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Diagnostico Molecular > Introducción a las ciencias Ómicas y su relevancia en el diagnóstico clínico II. > Flashcards

Introducción a las ciencias Ómicas y su relevancia en el diagnóstico clínico II. Flashcards

1
Q

¿Qué es lo que permiten identificar las técnicas de Hibridación In Situ (ISH)?

A

Las técnicas de Hibridación in situ (ISH) permiten detectar secuencias específicas de ácidos nucleicos (ADN o ARN) sobre preparaciones celulares y cortes de tejido.

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2
Q

¿Que tipos de marcajes se utilizan en las tecnicas ISH?

A

Marcajes directos y marcajes indirectos

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3
Q

¿Qué técnicas ISH encontramos en el marcaje indirecto?

A

Hibridación in situ cromogénica (CISH)

Hibridación in situ con plata (SISH)

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4
Q

¿En que consiste la técnica CISH?

A

Sonda conjugada a biotina-avidina o digoxigenina. Tras una reacción enzimática, el producto obtenido es detectable visualmente mediante la utilización de un microscopio óptico en campo claro.

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5
Q

¿En que consiste la técnica SISH?

A

Sonda se encuentra conjugada con dinitrofenol. Tras una reacción con sales de plata, el producto final es detectable a través de un microscopio óptico en campo claro.

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6
Q

¿Qué técnicas ISH encontramos en el marcaje directo?

A

Hibridación fluorescente in situ (FISH):

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7
Q

¿En que consiste la técnica de FISH?

A

Sondas empleadas están directamente marcadas con un fluorocromo. Tras la excitación de éste a la longitud de onda adecuada, emitirá una señal de
fluorescencia permitiendo la detección directa de ésta mediante la utilización de un microscopio de fluorescencia.

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8
Q

¿Cómo ocurre el proceso de marcaje en FISH?

A

El proceso del marcaje ocurre dejando incubar la sonda marcada con el fluorocromo con el tejido, luego se desnaturaliza en DNA, permitiendo que la sonda se hibride al bajar la temperatura y luego el DNA al renaturalizarse estará el material genético marcado con el fluorocromo.

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9
Q

¿Qué tipos de sondas son utilizadas en FISH?

A

Podemos encontrar sondas centroméricas, sondas de locus especifico y sondas de pintado cromosómico.

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10
Q

¿En que zonas del ADN hibridan las sondas centromericas?

A

Hibridan en las regiones repetitivas del ADN localizadas en el centrómero del
cromosoma

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11
Q

¿Qué permite analizar el uso de las sondas centroméricas?

A

El empleo de este tipo de sondas permite el análisis de alteraciones en el número de cromosomas, aneuploidías.

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12
Q

¿Qué región del ADN hibridan las sondas locus especifico?

A

Hibridan en una región de ADN concreta del genoma, dicha región puede comprender la secuencia de un gen o una región mayor (banda cromosómica)

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13
Q

¿Para que se utilizan las sondas tipo locus especificos?

A

Este tipo de sondas se emplean para detectar la perdida o ganancia de material genético y alteraciones estructurales como traslocaciones e inserciones/fusiones.

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14
Q

¿Qué son las sondas de pintado cromosómico?

A

Se trata de una batería de sondas que en conjunto hibridan con un cromosoma completo específicamente.

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15
Q

Nombre una patología que se detecta a través de FISH

A

El Síndrome de Williams, se trata de un desorden genético causado por una deleción en el brazo largo del cromosoma 7, específicamente en 7q11.23.

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16
Q

¿Cuáles son las limitaciones que tiene el uso de la técnica de FISH?

A
  1. Se debe tener un conocimiento previo o una sospecha previa de la naturaleza de la aberración.
  2. Se debe contar con la sonda de la región de interés.
  3. Sólo se obtiene información de la sonda que se está testeando, cualquier otra anomalía que esté presente no será detectada
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17
Q

¿En que consiste la secuenciación?

A

Consiste en conocer la secuencia concreta de los nucleótidos que componen cualquier ácido nucleico (ADN/ARN)

18
Q

¿Qué estableció Gobind Khorana en 1971?

A

El principio básico de la replicación del ADN usando primers

19
Q

¿Qué hizo Robert Holley en 1965?

A

Secuenció la primera molécula ARN - ARNt – y ARN del bacteriófago MS2

20
Q

¿Qué desarrollaron Allan Maxam y Walter Gilbert entre 1976 y 1977?

A

Desarrollaron el método de secuenciación química

21
Q

¿Qué desarrollo Fredrick Sanger en 1977?

A

El método de Terminación de Cadena o dideoxinucleótidos

22
Q

¿Qué se desarrollo en 1986 con respecto a la secuenciación de DNA?

A

Se desarrollo el primer método automatizado de secuenciación de ADN

23
Q

Que es el método de Maxam-Gilbert en secuenciación

A

Es un método de secuenciación que depende de la degradación química específica del ADN. La fragmentación específica del ADN es la base de este método, desarrollado en cinco pasos.

