Introducción a las ciencias Ómicas y su relevancia en el diagnóstico clínico I Flashcards
¿Cuáles son las aplicaciones que tiene el diagnostico molecular en el campo clínico?
Tiene aplicaciones en la medicina de precisión (estudio del genoma de cada individuo), industrias farmacéuticas, nanotecnologías
¿En que se utiliza la biologia molecular en la medicina de precisión?
Estudio del genoma para determinar tratamientos especificos para la persona. Medicina personalizada
¿Que estudia la genomica?
Material genetico en si, estudia el DNA de organismos
¿Cuáles son los beneficios de las ciencias omicas ?
Personalización de la medicina para cada individuo
Conocimiento ampliado sobre nuevos mecanismos de accion en los sistemas biológicos
Transversalidad ya que se pueden usar en varios ámbitos
Desarrollo de la industria farmaceutica
¿Que estudia la transcriptomica?
Estudia RNA mensajeros, ya sea de celulas, tejido u organo
¿Que estudia la proteomica?
Proteinas de una celula
¿Que estudia la metabolomica?
Estudia metabolitos (compuestos intermedios de bajo peso molecular)en una celula, tejido u organo
A que esta relacionada las ciencias genomicas
o Relacionada con la genética de la población. o Riesgo genético en enfermedades o Variación somática o Aplicación y nuevas tecnologías o Secuencia clínica
¿Por qué la genomica está relacionada con la genetica de poblaciones?
Por que permite determinar las variaciones y la homogeneidad en el DNA de determinadas poblaciones. Asocia factores de riesgo con el fenotipo
Cual es la base metodológica de la técnica de extracción PCR
Corresponde a un método enzimático de amplificación de secuencias especificas del ADN
¿Por qué la genomica está relacionada con las variaciones somaticas?
Porque las variaciones somaticas permiten ver los procesos no codificados en la secuencia de DNA, como la metilacion, acetilacion, alquilacion, etc
Cuales son las aplicaciones que tiene la técnica PCR
Amplificación de genes, genotipificación, detección de mutaciones
¿De qué depende la extracción de DNA?
Tipo de muestra
Tipo celular
Del objetivo
Cuales son las ventajas y desventaja de la técnica PCR
Ventajas: Limite de detección muy alto
Desventajas: Requieren de material genético bicatenario
¿Por qué el tipo de muestra influye en la extraccion de DNA?
Porque varia la matriz de donde deriva el DNA se encuentra, de esto tambien depende la tecnica a utilizar para la extracción
¿Por qué el tipo de celula influye en la extraccion de DNA?
Porque en una muestra pueden estar incluidos celulas de origen viral/bacteriano incluyendo DNA de estos
¿Qué es importante considerar en la extracción de acidos nucleicos?
Cantidad
Calidad
Pureza
¿Cuales son los pasos fundamentales de la extracción?
Pre-tratamiento
Lisis celular
Purificacion de DNA
¿Qué puede mencionar del pre-tratamiento de la muestra en la extraccion?
Depende de la matriz de la muestra, ya que algunas veces requieren procedimientos distintos
Puede realizarse por: Neutralizacion o tratamiento con solventes orgánicos
¿Mediante qué se realizar la lisis celular en la extraccion de DNA?
Mediante disrupción mecánica o agentes químicos
¿Como se purifica el DNA?
A través de precipitación o matrices (asociado a kit comerciales)
¿Qué se debe considerar para la preparación de muestra de ácidos nucleicos?
- Liberar acidos nucleicos
- Protección y estabilización de los ácidos nucleicos frente a la degradación
- Eliminación de inhibidores de la amplificación
- Concentración del producto de extracción
- Almacenar el producto de extracción en un medio acuoso compatible con el método de amplificación
¿Qué quiere decir cuando dice que se debe considerar la liberación de acidos nucleicos?
La liberacion de acidos nucleicos puede variar segun el MO del que se extrae, algunas membranas pueden tener mayor complejidad que otras.
¿Qué quiere decir cuando dice que se debe considerar la protección y estabilizacion de acidos nucleicos frente a la degradación?
El RNA tiende a ser mas inestable que el DNA, por lo que es mas facil que se desintegre. Para evitar esto la extracción debe ser mas sensible para evitar moleculas en el medio que generen la desestibilización de la molecula
¿Qué quiere decir cuando dice que se debe considerar la eliminación de inhibidores especificos de la amplificación?
