de cultivo, adicionar micelio (hongo filamentoso) o colonia
(hongo levaduriforme) al tubo que contiene el buffer de lisis. - Aplicar vórtex por 40 segundos
- Centrifugar por 10 min a 13000 rpm.
- Transferir el sobrenadante al otro tubo eppendorf rotulado, sin arrastrar el precipitado
- Añadir 275 uL de Acetato de Amonio pH 7.0, 7M.
- Incubar 5 min a 65 ºC.
- Poner 5 min en hielo.
- Anadir 500 uL de cloroformo
- Agitar en vórtex y centrifugar 5 min a 13000 rpm
- Llevar la fase superior (400 uL) a un nuevo tubo eppendorf de 1.5 mL
- Añadir 1mL de Isopropanol.
- Agitar en vórtex e incubar a -20 ºC por al menos 20 min. En esta fase puede ser dejado a -20
ºC hasta el día siguiente. - Centrifugar por 5 min a 13000 rpm.
- Descartar el sobrenadante y agregar al pellet 400 uL de Etanol de 70 % (mantenido a -20 ºC)
- Eliminar con cuidado el sobrenadante y luego dejar el tubo abierto boca abajo sobre un
papel absorbente para que escurra el resto de etanol de las paredes. Dejar secar hasta que
no huela a alcohol. - Adicionar 25-50 uL de agua destilada estéril
- Congelar a -20 ºC.
¿En que consiste el procedimiento de extracción con kits con membrana de sílice?
Primero se adiciona etanol a la solución (expone grupos fosfato) facilitando la union del DNA con la membrana cargada positivamente (reversible), debido a lo mismo, las proteinas y lipidos no se unen y se eliminan con soluciones de lavado y
ciclos de centrifugación. Luego se adiciona agua o solución amortiguadora al centro de la membrana (hidrata DNA) y se centrifuga para recuperarlo de la matriz
Nombre algunas ventajas de la extraccion con kit con membrana de sílice:
- Disminuye el tiempo de extracción (pocas horas)
- Se reduce el número de pasos del procedimiento
- Hay una extracción de alta pureza
- La eliminación de contaminantes es muy eficientes
¿En que consiste el procedimiento con los kits con perlas magnéticas?
Se añade a la solución de lisis una solución amortiguadora a pH ácido (carga positivamente a las perlas) uniendose al DNA. Las proteinas y lipidos no tienen afinidad por lo que se separan del DNA y se eliminan con soluciones de lavado a pH fisiológico. Luego se utiliza una solución básica de Tris-HCl 10 mM a pH 8.5 para neutralizar a las perlas (ADN se separa de estas), luego se
transfiere el DNA a otro tubo, y las perlas se retienen el tubo.
Una vez realizada la extracción de ADN, ¿qué se debe realizar?
Medir la cantidad de material genético obtenido y el grado de pureza mediante espectrofotometría
¿Cómo se mide la cantidad de DNA en espectrofotometría?
Como el ADN absorbe la luz ultravioleta a 260 nm aplicando la ley de Beer-Lambert (la concentración en solución depende de la cantidad de luz absorbida)
¿Como se mide la calidad/pureza del DNA en espectrofotometría?
Se debe valuar la relación de absorbancia a 260 nm y 280 nm (DNA, y proteinas respectivamente) o 260/230 (DNA y carbohidratos o fenol respectivamente)
¿Que proporcion es aceptada para determinar que la extracción es pura?
Una proporción de 1.8 es aceptada, proporciones menores a este valor indican la presencia de proteínas o una proporción en el rango de 2.0 a 2.2 se considera aceptable en el caso de compara DNA con carbohidratos o fenol
Para determinar si el ADN obtenido está integro ¿qué se debe realizar?
Una electroforesis con gel de agarosa al 1 % corriendo a 90 voltios durante 40 minutos
¿Como se observa un DNA integro en electroforesis?
Se debe observar una banda estrecha cercana al pozo en que se colocó la mezcla de ADN.
¿Como se observa un DNA no integro en electroforesis?
Se observará un sendero luminoso en el carril de la muestra ya que se encuentra fragmentado. Este DNA dificulta la amplificación de productos de PCR de alto peso molecular y afecta la reproducibilidad de las técnicas
