Laboratorio N°2: Extracción de DNA de tejidos Flashcards
Las muestras de tejido (biopsias) utilizadas para estudio molecular pueden
encontrarse en:
- Fresco contenidas en suero fisiológico
2. Fijadas y embebidas en parafina
Para que se utilizan las muestras de tejidos fijadas en parafina
Se utilizan para el almacenamiento del espécimen a largo plazo y al representar un material biológico específico de una enfermedad, permiten establecer correlación entre aspectos moleculares, patogénesis, pronóstico clínico y tratamiento.
Cuales son las desventajas de utilizar tejidos fijados para la aplicación de técnicas moleculares
presentan algunas limitantes en el proceso de amplificación de ADN mediante PCR debido a que esta es afectada por el tipo de fijador y los tiempos de fijación empleados.
Nombre ejemplos de fijadores utilizados en la clinica
- Etanol 70%
- Formalina ácida (10% v/v)
- Formalina buffer (formalina ácida 10% tamponada con buffer fosfatos, pH 7.0)
- Formal-Fixx
- Fijador zinc
Con que son fijados rutinariamente los especímenes procesados
Fijados en formaldehido al 10 % y son posteriormente embebidos en
parafina
Cual es la desventaja que se presenta al utilizar formaldehido para fijar tejidos
Se ha demostrado que el formaldehído produce entrecruzamiento entre ácidos nucleicos hidrolizando puentes fosfodiéster del ADN provocando fragmentación y generando así problemas en la obtención de un material genético de buena calidad, disminuyendo posteriormente el rendimiento de la amplificación por PCR
Que fijadores son recomendables para mantener las estructuras intactas de los tejidos
Fijadores basados en formaldehído tamponado
Etanol
Que factores son los que afectan la calidad del ADN
Tipo de tejido, Agente fijador (naturaleza, concentración, temperatura, pH), Tipo y tiempo de almacenamiento
Cual es el primer paso a realizar para la extracción de ADN de una muestra fijada
Deben ser previamente desparafinadas lo cual se logra a través de su inmersión en xilol a 55 °C como agente removedor de parafina
Que se debe realizar en la segunda etapa de extraccion de ADN una vez aplicado el xilol
La muestra debe ser rehidratada a través de una serie de lavados con etanol en concentraciones decrecientes
Que es el cultivo celular
Es una técnica que permiten el crecimiento y mantenimiento de las células in vitro, conservando al máximo sus propiedades fisiológicas, bioquímicas y genéticas
Cual es el cultivo celular que mas se utiliza
El cultivo celular primario es uno de los más utilizados y corresponde al cultivo de células, tejidos u órganos obtenidos directamente de un organismo, puesta a crecer directamente en un medio artificial.
Cual es la diferencia entre el crecimiento de cultivo en monocapa o en suspension
El cultivo en monocapa es el método más utilizado para la mayoría de las células,
no así el cultivo en suspensión, el cual se aplica normalmente para células hematopoyéticas, células madre, líneas celulares transformadas y células tumorales.
Las líneas celulares tienen una vida finita que, según el tipo de célula, se puede prolongar entre
Entre 20 y 100 generaciones, Superado ese límite, las células entran en una etapa que se denomina senescencia en la que pierden su capacidad de proliferar y mueren
Que ocurre con las celulas tumorales
evitan la senescencia y dan lugar a líneas celulares continuas, que crecen y se multiplican indefinidamente; estas pueden surgir de forma espontánea o de forma inducida y son el resultado de un cambio genotípico denominado transformación.
En el año 1952 se obtuvo la primera línea celular continua de origen humano, la cual fue extraída a partir de
un tumor de cuello del útero de una paciente afroamericana que se llamaba Henrietta Lacks y en su honor fueron denominadas como “células HeLa”
Las líneas celulares tienen diversas aplicaciones en investigación básica, dentro de las que se encuentran el estudio de:
Actividad intracelular
Flujo intracelular de biomoléculas:
Interacciones celulares
Genómica y proteómica:
Que investiga la actividad intracelular
transcripción de DNA, síntesis de proteínas, metabolismo
energético, ciclo celular, diferenciación, apoptosis, etc.
Que investiga el flujo intracelular de biomoléculas
Procesamiento del ARN, el movimiento del ARN desde el núcleo hacia el citoplasma, el movimiento de las proteínas hacia diversos orgánulos, el ensamblaje y desensamblaje de los microtúbulos, etc.
Que estudia las Interacciones celulares:
Morfogénesis, proliferación celular, adhesión celular, interacciones con la matriz, invasión celular, etc
Que estudia la genomica y la proteomica:
Análisis genético, infección, transformación celular, inmortalización, senescencia, expresión génica, rutas metabólicas, etc.
En que áreas de investigación aplicadas son utilizadas las líneas celulares
Virologia, Biotecnologia, Inmunologia, Farmacologia, Ingenieria de tejidos, Toxicologia, Investigación y diagnóstico del cáncer, Estudios para el diagnóstico de enfermedades asociadas a anomalías genéticas
Para que se utilizan las lineas celulares en el area de virologia
Detección de infecciones virales, cultivo de virus y el estudio de
vacunas en las fases iniciales de los ensayos clínicos, antes de pasar a las pruebas
en humanos.
Que se investiga en biotecnologia
: producción industrial de fármacos en biorreactores (interferón,
insulina, hormona de crecimiento, etc.)
Cual es el area de investigacion de la inmunologia
Producción de anticuerpos monoclonales, señalización,
fenómenos de inflamación.
Que estudia la farmacologia
Efecto de diversos fármacos, interacciones con el receptor,
fenómenos de resistencia, etc.
En que se enfoca la Ingeniería de tejidos
Producción de tejidos artificiales (piel, cartílagos) para el
tratamiento de grandes quemados, injertos o autotransplantes, etc.
Que se realiza en el area de investigacion y diagnostico de cancer
Generalmente se generan líneas celulares a partir de una muestra de tejido del tumor de un paciente, se cultivan en el laboratorio y sirven como modelo de estudio para dicha enfermedad.
Se estuidan cambios en la secuencia de ADN tales como mutaciones, deleciones o inserciones pueden constituir el inicio de una célula tumoral. A su vez, estudios
moleculares de líneas celulares tumorales permiten la detección de genes activados y silenciados determinando si corresponden a células de origen
pulmonar, ovárico, epidérmico etc. y así conocer el origen de un cáncer en
pacientes con metástasis.
