Diagnóstico Molecular de Enfermedades Infecciosas Flashcards
¿Cual es la identificacion por metodología clasica?
Identificacion fenotipica, principalmente microbiologicas
¿Qué consecuencias genera un tratamiento empirico antes de una identificacion mas precisa?
- Resistencia antimicrobiana
- Efectos secundarios por tratamientos inadecuados
- Mayor gasto relacionado al tratamiento
La biologia molecular, en la clinica sirve para 3 procesos, estos son:
Metodos de screening
Metodo de diagnostico
Metodo de monitoreo
¿Qué evitan las técnicas moleculares?
Evita desarrollo de resistencia antimicrobiana, efectos secundarios por tratamientos inadecuados, y menor gasto relacionado al tratamiento
Nombre algunas ventajas de las técnicas moleculares
Rapidez Alta sensibilidad y especificidad Aplicable a todo tipo de MO y requiere solo su DNA Permite hacer monitoreo de la enfermedad Detección de resistencia (mecA, KPC) Tipificación de MO Tipificacion de brotes
¿Cuales son los tipos de PCR que existen?
PCR multiplex (film array) qPCR (tiempo real) RT-PCR PCR-digital PCR-RFLP
¿Cual es el proposito fundamental de la PCR?
Amplificar exponencialmente un fragmento de ADN
¿Cuales son los componentes de PCR convencional?
- Muestra de ADN
- Primers:
- Enzima ADN polimerasa termoestable
- Sustratos para la enzima.
- Nucleótidos
- Cloruro de Magnesio
Describa la denaturación
Permite transformar una molécula de doble hebra a una de simple cadena mediante la ruptura de puentes de hidrogeno a través de la aplicación de temperaturas elevadas, 94ºC aprox
Describa la etapa annealing
Corresponde a la etapa de donde se delimita de forma específica la zona de amplificación, ya que se unen los primers a una temperatura entre los 40 a 65°C
Describa la etapa de extensión
Etapa que permite la accion de la taq polimerasa subiendo la temperatura sobre 70°C aprox, donde añade nuevos nucleotidos complementarios a la hebra molde originando una nueva molecula de DNA de doble hebra
¿Para que sirve la electroforesis en PCR convencional?
Para determinar si hubo o no amplificación mediante la visualización de bandas utilizando un transiluminador
Cada banda tiene un tamaño determinado, esto permite la comparación con las bandas del fragmento de interés. Si se observa una doble banda quiere decir que __________
La PCR no fue exacta por lo que se amplificaron mas fragmentos que el de interes
La PCR pose una sensibilidad de __________ y una especificidad de ______________ en un tiempo de deteccion entre 1 a __ horas
70 - 99%
86 - 100%
4 horas
¿Como se denomina la PCR que permite la detección cualitativa de varios segmentos de ADN o ARN en una sola reacción de PCR?
PCR multplex
Si PCR multiplex se acopla a qPCR esta tecnica se transforma en una técnica de tipo
Técnica de tipo cuantitativa
¿En que consiste el Film Array?
Corresponde a un sistema comercial de PCR múltiplex certificado donde incluye la preparación de la muestra, la amplificación, detección y el análisis
Clinicamente, ¿que permiten los kits de detección de PCR multiplex?
Identificación y diferenciación simultánea de especies (ej: E. coli)
Detección de genes de resistencia (S. aureus como MecA o IleS-1)
¿Cuantos patogenos puede detectar el FilmArray® Panel Meningitis/Encefalitis (ME)?
14
¿Cuantos patogenos puede detectar el Panel Respiratorio FilmArray™?
20
¿Que subunidades se utilizan para secuenciar bacterias y hongos respectivamente?
16S para bacterias y ITS o genes codificantes de proteínas para hongos
La secuenciación puede hacerse posterior a la _____________
Electroforesis con banda unica
Para la identificación inmediata de la amplificación en qPCR se hace a través de:
Sondas marcadas con un fluorocromo (Sondas TaqMan)
Fluoróforo que se une al ADN de doble hebra (SYBR Green)
¿En que consiste el qPCR?
En una técnica cuantitativa de detección y cuantificación inmediata del fragmento de ADN o ARN amplificado
¿Como ocurre la detección de fluorescencia mediante CYBR green?
Consiste en un fluoroforo que se intercala en DNA de doble cadena pudiendo medir la fluorescencia en termocicladores aptos para PCR en tiempo real
¿Como ocurre la detección de fluorescencia mediante Sondas Taqman?
Las sondas se hibridan al DNA durante el annealing, sin embargo, el colorante supresor (quencher) suprime la emision de fluorescencia. Cuando la taq polimerasa llega a la zona de la sonda, la hidroliza, permitiendo que emita la fluorescencia sin ser inhibida por el quencher.
