H19 genetische code en eiwitsynthese Flashcards
Slide 6 H19 voor experiment Beadle & Tatum
Zal ik checken
Slide 9 H19 voor experiment Pauling % Ingram & Yanofsky
Jippie
Definitie gen in 2024
Gen is een functionele DNA eenheid dat codeert voor 1 of meerdere polypeptiden en/of functionele niet-coderende RNAs
Slide 13 H19 voor experiment Crick & Brenner
Nog meer?
Overlapping in genen
-Genetische code is niet overlappend
-Genen kunnen wel overlappen -> ontdekt bij bepaalde virussen en bacteriën, ook aanwezig in humaan genoom
Cel-vrij systeem
Plasmamembraan is vernietigd en alle componenten belangrijk voor eiwitsynthese zijn eruit gehaald
Polynucleotide fosforylase
In staat om RNA te synthetiseren zonder een template
Slide 19 H19 voor bepaalde polymeren begrippen
Zal ernaar kijken
Eigenschappen genetische code
-Gedegenereerd, maar met bevooroordeeld codongebruik (‘codon usage bias’)
-Is niet overlappend
-Is éénduidig
-Is universeel met enkele uitzonderingen
(bv. in mitochondriën worden UGA (stop) tryptofaan)
Locatie ribosomen
-Vrij in cytosol
-Gebonden aan membraan van ER en buitenste membraan celkern
Opbouw ribosoom
-50S subeenheid: E (exit) site, P (peptidyl) site, A (aminoacyl) site
-30S subeenheid: mRNA binding site
Aminoacyl-tRNA
= geactiveerd aminozuur = geladen tRNA
-Esterbinding tussen de carboxylgroep van het aminozuur en 2’ of 3’ hydroxylgroep van ribose van de adenosine gelegen aan het 3’ uiteinde van het tRNA
-3’ uiteinde van tRNA: -CCA sequentie
-Hoog energetische esterbinding
Anticodon
Herkenningspunt in tRNA waaraan het mRNA bindt, het bindt dus niet aan het aminozuur direct.
3D vorm tRNA
Meer een L dan een jezus kruis
Codon-anticodon
-De anticodons van aminoacyl-tRNAs herkennen het codon van het mRNA door complementaire basenparing
-Codon: bv. AGA = 5’-AGA-3’
-Anticodon: bv. UCU = 3’-UCU-5’
-61 codons - ca. 35 tRNA
Wobble basenparing
-Alternatieve basenparing op de derde positie van het codon
-Sommige tRNAs herkennen daardoor meerdere codons die voor hetzelfde aminozuur coderen
Ken je de tabel op slide 34 H19 al uit je hoofd
Helaas niet, maar ik ga hem speciaal voor jou wel leren
Aminoacyl-tRNA synthetase
-Verbindt aminozuur met corresponderend tRNA
-Katalyseert de vorming van de esterbinding = hoge energetische binding
-Twee stappen: aminozuur activatie en aminozuur transfer
-22 verschillende corresponderend me de aminozuren plus de situationele
Activatie site
Plaats waar de esterbinding gevormd wordt op aminoacyl-tRNA synthetase, eerste zeef
(slide 41 H19)
Editing site
Plaats waar de esterbinding verbroken kan worden door hydrolyse op aminoacyl-tRNA synthetase, tweede zeef
(slide 41 H19)
Startcodon
AUG (methionine)
Monocistronisch mRNA
1 mRNA codeert voor 1 polypeptide
Polycistronisch mRNA
-1 mRNA codeert voor verschillende polypeptiden met vergelijkbare functies
-De transcriptionele eenheid wordt dan een operon genoemd
Overzicht translatie
- Initiatie
- Elongatie
- Terminatie
2 verschillende tRNAmet coderende genen
-Zowel bij Prok als bij Euk
-Initiator tRNA en elongator tRNA
-Verschil zit in de toegevoegde N-formyl groep aan de initiator bij de N-terminus
Initiatie stap 1 bij bacteriën
-3 initiatiefactoren (IF) binden aan de kleine ribosomale eenheid (30S)
-GTP is gebonden op IF2 en gaat vervolgens verder op de ribosomale subeenheid
Initiatie stap 2 bacteriën
mRNA en methionyl-tRNAfmet binden op 30S subeenheid
Shine-Dalgarno seq.