24
Q

Cuales son las ventajas y desventajas del metodo de Maxam-Gilbert

A

Este método tiene la ventaja de que puede emplear ADN de doble hebra, pero requiere una separación de hebras o fraccionamiento equivalente por cada fragmento de restricción estudiado, lo cual lo hace laborioso.

25
Q

Cuales son los pasos que implica el método de Maxam-Gilbert

A
  1. Marcaje radiactivo del extremo 5’ con 32P
  2. La modificación de una base
  3. La eliminación de la base modificada
  4. Rotura de la cadena de ADN en la desoxirribosa modificada
  5. Análisis de la secuencia fragmentada por electroforesis en gel de poliacrilamida
26
Q

Las purinas (A+G) se depurinan con __________

A

Acido Formico

27
Q

Las guaninas se metilan con__________

A

Sulfato de dimetilo

28
Q

Las pirimidinas (C+T) se hidrolizan con

A

Hidracina

29
Q

Cuando el ADN ya es modificado por el tratamiento de bases esta puede ser escindida por __________ en la posicion de la __________

A
  1. Piperidina caliente

2. Base modificada

30
Q

En que consiste el metodo de Sanger o de los dideoxinucleotidos

A

Esta estrategia se basa en sintetizar, de forma secuencial, una hebra de ADN complementaria a una hebra de cadena simple (que se utiliza como molde).

31
Q

Que son los didesoxinucleótidos trifosfatados (ddNTP)

A

Son iguales que los dNTP pero sin el grupo hidroxilo en el carbono 3’ de la desoxirribosa.

32
Q

Que hacen los ddNTP

A

Estos pueden incorporarse a una cadena de ADN en crecimiento por medio de la ADN polimerasa, pero actúan como terminadores porque, una vez incorporados a la cadena, y al no contar con el OH en el extremo 3’, no permiten que se una otro nucleótido.

33
Q

Cuales son los componentes de la reaccion del metodo de Sanger

A
  • ADN polimerasa
  • Un Primer o cebador
  • Buffer
  • los cuatro 2’-deoxinucleótidos que componen la secuencia del ADN (dATP, dGTP, dCTP y dTTP)
  • Cuatro dideoxinucleótidos (ddATP, ddGTP, ddCTP y ddTTP)
34
Q

Explique la reaccion del Metodo de Sanger

A

La reacción requiere la hebra molde de ADN de cadena sencilla marcada radiactivamente, un iniciador, ADN polimerasa y cuatro dNTP. La reacción es dividida en cuatro alícuotas, uno para cada base, cada tubo contendrá uno solo de los ddNTP marcados y los otros tres dNTP y se continúa con la polimerización incorporando los nucleótidos en sentido 5’ → 3’. Cuando se marcan con flurocromos la reacción total se puede hacer en un solo tubo, ya que el color emitido servirá para diferenciar las cadenas.

35
Q

Que utilidad tiene la tecnica de Sanger en el Laboratorio

A
  1. La identificación de regiones genómicas más pequeñas en un mayor número de muestras
  2. Secuenciación de regiones variables
  3. Validación de resultados de estudios de secuenciación de próxima generación (NGS)
  4. Verificar secuencias de plásmidos, inserciones, mutaciones,
  5. Tipificación de HLA (antígenos leucocitarios humanos)
  6. Genotipificación de marcadores de microsatélites
  7. Identificación de variantes genéticas únicas que causan enfermedades
36
Q

En que consiste la secuenciación de Nueva Generación

A

La Secuenciación de Nueva Generación (Next Generation Sequencing [NGS]) es un grupo de tecnologías diseñadas para secuenciar gran cantidad de segmentos de ADN de forma masiva y en paralelo, en menor cantidad de tiempo y a un menor costo por base.

37
Q

Cuales son las características del Nanopore

A
  • Mide corriente a través de nanoporos que es captada por un sensor
  • Cada Nt (A,T,G,C) produce una intensidad diferente
  • Secuencias largas
  • Tiempo real
  • Coste muy reducido
  • Secuenciadores USB
38
Q

Cuales son las ventajas de las técnicas de secuenciación de primera generación

A

Lecturas largas (1000 pb)
Baja tasa de error
No se requiere amplificación por PCR

39
Q

Cuales son las desventajas de las técnicas de secuenciación de primera generación

A

Costos altos por necesidad de procedimientos adicionales, como clonacion
Bajo rendimiento

40
Q

Cuales son las ventajas de las técnicas de secuenciación de segunda generación

A

Alto rendimiento
Profundidad en las lecturas
Bajo costo y baja tasa de error
Rápido tiempo de respuesta a las ejecuciones

41
Q

Cuales son las desventajas de las técnicas de secuenciación de segunda generación

A

Lecturas mas cortas que los obtenidos por Sanger (100-500 pb)
Se requiere amplificación por PCR
Ensamblaje altamente fragmentados

42
Q

Cuales son las ventajas de las técnicas de secuenciación de tercera generación

A

Lecturas largas, >14 kb
En el caso de MinION, fácil portabilidad
No requiere de amplificación

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