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Diagnostico Molecular > Diagnóstico Molecular de Enfermedades Infecciosas > Flashcards

Diagnóstico Molecular de Enfermedades Infecciosas Flashcards

1
Q

¿Cual es la identificacion por metodología clasica?

A

Identificacion fenotipica, principalmente microbiologicas

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2
Q

¿Qué consecuencias genera un tratamiento empirico antes de una identificacion mas precisa?

A
  • Resistencia antimicrobiana
  • Efectos secundarios por tratamientos inadecuados
  • Mayor gasto relacionado al tratamiento
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3
Q

La biologia molecular, en la clinica sirve para 3 procesos, estos son:

A

Metodos de screening
Metodo de diagnostico
Metodo de monitoreo

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4
Q

¿Qué evitan las técnicas moleculares?

A

Evita desarrollo de resistencia antimicrobiana, efectos secundarios por tratamientos inadecuados, y menor gasto relacionado al tratamiento

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5
Q

Nombre algunas ventajas de las técnicas moleculares

A 
Rapidez
Alta sensibilidad y especificidad
Aplicable a todo tipo de MO y requiere solo su DNA
Permite hacer monitoreo de la enfermedad
Detección de resistencia (mecA, KPC) 
Tipificación de MO
Tipificacion de brotes
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6
Q

¿Cuales son los tipos de PCR que existen?

A 
PCR multiplex (film array)
qPCR (tiempo real)
RT-PCR
PCR-digital 
PCR-RFLP
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7
Q

¿Cual es el proposito fundamental de la PCR?

A

Amplificar exponencialmente un fragmento de ADN

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8
Q

¿Cuales son los componentes de PCR convencional?

A
  • Muestra de ADN
  • Primers:
  • Enzima ADN polimerasa termoestable
  • Sustratos para la enzima.
  • Nucleótidos
  • Cloruro de Magnesio
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9
Q

Describa la denaturación

A

Permite transformar una molécula de doble hebra a una de simple cadena mediante la ruptura de puentes de hidrogeno a través de la aplicación de temperaturas elevadas, 94ºC aprox

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10
Q

Describa la etapa annealing

A

Corresponde a la etapa de donde se delimita de forma específica la zona de amplificación, ya que se unen los primers a una temperatura entre los 40 a 65°C

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11
Q

Describa la etapa de extensión

A

Etapa que permite la accion de la taq polimerasa subiendo la temperatura sobre 70°C aprox, donde añade nuevos nucleotidos complementarios a la hebra molde originando una nueva molecula de DNA de doble hebra

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12
Q

¿Para que sirve la electroforesis en PCR convencional?

A

Para determinar si hubo o no amplificación mediante la visualización de bandas utilizando un transiluminador

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13
Q

Cada banda tiene un tamaño determinado, esto permite la comparación con las bandas del fragmento de interés. Si se observa una doble banda quiere decir que __________

A

La PCR no fue exacta por lo que se amplificaron mas fragmentos que el de interes

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14
Q

La PCR pose una sensibilidad de __________ y una especificidad de ______________ en un tiempo de deteccion entre 1 a __ horas

A

70 - 99%
86 - 100%
4 horas

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15
Q

¿Como se denomina la PCR que permite la detección cualitativa de varios segmentos de ADN o ARN en una sola reacción de PCR?

A

PCR multplex

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16
Q

Si PCR multiplex se acopla a qPCR esta tecnica se transforma en una técnica de tipo

A

Técnica de tipo cuantitativa

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17
Q

¿En que consiste el Film Array?

A

Corresponde a un sistema comercial de PCR múltiplex certificado donde incluye la preparación de la muestra, la amplificación, detección y el análisis

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18
Q

Clinicamente, ¿que permiten los kits de detección de PCR multiplex?

A

Identificación y diferenciación simultánea de especies (ej: E. coli)
Detección de genes de resistencia (S. aureus como MecA o IleS-1)

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19
Q

¿Cuantos patogenos puede detectar el FilmArray® Panel Meningitis/Encefalitis (ME)?

A

14

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20
Q

¿Cuantos patogenos puede detectar el Panel Respiratorio FilmArray™?

A

20

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21
Q

¿Que subunidades se utilizan para secuenciar bacterias y hongos respectivamente?

A

16S para bacterias y ITS o genes codificantes de proteínas para hongos

22
Q

La secuenciación puede hacerse posterior a la _____________

A

Electroforesis con banda unica

23
Q

Para la identificación inmediata de la amplificación en qPCR se hace a través de:

A

Sondas marcadas con un fluorocromo (Sondas TaqMan)

Fluoróforo que se une al ADN de doble hebra (SYBR Green)

24
Q

¿En que consiste el qPCR?

A

En una técnica cuantitativa de detección y cuantificación inmediata del fragmento de ADN o ARN amplificado

25
Q

¿Como ocurre la detección de fluorescencia mediante CYBR green?

A

Consiste en un fluoroforo que se intercala en DNA de doble cadena pudiendo medir la fluorescencia en termocicladores aptos para PCR en tiempo real

26
Q

¿Como ocurre la detección de fluorescencia mediante Sondas Taqman?

A

Las sondas se hibridan al DNA durante el annealing, sin embargo, el colorante supresor (quencher) suprime la emision de fluorescencia. Cuando la taq polimerasa llega a la zona de la sonda, la hidroliza, permitiendo que emita la fluorescencia sin ser inhibida por el quencher.