-Ligt stroomopwaarts van het AUG in mRNA
-Is complementair aan een regio in het 3’ van 16S rRNA
-Bindingsplaats voor het ribosoom op de P-site
Initiatie stap 3 bacteriën
-Nadat IF3 is vrijgekomen: 50S bindt op de 30S initiatie complex ter vorming van het 70S initiatie complex
-Binding van de 50S subeenheid stimuleert de hydrolyse van GTP gebonden op IF2
-IF2 en IF1 komen los van het complex
Initiatie translatie Euk
-12 eukaryotische eIF: bv. eIF1
-Vorming van 43S preinitiatie complex (PIC): zonder mRNA -> eIF2*GTP bindt eerst initiator methionyl-tRNAmet, daaropvolgend binding op 40S ribosomale subeenheid
-Binding van eIFs op mRNA: eIF4E bindt op 5’ cap en recruteert eIF4G en vervolgens eIF4A (=helicase activiteit) en eIF4B
-Binding van 43S PIC op mRNA: eIF4G bindt eIF3, 40S interageert met het mRNA
Initiatie translatie Euk na binding PIC
-eIF2GTP hydrolyseert GTP: eIF 1/4B/5 en eIF2-GDP komen vrij
-eIF5BGTP bindt
-40S scant mRNA tot AUG! Methionyl-tRNAiMet bindt AUG
-60S bindt, eIF5B*GTP hydrolyseert GTP, eIF5B-GDP en eIF1A dissociëren
(slide 56)
Belangrijke eIF
eIF2GTP
eIF3
eIF4E
eIF4G
eIF4A
eIF5BGTP
Eukaryotisch mRNA
-Meestal: ribosoom gerekruteerd via 5’ cap
-Soms: ribosoom gerekruteerd via IRES: ‘internal ribosome entry sequence’ (upstream van start codon bv. virale mRNA
Functie PABP
-Poly(A) bindend proteïne
-PABP bindt ook eIF4G
-eIF4G kan ook 3’ van mRNA rechtstreeks binden
-3’ uiteinde stabiliseert 5’ uiteinde
Overzicht elongatie
- Binding aminoacyl-tRNA
- Vorming van een peptidebinding
- Translocatie
Gelden voor Euk en Prok, enkel verschillende elongatiefactoren
Elongatie stap 1 bacteriën
-EF-TuGTP herkent alle aminoacyl-tRNAs, behalve de initiator
-Aminoacyl-tRNA met gebonden EF-TuGTP worden willekeurig naar de A site gebracht
-Juiste aminoacyl-tRNA: correcte basenparing tussen codon en anticodon, dan hydrolyse van GTP en conformatie verandering, EF-Tu*GDP komt vrij en met EF-Ts wordt het gerecycled
-Verkeerde: foute basenparing, dan geen GTP hydrolyse, indien toch hydrolyse bij foute basenparing wordt het verkeerde aminoacyl-tRNA verwijdert door ribosoom
-Slechts 1 fout per 10.000 incorporaties bij translatie
(slide 62)
Elongatie stap 2 bacteriën
-Peptidebinding tussen de carboxylgroep van AZ (van tRNA) op P plaats en de amino-groep van het AZ op de A plaats
-Vorming van peptidebinding gekatalyseerd door ribozyme
-rRNA met peptidyl-transferase activiteit = ribozyme, 23S in bacteriën en 28S in eukaryoten
-Mehtionine van het methionyl-tRNAfmet (op P plaats) gaat over naar aminoacyl-tRNA op de A plaats ter vorming van een peptidyl-tRNA
-Energie uit de hoog energetische esterbinding
Elongatie stap 3 bacteriën: translocatie
-EF-TuGTP: transiënte associatie met ribosoom
-Peptidyl-tRNA van A komt op de P-plaats van het ribosoom en ‘leeg’ tRNA van P komt op de E plaats, peptidyl-tRNA blijft geassocieerd met mRNA
-Hoe? -> grote ribosomale subeenheid schuift 3 nt op, EF-TuGTP bindt op de vrijgekomen A plaats, hydrolyseert GTP, leidt tot conformatie verandering in het ribosoom, waarbij ook de kleine ribosomale subeenheid 3 nt opschuift, EF-Tu*GDP heeft lagere affiniteit voor ribosoom, dissocieert en A plaats is terug vrij
-mRNA wordt in de 5’->3’ richting gelezen
-Herhaling van de cyclus
-Polypeptide van 400 AZ in 10 sec in E. coli
Terminatie translatie
-Stop codon in A plaats, wordt niet herkend door aminoacyl-tRNA
-Herkenning door release factors (eiwitten met een peptide anticodon/ release factor*GTP)
-Vrijkomen van polypeptide: watermolecule valt de esterbinding aan
-GTP hydrolyse
-Dissociatie van het ribosoom
-Gelijkend proces bij prokaryoten en eukaryoten, maar de release factoren zijn verschillend
Elongatie energieverbruik
-Hydrolyse van van ten minste 4 energierijke fosfoanhydride bindingen per toegevoegd AZ (hydrolyse van één fosfoanhydride binding: 7.3 kcal/mol)
-Synthesis (in de elongatiestap) van polypeptide van 100 Aminozuren: 2920 kcal/mol
