F5: Strukturbestemmelse og analyse Flashcards
Hvad afgør, hvor meget information, man kan få fra en røntgenstruktur?
Krystallens kvalitet
Forklar, hvordan man laver et “røntgenbillede” af et protein og hvad der skaber diffraktionsmønstret
Prøven placeres foran en strålekilde, og diffraktionsmønstret optages af en detektor.
Hvert atom bidrager til hver prik i diffraktionsmønstret, der repræsenterer elektrontætheden
Hvad er et electron density map og hvordan laves det?
Et kort over elektrontætheden af prøven analyseret i røntgenspektroskopi, der er lavet ud fra diffraktionsmønstret ved Fouriertransformation.
Hvad siger x-ray ikke noget om?
Miljøet inde i cellen
Hvorfor skal x-raystrukturer sammenlignes med strukturer bestemt på andre måder?
For at undersøge, om strukturen fremkommet ved x-ray er påvirket af fx protein-protein-kontakt i krystallen
Hvad kan NMR sige noget om?
Proteiners dynamik, konformationelle ændringer, foldning og interaktion med andre molekyler
NMR laver på proteiner, der er i en…
opløsning
Hvordan fungerer NMR?
Atomkerner kan have kernespin, og et kraftigt magnetfelt medfører en opsplitning i to energitilstande. Forskellen mellem dem svarer til energien i en radiobølge.
Kernerne skifter til en højenergitilstand ved at absorbere noget energi, og ved at se på emissionspektret når de falder tilbage i grundtilstanden, kan man udlede oplysninger om kernerne og deres kemiske miljø.
NMR-analyse af proteiner muliggøres af…?
Og hvorfor?
2D-NMR, fordi man med forskellige 2D-teknikker kan måle på afstandsafhængige koblinger af spin i atomer, der ligger rumligt tæt på hinanden (NOESY) eller kobling af kernespin mellem atomer kovalent bundet sammen (TOCSY).
Hvad fortæller et NOE-signal om?
Afstandsbegrænsninger mellem enkelte atomer.
Det opstår, når to atomers spin påvirker hinanden gennem rummet via dipol-dipol-vekselvirkninger (1/(r^6)), max. 5 Å.
Signalet i NOESY kan analyseres ud fra punkter og intensitet for at regne ud, hvor tæt atomer er på hinanden.
Hvordan kan man supplere et H1-NOE-signaler, så man kan få mere viden om proteinets struktur?
Man kan lave NMR med C-13 eller N-15 og analysere proteinets primærstruktur.
Hvilke oplysninger skal en computer bruge for at kunne generere en 3D-struktur?
Afstandsbegrænsninger, chiralitet, van der Waals-radier for atomerne, længder for bånd og deres vinkler.
Hvilken bølgelængde har synligt lys?
400-700 nm
Høj energi er givet ved _____ frekvens og ______ bølgelængde
Høj frekvens og kort bølgelængde
Hvordan udregnes fotonens energi?
E=hv, hvor E er energien, h er Plancks konstant og v er frekvensen (udregnes ved c/bølgelængden)
Hvad sker der når en foton absorberes?
En elektron i det absorberende molekyle, dvs. kromoforen, bliver exiteret - løftet til et højere energiniveau. Elektronen henfalder oftest hurtigt til grundtilstanden.
Hvad kræves for at der kan ske exitation?
Fotonens energi skal passe til energiforskellene mellem orbitalerne.
Hvad fortæller et kemisk skift noget om?
Hvor godt en kerne er afskærmet af elektroner som påvirker energiabsorptionen
Hvad betyder tilordning inden for NMR?
At løse puslespillet om hvilket signal, der svarer til hvilket atom ved at bruge mange forskellige spektre.
Hvor stammer signalerne i NOE-spektre fra? Og hvad fortæller de noget om?
Dipol-dipol-vekselvirkninger, der aftager med 1/(r^6), så de er meget kortrækkende. Derfor kan de fortælle om, hvad der sidder i umiddelbar nærhed af hinanden, max 5-6Å.
Hvor meget må en NOE afvige?
0,3 Å eller 0,5 Å (max)
Skal rmsd for en NMR-struktur være høj eller lav?