Se debe considerar las caracteristicas del origen de la muestra y la matriz de esta
¿Qué quiere decir cuando dice que se debe considerar la concentración del producto de extracción?
Algunas muestras poseen menos concentracion de MO, y por ende, menor cantidad de DNA.
¿Qué quiere decir cuando dice que se debe considerar el almacenamiento del DNA en medio acuoso?
Debe estar en medio acuoso compatible con el metodo de amplificación, por ende, los ácidos nucleicos deben estar en matrices donde estén estables y que sean compatibles con el siguiente paso a utilizar para su análisis.
¿Para qué sirve el metodo fenol/cloroformo?
Un metodo para romper paredes celulares y desnaturizar proteinas que protegen el DNA
¿En que consiste el metodo fenol/cloroformo?
1) Se agrega proteinasa K y SDS para romper estructuras celulares
2) Se agrega fenol cloroformo para separar proteinas del DNA
3) Se centrifuga y DNA queda en precipitado
4) DNA se purifica con etanol o centrifugacion
5) se cuantifica por PCR
¿Para que sirve el metodo Chelex?
Para extraer DNA mediante una enzima que evita que metales se unan al DNA desintegrando la estructura
¿En que consiste el metodo de extracción por kit comerciales?
Ocupa la lisis celular por accion mecanica basado en metodos de columnas que poseen afinidad al DNA
¿Cuales son los pasos que quiere la extracción de RNA?
1) Lisis celular y disrupcion de la membrana
2) Inhibición de las proteínas con actividad
3) Desproteinización (destruccion de proteinas asociadas a la molecula)
4) Precipitación
¿A través de que métodos se puede realizar la cuantificación de ADN?
Espectrofotometría, gel, PCR, fluorescencia.
Como se cuantifica el ADN en espectrofotometría.
Este se basa en la absorcion de luz de las bases nitrogenadas, en donde el ADN absorbe a los 260 nm
¿Cuales son los componentes de la reaccion en cadena de la polimerasa?
- Molde de DNA
- Buffer
- dNTPs
- Primers
- ADN polimerasa (Taq)
Se puede ver la integridad del ADN por medio de la espectrofotometria
Si, haciendo la comparacion de absorbancia con las proteinas (A=280nm). Si hay un ratio entre 1,7 y 2 el ADN se encuentra en una calidad aceptable
Mencione algunas caracteristicas de la ADN polimerasa Taq
- Enzima termoestable aislada de Thermus aquaticus
- La temperatura optima para su actividad es de 72°C
- No reconoce simple cadena, solo doble
- Tiene actividad de polimerasa 5’-3’ y actividad de exonucleasa 5’-3’
- Carece de actividad de exonucleasa 3’-5’
¿Qué componente marca los extremos del segmento diana que se amplificarán?
Primers
¿Qué caracteristicas deben tener los primers?
1) una longitud entre los 18 y 25 bases
2) El valor de Tm no debe variar en más de 5°C uno del otro.
3) El extremo 3’ debe ser G o C
4) El contenido de G/C debe ser de 45–55%.
5) Evitar secuencias repetidas
¿Qué significa Hairpin?
Primer que puede interactuar entre si (interacción intraprimer) debido a complementariedad ocurriendo autohibridación
¿Qué significa Self-dimer?
Los primers pueden hibridarse entre primers, evitando que se pueda unir con el DNA
En una electroforesis posterior a la PCR ¿que significa que no haya banda o esta sea muy delgada?
Si no hay banda quiere decir que no hay amplificación de la secuencia, cuando la banda es muy delgada puede deberse a que la amplificación no se realizó correctamente
En que consiste cada ciclo de PCR
- Desnaturalización (95°C)
- Annealing (55-60°C)
- Extensión (72°C)
Para optimizar la reacción de PCR, ¿Qué se debe considerar?
- Optimizar la reacción de PCR
- Concentración de ADN molde.
- Concentración de primers.
- Número de ciclos.
- Tiempos de denaturación, annealing y extensión.
- Temperatura de Annealing de los partidores.
- Concentración de Mg2+.
Cuantos ciclos de PCR se requieren para obtener una gran amplificación de ADN
Entre 30 a 35 ciclos
¿Que sucede cuando se superan los 35 ciclos de PCR?
Se comienzan a acumular productos inespecificos. Los primers pueden ampliar segmentos no especificos. Ocurre un efecto Plateau en la curva de ciclos.