Moleculaire chaperons
Bevorderen correcte vouwing van het polypeptide in de cel door:
-Binden tijdens de translatie op de hydrofobe regio’s in het ongevouwen eiwit, voorkomen van binding andere eiwitten
-Ook binden op hydrofobe regio’s van misgevouwen eiwitten om de 3D te herstellen
-Kunnen individuele misgevouwen eiwitten extraheren uit aggregaten
Andere functies moleculaire chaperons
Helpen ook bij de assemblage van gevouwen polypeptiden in multisubeenheden eiwitten & bevorderen proteïne transport naar en in de mitochondria en chloroplasten
Slide 84-86 voor verdere uitbreiding
Toppie
‘Indels’
Insertie of deletie van 1 nt, meerdere nt of grote stukken DNA
Missense mutatie
1 nt mutatie resulteert in een ander aminozuur
Nonsense mutatie
1 nt mutatie resulteert in een stopcodon
Nonstop mutaties
Een stopcodon muteert waardoor de translatie door blijft gaan
Stille (silent) mutaties
1 nt mutatie resulteert in geen verandering van het aminozuur
Algemene oplossingen voor nonsense/nonstop mutatie
-Suppressor tRNAs bv. nonsense suppressor tRNA
-Nonsense gemedieerde mRNA afbraak (NMD)
-Nonstop mRNA decay
Nonsense suppressor tRNAs
-Een tRNA muteert mee met een gen dat een stopcodon is geworden, waardoor het oorspronkelijke AZ toch geplaatst wordt
-De locatie van het stopcodon is ook belangrijk, dus niet ieder stopcodon wordt nu het nieuwe AZ
Nonsense mediated mRNA decay (NMD)
-Afbraak van transcripten met premature stopcodons (PTC)
-Tijdens translatie herkent ribosoom transcripten met stopcodon vóór laatste EJC, translatie stopt en mRNA wordt gemarkeerd voor afbraak
-Kwaliteitscontrole van mRNA door ribosoom
(slide 96)
Nonstop mRNA decay
-Transcripten zonder stopcodon
-Euk: via rektrutering van een eiwitcomplex met ribonuclease activiteit op A-site
cDNA van GFP
-cDNA= complementair DNA = DNA complementair aan de (m)RNA sequentie
-Synthese van cDNA door reverse transcriptase
-Welke primer gebruiken?:
1.Oligo-(dT): alle mRNAs met een poly-(A) staart worden omgezet in cDNA
2.Willekeurige (‘random’) hexameren: alle RNAs worden omgezet in cDNA
Algemene post-translationele modificaties
-Verwijderen van eerste aminozuur (Met)
-Proteolytische processing
-Chemische modificaties
-Proteïne splicing: ‘inteins’ worden verwijderd uit een polypeptide en ‘exteins’ worden aan elkaar gezet ter vorming van het matuur eiwit
Post-translationele processing van insuline
-Verwijdering van N-terminale aminozuren
-Vorming van zwavelbruggen tussen A en B ketens
-Verwijdering van aminozuren tussen A en B ketens
Chemische modificaties (covalente binding en omkeerbaar)
(1) Fosforylering op Ser/Thr/Tyr: fosfaatgroep op de –OH groep, eiwitkinasen & eiwitfosfatase
(2) Acetylering op Lys: acetylgroep op aminogroep van Lys, acetyltransferase & deacetylase
(3) Methylering op Lys/Arg: methylgroep (CH3-) op de aminogroep van Lys of Arg, methyltransferase & demethyltransferase
(4) Glycosylering op Ser/Thr/Asn: binding van een suiker op zuurstof (O) of stikstof (N) atoom
Ser/Thr: 0-linked glycosylering
Asn: N-linked glycosylering
Slide 114 is een kennisclip, moet je kennen
Top
Exocytose
Afgave van intracellulair materiaal
Endocytose
Opname van extracellulair materiaal door vorming van endocytotische vesikel thv PM
Verschillende vormen endocytose
-Fagocytose: opname van grote deeltjes (> 0,5 μm)
-Opname via kleine vesikels: pinocytose (opname van vloeistof en opgeloste stoffen), receptor-gemedieerde endocytose (opname van ligand)
Fagocytose cellen voorbeelden
-Macrofagen en neutrofielen (WBC)
-Opruimen van bacteriën, parasieten, dode en apoptotische cellen, kankercellen, …
Mechanisme fagocytose
-Binding van bacterie aan PM van macrofaag, neutrofiel
-Vorming van pseudopodia: membraanuitsteeksels die bacterie insluiten
-Fusie pseudopodia en vorming van fagosoom
-Fusie met endosoom -> maturatie tot (fago)lysosoom
-Afbraak van bacterie in (fago)lysosoom
(slide 6 H6.3)
Slide 7-8 H6.3 voor jezelf zien
SIR YES SIR!