Lav, fx 0,5Å for C-N-C(alfa) i backbone
Ser man på accuracy eller precision, når man ser på rmsd?
Precision
Ser man på accuracy eller precision, når man ser på et ramachandranplot for sin NMR-struktur?
Accuracy
På hvilke måder kan en elektron vende tilbage til grundtilstanden?
Ved fx at udsende energi i form af varme, udsende fluorescens eller ved at give energien videre til et andet molekyle uden at der udsendes nogen stråling (quenching)
Hvad er quantum yield?
Fluorescensintensitet - antal fotoner ud i forhold til de indkomne
Hvad er quenching?
Videregivelse af energi fra en exiteret kromofor uden udsendelse af stråling
Hvad er afstandsbegrænsningen for quenching?
20-70 Å
Hvad går FRET ud på?
Analyse af afstande mellem atomer baseret på, hvilke atomer, der exiteres og hvilke der udsender fluorescens. Hvis det er to forskellige atomer, må de være tæt på hinanden, så der kan ske resonance energy transfer.
Går alt exitationsenergien oftest til fluorescens?
Nej, en del forsvinder i form af varme.
Hvad er en kromofor?
(En gruppe i) et molekyle, der interagerer med indkommende stråling
Hvad afgør aromatiske sidekæders absorption?
bl.a. pH og solventets polaritet
I de proteiner, der ser farvede ud, skyldes farven oftest…
Ligander, fx hæm i hæmoglobin
Intensiteten af fluorescens afhænger af…
Hvor meget energi der exiteres på andre måder
Hvordan er FRET afstandsafhængig?
Afhænger af afstanden mellem donor og acceptor og afstanden, hvor 50% af energien overføres (Förster-afstanden, fx ml. 23-61 Å)
Rotation af planpolariseret lys i mødet med et asymmetrisk molekyle bruges i…
CD-spektroskopi
CD-spektroskopi bruges til… (nævn to)
at vurdere, hvor meget alfa-helix og beta-sheet der er i at protein og monitorere foldnings- eller udfoldningsprocesser
Hvad kan vi måle på i x-ray-krystallografi?
Intensitet af bølgerne
Hvad kan vi ikke måle på i x-ray-krystallografi?
Fasen: Vi kender absolutværdien for hvert peak men vi kender ikke fortegnet
Hvordan kan faseproblemet løses?
Fx ved påsætning af et tungt atom, ved udregning af lignende kendte proteiners diffraktionsmønster med intensitet og faser og ved undersøgelse af krystallen ved forskellige bølgelængder
Hvad siger resolutionen noget om inden for x-ray?
Hvor meget data, der har været indsamlet. Jo mere data i forhold til, hvad man vil konkludere på baggrund af det, jo bedre resolution.
Hvilken enhed måles resolution (x-ray) i, og bør værdien være høj eller lav?
Måles i Å, og værdien skal være lav, for at opløsningen er god,
Hvad er R-værdien? Skal den være høj eller lav?
Et mål for hvor godt koordinaterne i resultatstrukturerne repræsenterer det eksperimentelle data. Skal være lav, fx under 20%.
Hvad er den frie R-værdi?
En faktor, der afspejler overensstemmelsen mellem modellen, man har fundet og noget data, som der ikke har været fittet efter.
Får man et struktur ud af NMR-spektroskopi?
Nej, man får ofte 15-20 forskellige
Hvad er det hastighedsbegrænsende trin i x-ray-spektroskopi?
Fremstilling af krystaller, især for hydrofobe områder
Kan alle proteiner undersøges med NMR?
Nej, de må ikke være for store
Hvad kan man gøre, hvis man vil undersøge et protein, der er for stort til NMR og ikke kan danne gode krystaller?
CryoEM
De to former for cryoEM går ud på…
1: At tage naturligt forekommende krystaller og lave EM på dem
2: At lave EM fra mange vinkler på ikke-krystaller
Hvad kan man bruge absorptionsspektroskopi til?
Til at måle koncentrationer i en opløsning
Man kan beregne den molare ekstinktionskoefficient ud fra, hvor høj forekomst der er af forskellige grupper, der absorberer. Hvilke grupper?
Primært Trp, Tyr og svovlbroer
Hvad kan man bruge peptidbindings absorption til? Og hvad kan man ikke bruge den til?
