H18 genexpressie transcriptie Flashcards
Polyribosoom
Bij prokaryoten kunnen ribosomen direct hechten aan het mRNA terwijl het gevormd wordt, en kan daarmee een lange rij vormen
Dd-DP
DNA afhankelijke DNA polymerase
Rd-RP
RNA afhankelijke RNA polymerase
(+) ssRNA
RNA dat klaar is om afgelezen en verwerkt te worden in tegenstelling tot (-)
Telomerase
-Ribonucleoproteïne
-Werkt als een reverse transcriptase bij verlenging van de telomeren (Rd-DP)
-Bij binding van een non-coding RNA werkt telomerase als een Rd-RP, functie gelinkt aan siRNA silencing
-Komt tot expressie in prolifererende cellen
Transcriptie 4 fasen
Binding, initiatie, elongatie, terminatie
Sigmafactor
Factor in RNA polymerase bij prokaryoten dat bindt aan de promotor, er zijn verschillende sigmafactoren
RNA polymerase katalyseert
de vorming van de fosfodiesterbinding bij synthese van mRNA/tRNA/rRNA
Promoter DNA prokaryoten
Vanaf start site naar -10 seq. (Pribnow box) en eindigt bij de -35 seq. met UP elements upstream en discriminator element downstream
TTS
Transcriptionele start site
Binding RNA pol aan promotor en initiatie RNA synthese
-Sigmafactor bindt -10 en -35 seq. en alpha subeenheid bindt UP
-Lokaal ontwinden van dsDNA door helicase activiteit van het RNA pol
-Vorming transcriptiebel
-RNA pol is stationair tijdens de initiatie
-Abortieve initiatie
-DNA scrunching
-Geen primer nodig, de novo synthese
Slide 25 H18
Elongatie RNA streng prokaryoten
-Promotor escape, RNA pol laat sigmafactor los
-RNA pol beweegt van 3’->5’ over de matrijs streng
-Synthetiseert RNA van 5’->3’ complementair aan de matrijs streng
-Vier kanalen/groeven
Slide 26 H18
RNA proeflezing prokaryoten
-NMPn + NTP <-> NMPn+1 + PPi
-RNA backtracking = RNA pol gaat 1 nt terug, gevolgd door hydrolytische afsplitsing van het 3’ eindstandig dinucleotide, het fout geïncorpeerde nucleotide neemt deel aan de katalyse
Terminatie RNA synthese prokaryoten
Terminale signalen met 2 klassen
-Rho factor onafhankelijk: GC-rijk (haarspeld lus) + UUUU
-Rho factor afhankelijk: rho = ATP-afhankelijke helicase, bindt op een specifieke sequentie dicht tegen 3’ uiteinde en RNA: DNA hybride ontwinden
RNA pol I
-Nucleolus
-Precursor voor 28S rRNA, 18S rRNA en 5,8S rRNA
-α-Amanitine resistent
RNA pol II
-Nucleoplasma
-Pre-mRNA, meesst snRNA en microRNA
-Zeer gevoelig voor α-Amanitine
RNA pol III
-Nucleoplasma
-Pre-tRNA, 5S rRNA en andere kleine RNA’s
-Redelijk gevoelig voor α-Amanitine
Mitochondriaal RNA pol
-Mitochondrion
-Mitochondriaal RNA
-α-Amanitine resistent
Chloroplast RNA pol
-Chloroplast
-Chloroplast RNA
-α-Amanitine resistent
α-Amanitine
Cyclische peptide dat RNA pol II inhibeert
Promotor RNA pol I
Kernpromotor met controle element stroomopwaarts
promotor RNA pol II
-TATA-promoters: Inr + TATA met of zonder TFIIB recognition element (BRE)
-DPE-promoterds: Inr + downstream promotor element (DPE), geen TATA en geen BRE
Promotor RNA pol III
-Tee verschullende promotors met dezelfde opbouw in tRNA en 5S rRNA
-Derde soort promotor upstream voor small RNA’s
Preinitiatie complex
Gevormd door RNA pol samen met algemene transcriptiefactoren
Transcriptiefactoren
Factoren die nodig zijn om transcriptie te starten
TFIID
Transcriptiefactor pol II en D is de naam van het eiwitcomplex
Stappenplan preinitatie complex deel 1
-TFIID bindt aan TATA-box
-TFIIA en TFIIB vormen complex met TFIID
-Complex bindt aan RNA pol II met TFIIF
-Preinitiatie complex wordt afgemaakt door toevoeging van TFIIE en TFIIH
Stappenplan preinitiatie complex deel 2
-TFIIH heeft ATP-afhankelijke helicase + proteïne kinase activiteit
-dsDNA gaat uiteen, fosforylering van Ser 5 van CTD, RNA pol start RNA synthese
-Abortieve initiatie met DNA scrunching
-Fosforylering van Ser 2 van CTD: RNA pol II komt los van de promotor, begin van de elongatie fase
Handig RNA pol feitje
Het beweegt zelf niet, het DNA beweegt door het heen via DNA scrunching
TATA binding protein (TBP)