En el grafico de emision de fluorescencia indica que mientras ________ cantidad de ciclos, _________ será la concentracion de DNA que posee la muestra
Menos
Mayor
V o F
En qPCR se pueden realizar detecciones frente a múltiples microorganismos en una única determinación, a través del uso simultáneo de diferentes sondas
Verdadero
¿En que se parece la PCR convencional y la PCR en tiempo real?
Ambas detectan DNA y lo amplifican
Poseen las mismas etapas
Requiere de mismos componentes
Caracteristicas de PCR en tiempo real
Amplificacion y deteccion en una sola fase
Mayor especificidad y sensibilidad
Los equipos y reactivos suelen ser mas costosos en comparacion de PCR convencional
¿Que significa la RT-PCR?
Es una PCR para ARN, ya que utiliza una transcriptasa reversa (RT) de donde deriva el nombre de la tecnica
¿A que corresponde la utilidad de RT-PCR?
- Estudios de expresión de genes
* Detección de virus ARN
Se transforma el ARN a _____________ en RT-PCR
ADN complementario
¿Que sondas utiliza la PCR digital?
Sondas taqman marcadas
¿Cual es la diferencia de PCR digital (dPCR) con las demas PCR?
Esta es una técnica cuantitativa ultrasensible donde el DNA se divide en microgotas que posee 1 molecula de DNA
¿Para que es util la dPCR?
Posee utilidad en:
Deteccion de MO
Deteccion de mutaciones
Cuantificacion de carga viral
¿En qué consiste la PCR-RFLP?
Consiste en una PCR convencional con un paso posterior incluido que involucra la digestión con enzimas de restricción en zonas especificas de interes, generalmente mutaciones
¿Cual es la utilidad de la PCR-RFLP?
En estudios de polimorfismos genéticos (SNPs)
¿Por qué la PCR-RFLP es una variacion de la PCR convencional?
Porque posterior a agregar las enzimas de restriccion se debe hacer una electroforesis, lo que permite observar la presencia de la mutacion o no segun el tamaño de las bandas
¿Que permiten los Microarrays?
La detección o estudio de un gran número de secuencias de forma simultánea ya que tienen cientos de sondas incrustadas en la plataforma para realizar el procedimiento
¿Cuales son las aplicaciones de los Microarrays?
- Estudios de expresión de genes
- Detección e identificación de microorganismos
- Detección de cientos de genes y SNPs
- Detección de genes de resistencia a drogas
¿Como se observan los genes compartidos en especies cuando se realiza una prueba por Microarrays?
Se superponen los colores designados para la secuencia de la especie
¿Cual es la importancia epidemiologica en la tipificacion de MO?
Permite:
- Reconocimiento de brotes (A través de perfiles de susceptibilidad)
- Estudios de transmisión cruzada a nivel intrahospitalario
Las tecnicas de tipificacion pueden dividirse en:
Técnicas fenotípicas y Técnicas moleculares
Las técnicas fenotípicas para la tipificacion de MO se caracterizan por:
- Basarse en caracteristicas fisiologicas de los MO
- Tener una baja reproducibilidad
- Tener un bajo poder discriminatorio (*Excepto los perfiles de resistencia)
Las técnicas moleculares para la tipificacion de MO se caracterizan por:
- Se basan en analisis de secuencias de DNA
- Tienen mayor reproducibilidad
- Posee mejor poder discriminatorio
- Permite establecer presencia de clones
¿Cuales son los tipos de técnica de tipificacion de MO por tecnicas molecular?
1) Basadas en el estudio de los perfiles de restricción del ADN
2) Fundamentadas en la amplificación de secuencias de ADN por PCR
3) Basadas en secuenciacion parcial de genes
¿Que técnica ocupan las tecnicas de tipificacion molecular basadas en el estudio de los perfiles de restricción del ADN?
Ocupan ADN plasmídico o cromosómico sometido a digestión con enzimas de restricción formando fragmentos variables, los cuales se visualizarán mediante Electroforesis en Gel de Campo Pulsado (PFGE)
¿En que consiste la tecnica de tipificacion molecular fundamentada en la amplificación de secuencias de ADN mediante PCR?
Realizan PCR de manera aleatoria (RAPD: Random amplification polymorphic DNA) mediante el uso de un primer de minima longitud (10 nucleotidos) hibridando zonas inespecificas en cada ciclo a temperaturas bajas (36-45ºC) y luego visualizar mediante Electroforesis
Nombre desventajas de las Técnicas moleculares?
- Elevado costo
- No discrimina entre portación e infección
- Presencia de falsos positivos (contaminacion) y negativos (erres de metodologia)
- Debe existir una sospecha previa
¿Por que pueden generarse falsos negativos en las tecnicas moleculares?
- Extracción de ADN defectuosa
- Inhibidores
- Problemas de PCR (Temperatura de anneling, concentración de Mg, etc).
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