H17 DNA replicatie Flashcards
Celcyclus
M-fase + interfase
Interfase
G1 + S + G2 fasen
Mogelijke mechanismen DNA replicatie
-Semiconservatief: iedere nieuwe streng krijgt een van de strengen van de moederstreng
-Conservatief: Een van de dochterstrengen is de moederstreng en de ander een ‘kloon’
-Verspreid
Densiteits-gradiënt-centrifugatie
Ieder organel heeft zijn eigen dichtheid, waardoor in een centrifuge de organellen in verschillende lagen gezien kunnen worden
DNA replicatie bij bacteria
-Replicatie in aanwezigheid van 3H-thymidine; detecterbaar via autoradiografie
-Theta-replicatie begint in AT-rijke regio (Origin of replication) en verloopt bidirectioneel via twee replicatievorken
-Replicatie gekoppeld aan splitsing
Replicatie bij eukaryoten
-Ca. 20.000 ORIs (in gist: ARS = Autonomously Replicating Sequence)
-Replicons (replicatie-eenheden): replicatie-bubbels en twee replicatievorken
Initiatie DNA replicatie bacteria
1.DNA-A bindt aan 9-meer sequenties van de ORI, hetgeen leidt tot ontwinding van 13-meer sequenties
2.SSB (single-strand binding protein) voorkomt re-hybridisatie
3.DnaB (DNA helicase) gerecruteerd via DnaC: laat bidirectionele replicatie toe
Vorming pre-replicatie complex
1.ORC (origin of recognition complex) bindt aan ORI
2.Helicase-laders binden aan ORC
3.Recrutering van MCM (minichromosome maintenance) complex (helicase)
Intitiatie van DNA replicatie eukaryoten
-Vorming van pre-replicatie complex
-Vorming pre-replicatie complex op de ORI tijdens de G1-fase van de celcyclus, gekend als replicatie-licentie
-In begin S-fase omvorming tot ‘replicatie complex’ door recrutering bijkomende eiwitten in het begin van de S-fase
Timing DNA replicatie
-Replicatie: 2000 (eukaryoten) - 50.000 (prokaryoten) basen/minuut
-Lengte S-fase = bepaald door aantal replicons + snelheid van activatie pre-replicatie complexen
-Niet alle pre-replicatiecomplexen gelijktijdig geactiveerd: euchromatine eerder gerepliceerd dan heterochromatine (5-bromo-deoxyuridine)
DNA synthese is gekoppeld aan …
de hydrolyse van fosfo-anhydride bindingen
DNA polymerase
Verlengt een DNA streng aan de 3’ OH uiteinde maar kan geen keten starten de novo, katalyseert de vorming van fosfo-diesterbinding
Klasse DNA polymerase
Transferasen enzymen (EC2)
Polymerasen in prokaryoten en eukaryoten
Twee in prokaryoten en vier in eukaryoten
Varianten DNA polymerasen
-Initiator eiwitten
-I
-III
-α
-γ
-δ
-ε
Richting DNA replicatiie
Begint op een OriC en gaat vervolgens beide kanten tegelijkertijd op, op meerdere punten in het DNA
Exonuclease
Verwijdert een foute nucleotide uit de streng
Foutenmarge DNA polymerase
1/100.000 en wordt 1/10.000.000 dankzij exonuclease
Proeflezing polymerase van streng
Als foutieve nucleotide wordt opgemerkt, dan draait de streng in de active site van exonuclease en na verwijdering weer terug in de palm
Primase in bacteria
Synthetiseert RNA primers met DNA las matrijs, dr RNA synthese is de novo, primase + helicase vormen primosoom in bacteria
DNA polymerase III in bacteria
Verlengt de RNA primer aan de 3’ uiteinde met DNA (DNA synthese 5’->3’)
DNA polymerase I in bacteria
-Verwijdert de RNA primers via 5’->3’ exonuclease activiteit
-Voert proofreading uit via 3’->5’ exonuclease activiteit
-Vult de gaten via 5’->3’ DNA synthese
DNA ligase in bacteria
Verbindt de 5’ en 3’ uiteinden, katalyseert de vorming van een fosfo-diesterbinding, verbruik van ATP
Replisoom in bacteria
-Alle eiwitten die een rol spelen in DNA replicatie, laat coördinatie toe tussen leidende en navolgende streng
-Klemproteïne nodig voor laden van DNA polymerase
DNA replicatie eukaryoten
-Gelijkaardig aan replicatie bij prokaryoten
-Klemproteïne (PCNA) bij eukaryoten recruteert DNA polymerase δ
-Verschilpunt tov: prokaryoot: verwijderen van RNA primers door endonuclease RNAse H (DNA-RNA duplex specifiek) en exonuclease FEN1