-Andere proteïnen nodig voor optimale transcriptie bij eukaryoten
-Ligt aan de rest van factoren waaraan TBP bindt
-Creëert een hoek in de DNA streng (het ‘zadelt’)
RNA elongatie complex eukaryoten
-Gelijkaardig als bij prokaryoten
-Chromatine re-modelleer eiwitten bij prokaryoten
-RNA proeflezing idem als bij de prokaryoten
Terminatie eukaryoten
Terminatie signalen voor elk RNA pol verschillend
-RNA pol I: herkent een 18 nt terminatie signaal in het RNA
-RNA pol II: RNA splitsing op 10 tot 35 nt stroomafwaarts van het polyadenylatie signaal (AAUAAA seq)
-RNA pol III: reeks Us
Electrophoretic mobility shift assay (EMSA)
-dsDNA fragment (probe) radioactief gemerkt
-Twee condities vergelijken: met en zonder proteïne
-Gelectroforese in niet-gedenatureerde condities
DNA footprinting
-Mix gelabelde DNA met DNA bindende eiwitten, zonder rechts en met links
-Incubeer beiden kort met DNase I
-Visualiseer DNA fragmenten met elektroforese en er zal een ‘footprint’ ontstaan om te zien waar het proteïne bindt
Chromatine immunoprecipitaite (ChIP)
-Cross-link eiwitten en DNA, lyseer cellen knip DNA tot fragmenten
-Antilichaam bindt aan een van de eiwitten
-Verwijder de eiwitten
-Versterk met PCR en analyseer
Soniceren
Aan de hand van ultrasone geluidsgolven chromatine in stukjes veranderen/gefragmenteerd
ChIP-Chip
In kleine gaatjes zijn DNA-sequenties gespoten met een fluorescent label, bv genomisch DNA groen betekent dat je sequentie niet aanwezig is
mRNA
Bevat informatie voor de productie van het eiwit
Slide 49 H18 volledig
zla het proberen
rRNA synthese
-rRNA: 70-80% van het total cellulaire RNA
-Bacteriën: 3 verschillende rRNAs
-Eukaryoten: 4 verschillende rRNAs
-pre-rRNA processing bij prokaryoten en eukaryoten
-S: Svedberg, sedimentatie coëfficiënt (gewicht, dichtheid en vorm)
Eukaryotische rRNA synthese
-Gelijktijdige synthese van meerdere transcripten: borstelvormige structuur
-pre-rRNP = pre-ribosomaal ribonucleoprotein complex
-Verschilllende kopieën van rRNA genen liggen in tandem
-Aantal kopieën van rRNA genen: verschillend tussen species
-Niet afgeschreven spacers tussen de transcriptie eenheden
Nucleolus organisator regio’s (NOR)
-Een DNA regio dat rRNA genen bevat die in tandem liggen en gelegen in de nucleolus
-Meerdere NORs kunnen op verschillende chromosomen liggen
-Meerdere NORs in 1 nucleolus
-Grootte nucleolus in correlatie met activiteit: hoge snelheid van proteïne synthese -> veel ribosomen nodig -> tot 25% van totaal nucleair volume
-Nucleolus verdwijnt tijdens mitose
Regeling pre-rRNA processing
-snoRNAs: ‘small nucleolar RNAs’ zijn korte non-coding RNAs (60-300) nt hoofdzakelijk gelokaliseerd in nucleolus
-snoRNAs binden aan complementaire regio’s in pre-rRNA en coördineren de pre-rRNA processing: bv dirigeren/bepalen de plaatsen van methylering en knipping
-Methylering van de 2’OH groep ribose
snoRNPs
Wordt gevormd door snoRNAs, bevatten methyltransferase
Pre-tRNA processing
- Verwijdering van leider sequentie aan 5’
- Vervanging van nucleotiden op 3’
- Chemische modificatie van de basen
- Excisie van intron, een bepaalde loop in het molecuul (splicing)
Chemische modificaties tRNA
-Methylering van basen bv methylcytosine
-Methylering van ribose
-Deaminering van adenine (A) geeft inosine (I) (voorbeeld van RNA editing)
Pre-mRNA processing prokaryoten
-Geen processing van de meeste bacteriële mRNAs
-Polycistronische mRNAs (mRNA dat codeert voor meerdere eiwitten)
-Geen celkern
-Co-transcriptionele translatie
Pre-mRNA processing eukaryoten
-Co- en posttranscriptioneel proces
-5’ capping
-Pre-mRNA splicing
-3’ polyadenylering
-RNA editing
5’ capping
-Nadat de initiatie is gestart
-7-methylguanosine
-Soms methylering van de ribose van 1ste en 2de nt
-5’-5’ binding ipv 3’-5’
-Stabiliteit: bescherming tegen exonucleasen
-Belangrijk voor binding van het ribosoom
3’ polyadenylering
-Polyadenylatie plaats tussen AAUAAA sequentie en G/U sequentie (= GU-rijke en/of U-rijke sequentie).