Belangrijke stap maturaties fagosoom -> fagolysosoom
-Aanzuring van lumen door V-type H+ pomp
-Ontvangen van zure hydrolasen vanuit endosomen/lysosomen
Binding macrofaag aan apoptotische cel
- Macrofaag aangetrokken tot ‘find-me’ signalen van apoptotische cel
- Herkenning van ‘eat-me’ signalen en verzwelging van lijk (vaak fosfatidylserine, want alleen cytoplasmatisch standaard)
- Verwerking en degradatie van lijk
- Post verzwelging consequenties
Mechanisme receptor-gemedieerde endocytose
-Binding aan receptor in PM -> selectiviteit
-Instulping van PM en vorming van coated pit: belang van manteleiwitten
-Afsnoering en vorming van endocytotische vesikel
Mechanisme receptor-gemedieerde endocytose gevorderd
slide 12-14 H6.3, veel te veel om op te schrijven op een kaartje
LDL-partikel
-‘Vetbol’ in bloed
-Samenstelling: fosfolipiden monolaag als perifere schil, cholesterolesters en TG in centrum van partikel, 1 eiwit ApoB-100
-Transportvehikel voor cholesterol en TG in bloed, opname door cellen via RME
LDL-receptor
-Integraal PM eiwit
-Extracellulair deel: binding van LDL-partikel via ApoB-100
-Intracellulair deel: binding manteleiwitten
Endocytose van LDL-partikel via LDL-receptor
-Opname van LDL-partikel via LDL-receptor
-Differentiële sortering in vroeg endosoom -> dissociatie van LDL-partikel van receptor, LDL-receptor keert terug naar PM en LDL-partikel transport naar lysosoom
-Afbraak van LDL-partikel in lysosoom -> vrijstelling van cholesterol, transport van cholesterol naar cytosol
Familiale hypercholesterolemie
-Erfelijke aandoening: verhoogde cholesterol concentratie in bloed -> normaal [Cho]bloed < 190 mg/dl, indien cholesterol stijgt -> slaat neer in vaatwand -> atheromatosis, hoge morbiditeit en mortaliteit (hartinfarct, cerebrovasculair accident)
-Genetica -> mutaties in gen voor LDL receptor (defect cyto domein), mutaties in gen voor AP2 subeenheid
Lysosomen algemeen
-‘Terminaal’ organel
-Omgeven door enkel membraan (0,5 μm diameter)
-Luminale pH = 4 à 5 -> V-type protonpomp
-Zure hydrolasen in lumen -> afbraak van eiwitten, DNA, suikers, lipiden, …
-Membraantransporters -> vrijstelling van afbraakproducten
Functie lysosomen
-Opruimen van moleculen aangevoerd via endocytose, (auto)fagocytose -> vrijstellen van afgebroken moleculen
-Metabole sensor voor de cel
Sortering zure hydrolasen naar lysosoom via secretorische route deel 1
-rER: aanmaak van zure hydrolase -> cotranslationele translocatie en N-glycosylering
-Golgi: modificering van kernsuikergroep -> vorming van mannose-6-fosfaat tag (M6P), specifieke modificering voor zure hydrolasen
-TGN: sortering in transportvesikels -> binding M6P aan receptor (membraaneiwit), vorming van transportvesikel met zure hydrolasen in lumen
Sortering zure hydrolasen naar lysosoom via secretorische route deel 2
-Vesikulair transport: TGN -> endosoom; fusie met endosoom
-Endosoom; luminale pH: 6 (vroeg) -> 5 (laat endosoom), dissociatie van M6P tag van receptor door lage pH -> ZH vrij in lumen van endosoom, ZH stromen door naar lysosoom, M6P receptor sortering in transportvesikel en terugkeer naar TGN
-Lysosoom: avtivering van zure hydrolasen door lage pH (4 à 5)
Autofagocytose
Aanvoer van intracellulaire componenten: organellen, macromoleculen
Autofagie
-Cellulair proces waarbij oude of beschadigde organellen/macromoleculen worden opgeruimd -> belangrijk voor cellulaire overleving
-Vorming van autofagosoom -> vorming van membraanfragment dat organel/molecule omsluit, herkomst van membraan: ER
-Fusie van autofagosoom met lysosoom -> afbraak van organel/macromolecule door zure hydrolasen, transport van afbraakproducten naar cytosol