-Replicatie-fabrieken dicht bij kernmembraan
-Chromatine-remodelleer complexen: bv. laterale verschuiving histonen complexen (repositionering nucleosomen)
-Probleem van replicatie van chromosoom uiteinden
Telomerase
-Komt tot expressie in sneldelende cellen (dus niet elke cel)
-Is een RNP met het RNA de matrijs voor verlengingn telomeren, heeft dus reverse transcriptase activiteit
-Mutatie van complex geassocieerd met versnelde veroudering
Endogene factoren mutaties
-Replicatiefouten
-DNA polymerase activiteit, fouten na prooeflezing
-Tautomeren van ringbasen -> verkeerde basenparing tijdens replicatie
-Replicatie an een stukje DNA tweemaal (strand slippage) in repitief DNA
-Spontane chemische modificaties aan basen zoals depurineringen, deamineringen en oxidatie
Externe factoren mutaties
-Chemische mutagenen -> ringbase-analogen, ringbase-modificerende agentia, intercalerende agentia
-Fysische mutagenen: straling -> UV en röntgenstralen
Tautomeer
zeldzame resonantiestructuur van ringbasen (omkeerbare verplaatsing van H-atoom)
Effect tautomeer
Tautomeren leiden tot DNA mismatch -> geen Watson-Crick basenparing -> leidt tot mutatie tijdens replicatie
Stappen hairpin loop repeats
Voorwaarde: repeat van een bepaald triplet zoals CAG
1.Polymerase vormt de dochterstreng
2.Tijdens de synthese gaat de dochterstreng los en weer vast, wat leidt tot de vorming van een hairpin
3.Polymerase ‘glitcht’ en voegt extra repeats toe door de hairpin
Depurineringen
Verlies van een purine base -> spontane hydrolyse van een glycoside binding, 1000den keren/cel/dag, resulteert in base-vrij deoxyribose-fosfaat (=’AP’ site)
Effect polymerase bij ‘apurine’
Meestal een A toevoegen aan de dochterstreng
Deamineringen
Spontane hydrolyse van aminogroep, ca. 100/cel/dag (C->U->A)
‘AP’ site
apurine of apyrimidine
Reactieve zuurstofsoorten
-Ook wel ROS
-Leidt tot oxidatie van basen (guanine -> oxoguanine)
-Bv. waterstofperoxide of superoxide anion
Ringbase-analogen mutatie
Een ringbase die genoeg lijkt op eentje van het RNA of DNA om het te vervangen in de streng
Base-modificerende agentia mutatie
Bv. aflotoxine: leidt tot depurinering tgv verzwakking binding met deoxyribose, sommige agentia blokkeren DNA polymerase
Intercalerende agentia mutaties
Induceren deleties of invoegingen in DNA
UV-stralen mutaties
Leidt tot thymine-dimeren -> blokkeren replicatie-machinerie en kunnen leiden tot DNA breuken
Röntgen en radioactieve straling mutaties
Ioniserende stralingen die nogal schadelijk zijn voor het DNA
Initiator eiwitten
-Zowel eukaryoten als bacteria
-Binden aan OriC and initiëren het ontwinden van DNA dubbele helix
DNA polymerase I
-Bacteria
-DNA synthese 3’->5’; exonuclease (proofreading) 5’->3’; exonuclease verwijdert en vervangt RNA primers; functioneert ook in uitsnijding beschadigd DNA
DNA polymerase III
-Bacteria
-DNA synthese; 3’->5’ exonuclease (proofreading); gebruikt in synthese van beide DNA strengen
DNA polymerase α
-Eukaryoten
-Nucleair DNA synthese; vormt complex met primase en start DNA synthese bij 3’ eind RNA primers voor leidende en volgende streng (rol in DNA reparaties)
DNA polymerase γ
-Eukaryoten
-Mitochondriaal DNA synthese
DNA polymerase δ
-Eukaryoten
-Nucleair DNA synthese; 3’->5’ exonuclease (proofreading); heeft een in synthese van beiden strengen (DNA reparaties ook)
DNA polymerase ε
-Eukaryoten
-Nucleair DNA synthese; 3’->5’ exonuclease (proofreading); men denkt dat het een rol heeft bij synthese DNA strengen (ook DNA reparaties)
Fotolyase
-Prokaryoten en sommige eukaryoten; met energie van zichtbaar licht
-Gereduceerde FADH- geactiveerd door licht en functioneert als een elektron donor om de pyrimidine dimeer te breken
-Fotolyase aanwezig in sommige zonnecremes
‘Base excision repair’ (BER)
-DNA glycosylase verwijdert gemodificeerde base
-Endonuclease verwijdert de AP deoxyribose
-DNA polymerase plaatst een nieuwe nucleotide