-Knipping 10-35 nt stroomafwaarts van AAUAAA seq
-Toevoeging poly(A) staart door Poly(A)polymerase (zonder template)
-3’ processing leidt ook tot terminatie van transcriptie
-Uitzonderingen transcripten zonder poly A staart
Functie 3’ polyadenylering
-Bescherming tegen exonucleasen
-Betrokken bij export van mRNA uit de kern naar cytoplasma
-Betrokken bij initiatie van translatie
Heteroduplex
-RNA:DNA hybride
-Het DNA is altijd de matrijsstreng
-Introns zijn daarbij de gevormde lussen
Spliceosomen
-Verwijderen introns en voegen exonen samen
-Groot complex bestaande uit RNA en eiwitten = RNP (ribonucleoproteïne complex)
-5 snRNAs (U1-6 zonder 3) + >200 eiwitten
-Splicing: co- en post-transcriptioneel proces
Assemblage spliceosomen
-Consensus sequenties: 5’ en 3’ splicing plaatsen
-Branch point
-Opeenvolgende binding van snRNPs op het pre-mRNA
-U1 snRNP: U1 snRNA complementair aan 5’ splice site
-U2 snRNP bindt aan branch point
-U4/U6 en U5 binden op U1 en U2 snRNPs
Werking spliceosomen
-Knipping aan de 5’ splicing plaats
-5’ uiteinde van het intron bindt covalent aan 2’ OH van A van het branch point sequentie = lariat
-Knipping aan de 3’ splicing plaats
-Samenvoegen van de twee uiteinden van het exon
Exon-junction complex (EJC)
-Multiproteïne complex bindt op elk nieuw gevormde exon-exon verbinding
-Heeft een rol bij: non-sense gemdieerde mRNA afbraak (NMD), mRNA export -> EJC bindt nucleaire export factor 1 (NXF1) -> export door kernporie, mRNA lokalisatie, mRNA translatie
Puntmutatie lamine A gen (progeria)
Toevoeging van een nieuwe 5’ splice site op het gen waardoor 150 nt wordt verwijderd, doordat het lichaam denkt dat het een intron is
Self-splicing RNA intronen
Voeren splicing uit zonder hulp van eiwitten, het intron katalyseert het splicing prces, katalytische RNAs = ribozymes
Regulatorische eiwitten en snoRNAs
Binden op splicing enhancer of splicing silencer sequenties in pre-mRNAs en regelen op deze manier pre-mRNA splicing
Exon-shuffling
Genetische recombinatie tussen de intronen van twee verschillende genen leidt tot genen met nieuwe combinatie
Exon-duplicatie
Genetische recombinatie tussen de intronen van twee homologe genen leidt tot een exon duplicatie
Cajal bodies
Rol in processing (maturatie) van snoRNAs en de snRNAs
Nucleaire speckles
-Ook interchromatin granule clusters genoemd
-Rijk aan RNAs, pre-mRNA splicing factors/snRNPs en niet-snRNPs splicing factors, stockage plaats, dynamisch, heeft een rol in pre-mRNA splicing
RNA editing
-Co- en posttranscriptionele veranderingen binnenin de sequentie van het (pre-)mRNA of tRNA of microRNA: inserties en deleties van 1 nt of >100, chemische modificaties
-Veranderingen niet aanwezig in het DNA
-Veranderingen kan ORF veranderen/kan start of stop codon genereren
Bekijk slides 80-82, worden op examen gevraagd
Yes sir!
DNA editing
Verandering van enkelstrengig DNA
Deoxycytidine deaminase APOBEC3G
-Deamineert cytosine naar uracil in enkelstrengig DNA
-Antivirale factor
-APOBEC3G activiteit leidt tot G->A hypermutaties in DNA waardoor retrovirus geïnactiveerd wordt
mRNA metabolisme
-Halfwaardetijd van een bepaald mRNA: tijd die nodig is om 50% van dat mRNA: <30min - 10 uur
-Pulse-chase experimenten
-mRNA hoge turnover versus rRNA/tRNA meer stabiel
-Levensduur van mRNA wordt o.a. bepaald door de lengte van de poly (A) staart en het aantal AU-rijke elementen in 3’ UTR
Amplificatie
-DNA-mRNA-eiwit: sterke amplificatie (meestal 2 genen voldoende) -> bv. fibroïne eiwit
-DNA-rRNA/tRNA: minder amplificatie: meerdere kopieën