27
Q

En el grafico de emision de fluorescencia indica que mientras ________ cantidad de ciclos, _________ será la concentracion de DNA que posee la muestra

A

Menos

Mayor

28
Q

V o F
En qPCR se pueden realizar detecciones frente a múltiples microorganismos en una única determinación, a través del uso simultáneo de diferentes sondas

A

Verdadero

29
Q

¿En que se parece la PCR convencional y la PCR en tiempo real?

A

Ambas detectan DNA y lo amplifican
Poseen las mismas etapas
Requiere de mismos componentes

30
Q

Caracteristicas de PCR en tiempo real

A

Amplificacion y deteccion en una sola fase
Mayor especificidad y sensibilidad
Los equipos y reactivos suelen ser mas costosos en comparacion de PCR convencional

31
Q

¿Que significa la RT-PCR?

A

Es una PCR para ARN, ya que utiliza una transcriptasa reversa (RT) de donde deriva el nombre de la tecnica

32
Q

¿A que corresponde la utilidad de RT-PCR?

A
  • Estudios de expresión de genes

* Detección de virus ARN

33
Q

Se transforma el ARN a _____________ en RT-PCR

A

ADN complementario

34
Q

¿Que sondas utiliza la PCR digital?

A

Sondas taqman marcadas

35
Q

¿Cual es la diferencia de PCR digital (dPCR) con las demas PCR?

A

Esta es una técnica cuantitativa ultrasensible donde el DNA se divide en microgotas que posee 1 molecula de DNA

36
Q

¿Para que es util la dPCR?

A

Posee utilidad en:
Deteccion de MO
Deteccion de mutaciones
Cuantificacion de carga viral

37
Q

¿En qué consiste la PCR-RFLP?

A

Consiste en una PCR convencional con un paso posterior incluido que involucra la digestión con enzimas de restricción en zonas especificas de interes, generalmente mutaciones

38
Q

¿Cual es la utilidad de la PCR-RFLP?

A

En estudios de polimorfismos genéticos (SNPs)

39
Q

¿Por qué la PCR-RFLP es una variacion de la PCR convencional?

A

Porque posterior a agregar las enzimas de restriccion se debe hacer una electroforesis, lo que permite observar la presencia de la mutacion o no segun el tamaño de las bandas

40
Q

¿Que permiten los Microarrays?

A

La detección o estudio de un gran número de secuencias de forma simultánea ya que tienen cientos de sondas incrustadas en la plataforma para realizar el procedimiento

41
Q

¿Cuales son las aplicaciones de los Microarrays?

A
  • Estudios de expresión de genes
  • Detección e identificación de microorganismos
  • Detección de cientos de genes y SNPs
  • Detección de genes de resistencia a drogas
42
Q

¿Como se observan los genes compartidos en especies cuando se realiza una prueba por Microarrays?

A

Se superponen los colores designados para la secuencia de la especie

43
Q

¿Cual es la importancia epidemiologica en la tipificacion de MO?

A

Permite:

  • Reconocimiento de brotes (A través de perfiles de susceptibilidad)
  • Estudios de transmisión cruzada a nivel intrahospitalario
44
Q

Las tecnicas de tipificacion pueden dividirse en:

A

Técnicas fenotípicas y Técnicas moleculares

45
Q

Las técnicas fenotípicas para la tipificacion de MO se caracterizan por:

A
  • Basarse en caracteristicas fisiologicas de los MO
  • Tener una baja reproducibilidad
  • Tener un bajo poder discriminatorio (*Excepto los perfiles de resistencia)
46
Q

Las técnicas moleculares para la tipificacion de MO se caracterizan por:

A
  • Se basan en analisis de secuencias de DNA
  • Tienen mayor reproducibilidad
  • Posee mejor poder discriminatorio
  • Permite establecer presencia de clones
47
Q

¿Cuales son los tipos de técnica de tipificacion de MO por tecnicas molecular?

A

1) Basadas en el estudio de los perfiles de restricción del ADN
2) Fundamentadas en la amplificación de secuencias de ADN por PCR
3) Basadas en secuenciacion parcial de genes

48
Q

¿Que técnica ocupan las tecnicas de tipificacion molecular basadas en el estudio de los perfiles de restricción del ADN?

A

Ocupan ADN plasmídico o cromosómico sometido a digestión con enzimas de restricción formando fragmentos variables, los cuales se visualizarán mediante Electroforesis en Gel de Campo Pulsado (PFGE)

49
Q

¿En que consiste la tecnica de tipificacion molecular fundamentada en la amplificación de secuencias de ADN mediante PCR?

A

Realizan PCR de manera aleatoria (RAPD: Random amplification polymorphic DNA) mediante el uso de un primer de minima longitud (10 nucleotidos) hibridando zonas inespecificas en cada ciclo a temperaturas bajas (36-45ºC) y luego visualizar mediante Electroforesis

50
Q

Nombre desventajas de las Técnicas moleculares?

A
  • Elevado costo
  • No discrimina entre portación e infección
  • Presencia de falsos positivos (contaminacion) y negativos (erres de metodologia)
  • Debe existir una sospecha previa
51
Q

¿Por que pueden generarse falsos negativos en las tecnicas moleculares?

A
  • Extracción de ADN defectuosa
  • Inhibidores
  • Problemas de PCR (Temperatura de anneling, concentración de Mg, etc).
52
Q

t

A

Diagnostico Molecular (14 decks)

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