Man kan vurdere, hvorvidt der findes proteiner i en prøve. Man kan ikke sige meget om strukturen, da det er svært at estimere den molare ekstinktionskoefficient og da der er mange andre grupper, der absorberer i same område som peptidbindingen.
Hvad kaldes et stof, der udsender en foton? Og hvad kaldes det udsendte lys?
Hhv. fluorofor og fluoroscens
Hvorfor sker emission ved højere bølgelængde end absorption?
Der er vibrationsniveauer i grundtilstanden og i den exiterede tilstand.
Hvad afhænger fluorophorers spektra af? Hvorfor? Hvad betyder det for spektret?
De afhænger af det omgivende miljøs polaritet, fordi der dannes en dipol i den exiterede tilstand, og den interagerer mere med et polært solvent end et apolært. Ved meget interaktion mistes mere energi, så spektret bliver rødforskudt.
Hvad kan fluorescens bruges til ifm. ligandinteraktioner?
Kinetik og ligevægtskonstanter for binding
Hvilke årsager kan der være til at man ikke ser en ændring i spektret under fx foldning eller udfoldning?
Måske er der ingen svovlbroer eller fluorescerende aminosyrer - måske sker der bare ingen ændring i deres kemisk miljø i processen. Man kan i stedet mærke med ANS.
Hvad er ANS? Hvordan fungerer stoffet?
Et hydrofobisk molekyle, der kan binde til hydrofobe patches/lommer og skærme for det polære solvent, så der sker et blåskifte i fluorescensspektret. Quantum yield stiger også.
Hvordan sker energioverførslen i FRET?
IKKE VED UDSENDELSE AF FOTONER! I stedet ved dipol-dipol-interaktioner
Kan FRET bruges til at undersøge ligandbinding?
Ja, hvis man har valgt donor og acceptor så de fx sidder på forskellige domæner
Hvor godt er et CD-spektrum til at sige noget om proteinets indhold af betasheets?
Medium: betaturns kan give lignende spektre, og spektret kan variere alt efter betastrengenes konformation
Hvad bruges nær-UV-CD til?
Til at bestemme, hvornår de aromatiske aminosyrer pakkes væk under foldning, dvs. hvornår den hydrofobe kerne dannes
Kan man altid bruge Lambert-Beers lov til at finde koncentrationen ud fra absorption?
Nej, når konc. bliver for høj, kan nogle molekyler skygge for andre
Hvad kan fluorescens bruges til, ud over at se på ligandbindinger?
Intracellulær lokalisation, strukturelle ændringer og interaktioner mellem proteiner
Native og udfoldede proteiner har ofte emission ved hhv. ____nm og ____nm
335 og 356 nm
Viser x-ray hydrogenatomer?
Oftest ikke, da de er for små og lette i forhold til de andre atomer
Hvad er en b-faktor?
En faktor, der fortæller, om ordnet strukturen er ud fra hvor meget de forskellige dele vibrerer- Lav b-faktor betyder meget ordnet struktur.
Nævn nogle problemer ved hhv. x-ray og NMR
x-ray: Svært at producere (god) nok krystal, løse faseproblemet, ser ikke hydrogenatomer, det kan være svært at spore backbone
NMR: Svært at producere nok isotopmærket protein, prøven må ikke være for stor, langsom tilordningsproces
Kan NMR bruges til ligandbindingsundersøgelse, når strukturen af proteinet ikke er kendt?
Ja, man kan stadig se på, om der forekommer ændringer
Hvad er NMR-resolution normalt på?
2-2,5 Å
Hvad er accuracy?
Beskriver, hvor korrekt resultaterne er
Hvad er precision?
Beskriver, hvor ens resultaterne er (og om de kan reproduceres). Man kan måle på varians.
Hvad betyder kemisk skift?
Angiver elektronegativiteten omkring en kerne. Jo mere elektronegativt miljø, jo højere kemisk skift. Angives i ppm i fht. et referencemolekyle. Karakteristisk for hvert atom i et bestemt kemisk miljø - ikke kun bindinger men også interaktioner. Methylgrupper er ikke elektronegative, så de kan fx have negativ ppm-værdi.