¿Cuales son las caracteristicas del proceso de PCR?
Posee un rendimiento exponencial, una alta especificidad y sensibilidad, ademas de una alta fidelidad
¿Por que se observa una curva de Plateau en los ciclos de PCR?
- Depleción de sustratos.
- Reanneailing de los productos.
- Baja la actividad de la polimerasa.
A que se refiere que la técnica PCR posee una alta fidelidad?
Que tiene la capacidad de copiar secuencias con precisión, sin introducir mutaciones
¿De que depende la optimización de la temperatura en Annealing?
De la longitud, la composicion del primer y de la temperatura de melting o fusion (Tm) de los primers
A que se refiere que la técnica PCR posee una alta sensibilidad y especificidad?
Es sensible ya que solo necesita reconocer al menos una molecula de ADN para comenzar el proceso y es especifica ya que los cebadores codifican para una region en particular.
¿Que significa Tm?
Corresponde a la temperatura a la cual la mitad de las moléculas primers esta apareadas con el DNA molde.
¿Cómo puede verse la electroforesis si la temperatura de Annealing no es la adecuada?
La amplificación se verá inespecifica mediante un patron con abundantes bandas
¿Son importante los errores que se pueden llegar a producir en la PCR?
No si es para clonamiento de productos, corte de enzimas de restricción, sin embargo si importan si se esta estudiando alguna mutación o secuenciación.
Nombre 4 variantes de la técnica PCR
RT-PCR
PCR en tiempo real
Hot start PCR
Colony PCR
Mencione las ventajas del diagnostico molecular
1) Mayor sensibilidad para el diagnostico
2) Mayor rapidez
3) Requiere muestras menos invasivas
En que consiste la tecnica de southern blot
Es una técnica simple y fácil de realizar que detecta fragmentos de DNA, separados por tamaño
mediante electroforesis en gel.
Cuales son las 5 etapas del southern blot
Separacion electroforetica Desnaturalizacion Transferencia Hibridacion Deteccion
¿A qué se refiere cuando PCR posee una mayor sensibilidad para el diagnostico?
La tecnica determina la presencia de secuencias de gen de antigenos en las primeras etapas de la infección aun cuando no hay sintomatología
¿Que es el northern blot?
Es similar a la tecnica de southern blot, sin embargo esta tecnica analiza ARN
¿Cuáles son las desventajas que presentan las técnicas tanto como southern blot y northern blot?
Se necesita una gran cantidad de muestra, es un ensayo demorado y además hace uso de sondas marcadas con radioisótopos
¿Como ocurre el procedimiento para tecnicas de Southern blot?
1) Se realiza la extracción de DNA mediante enzimas de restricción
2) El fragmento se corre en la placa electroforetica
3) Cuando el patron se observa en la placa, se transfiere a membrana de nitrocelulosa (o nylon)
4) En la membrana habrán sondas de DNA marcadas con isotopos radioactivos, por complementariedad la secuencia de DNA se hibrida
5) La membrana se revela mediante Rayos X para obtener un patrón de barrido especifico
¿Qué son los microarrays?
Un microarreglo es una distribución ordenada de genes en una pequeña superficie, y mediante la hibridación con sondas de ácidos nucleicos que permite obtener una manifestación de las respuestas celulares de múltiples en un solo análisis.
¿Bajo que principios se realiza la tecnica de Southern Blot?
Se basa en principios de hibridacion bajo la capacidad de complementariedad del DNA
¿Cuáles son algunas aplicaciones de los microarrays?
- Detección de mutaciones y polimorfismo
- Desciframiento de los mecanismos moleculares subyacentes a la enfermedad
- Identificación de nuevos genes como dianas terapéuticas
Que muestras se necesitan para realizar un microarray
Se debe utilizar una muestra de una persona positiva y negativa (persona sana y enferma respectivamente) para ver la expresión de ambos genes
El souther blot esta tiene una agrupación de sándwich constituido por varias capas, mencione cuales son estas:
1) Solución de buffer
2) Esponja que absorbe el buffer
3) Gel de agarosa
4) Membrana
5) Papel filtro
¿Cual es la diferencia del Southern blot con el Nouthen blot?
1) Nouthern blot es una técnica para detección de RNA
2) Nouthern blot no ocupa enzimas de restricción
¿Qué muestras se deben utilizar para microarray?
Se debe utilizar una muestra de una persona positiva y negativa