-Ligase lijmt de bindingen aan elkaar
Waarom DNA thymine ipv uracil
Cytosine kan veranderen in uracil door deaminering, als uracil natuurlijk zou zijn, dan kon BER niet werken
‘Nucleotide excision repair’ (NER)
- UVR-AB herkent afwijking in helix structuur
2.UVR-C (endonuclease) katalyseert een 5 en 3’ knip
3.UVR-D (helicase) bindt aan de streng en helpt met ontbinding kapotte streng en DNA polymerase vult het gat - Ligase doet zijn ding
Kenmerken NER
-Herstel thymine dimeren
-NER ook gebruikt voor herstel van transcriptie-stop door gemodificeerde basen: ‘transcription-coupled repair’ -> legt uit waarom actieve genen sneller hersteld worden dan heterochromatine
‘Mismatch repair’
1.MutS herkent foutieve basenparing
2.MutH herkent gemethyleerde moederstreng en kerft de dochter streng
3.Nieuwe streng wordt verwijderd and vervangen tussen kerf en mismatch
Prokaryoten vs eukaryoten mismatch repair
Bij eukaryoten gaat het via de okazaki fragmenten ipv de gemethyleerde groep van de moederstreng
Gebruik translesie synthese
-Geen echt foutenherstel
-Bij ernstige, niet onmiddelijke herstelbare beschadiging van de matrijs streng
Translesie synthese
Slide 60 H17
Herstel dsDNA niet homologe ‘end-joining’ (NHEJ)
1.Herkenning breuk door Ku80 en Ku70
2.Inwerking exonucleasen
3.DNA-ligase werking
Kenmerken NHEJ
-Niet foutenvrij: verlies van nucleotiden
-Enkel tijdens G0/G1 fase wanneer chromosomen nog niet zijn gerepliceerd
-Treedt ook op bij verlies van telomeren en kan tot chromosoomfusie leiden
Herstel dsDNA ‘Synthesis dependent-strand-annealing (SDSA)
1.Dubbele breuk herkend, nuclease trimt uitendes 5’ einde
2.Streng invasie ontstaat naar homologe streng, D loop gevormd
3.DNA synthese vult missende regio’s, D loop migreert
4.Streng ontbindt van homologe streng
5.DNA synthese vult de rest in
Kenmerken SDSA
-Foutenvrij herstel
-Tijdens en na S-fase
Herstel dsDNA homologe recombinatie (HR)
1.Exonuclease trim van 5’ eindes
2.Streng invasie van beide strengen, homoloog naar origineel en andersom
3.DNA synthese vult missende regio’s
4.Vorming Holliday junctions (overlap van invasie)
5.Resolutie Holliday junctions, crossing over kan plaatsvinden
Kenmerken HR
-Tijdens en na S-fase
-Foutenvrij herstel
Crispr/Cas9
Vanaf slide 71 H17
HR tijdens meiose geïnitieerd door ds-breuken
1.Spo11 (endonuclease) knipt DNA en leidt tot rekrutering van enzymen die site trimmen
2.Rad51 en andere eiwitten vormen DNA/eiwit filamenten
3.DNA/eiwit filamenten zorgen voor streng invasie
4.Streng invasie maakt D loop bij eerste heteroduplex regio
5.Streng extensie verplaatst D loop, paart met complementaire ssDNA om tweede heteroduplex te vormen
6.Streng extensie en ligase
7.Dubbele Holliday junction vorm na kerf is verzegeld, chromosomen bevatten verschillende heteroduplexen
Insertie DNA in een nieuwe locatie
-Katalyse door transposase
-DNA repair door bacteriële enzymen: DNA polymerase + ligase
-‘target-site’ duplicatie
Stappenplan retrotransposons 1
1.Transcriptie door RNA polymerase II van gastheer
2.Translatie: synthese van een eiwit dat endonuclease en reverse transcriptase activiteit heeft
3.Binding op de nieuwe locatie in het genoom
Stappenplan retrotransposons 2
4.Endonuclease knipt in 1 van de DNA strengen
5.RNA hybridiseert met stukje enkelstrengig DNA, dient als primer voor synthese van eerste DNA streng door reverse transcriptase
6.Knipping van de tweede DNA streng op de plaats van integratie, synthese van de tweede DNA streng, integratie en DNA repair
Het effect van de transpositie hang af van
de plaats van insertie in het genoom, het celtype en het type transposon
Functie transposons
Bijdrage tot de evolutionaire variabiliteit:
-Insertie van retrotransposons in een gen kan leiden tot (in)activatie
-Retrotransposons bevorderen homologe recombinatie dat kan leiden tot exonshuffling of exonduplicatie
