F2: Sekundærstruktur, proteinoprensning og -karakterisering Flashcards
Hvad er et nativt protein?
Et protein i en foldet, fungerende konformation
Hvad er stabilitet?
Tendensen til at opretholde den native konformation
Hvad kan opretholde den udfoldede form?
H-bindinger med vand og meget entropi
Hvorfor har mange celler et reducerende miljø? Hvilken konsekvens har det for proteiner?
Pga. reduktanter som glutathione. Det gør det vanskeligt at danne svovlbroer i dette miljø.
Hvor langt rækker van der Waals-kræfter?
0,3-0,6 nm
Forklar peptidbindingens elektriske dipol
O har partiel negativ ladning, N partel positiv ladning.
Hvad er phi- og phi-vinkler for et peptid, hvor alle peptidgrupper ligger i samme plan?
+-180 grader
Hvilken konformation har den dihedrale omegavinkel oftest?
+/- 180 grader
Hvad er random coil?
Når der ikke er en veldefineret sekundærstruktur.
Hvad er 1Å?
0,1nm
Hvor er R-grupperne placeret i en alfahelix?
De stikker ud fra helix’ backbone
Hvor langt er en omgang i en alfahelix (i antal residues og i Å)?
3,6 residues og 5,4 Å
Er en normal alfahelix højre- eller venstrehåndet?
Højrehåndet
Hvad er phi- og psi-vinkler i en højrehåndet alfahelix?
Phi: -57 grader Psi: -47 grader
Hvorfor er alfahelix så stabil?
- Det optimale hydrogenbindingsmønster
- Capping
- van der Waals-interaktioner
- Mulighed for at hydrofobe sidekæder kan “samles” på den ene side af helix og vende væk fra solvent
- Utilfredsstillede H-bindingsdonorer/acceptorer kan H-binde med vand
- Relativt lille tab af entropi
Hvilke muligheder er der for at undgå, at de 4 aa-rester i alfahelix-ender ikke har hydrogenbindingspartnere?
De kan hydrogenbinde ved solvent eller blive cappet af andre dele af proteinet
Hvad er phi- og psi-vinkler i parallelt betafoldeblad?
Phi: -119 grader Psi: +113 grader
Hvad er phi- og psi-vinkler i antiparallelt betafoldeblad?
Phi: -139 grader Psi: +135 grader
Hvilken aminosyre er bedst til at danne alfahelix?
Ala
Danner segmenter med mange enten positivt eller negativt ladede aminosyrer alfahelix?
Nej, ladningerne vil frastøde hinanden
Hvad gør høj forekomst af Asn, Ser, Cys og Thr for alfahelix’ stabilitet?
Destabiliserer pga. deres form og volumen
Hvor langt er der ofte fra en positivt til en negativt ladet aa-rest i alfahelix?
3 aminosyrer, så de kan danne saltbro
Hvilke aminosyrer fidnes ofte i hhv. N-term. og C-term.?
N-term.: Negativt ladede C-term.: Positivt ladede
Hvilken type betasheet er mest stabil?
Antiparallel
Hvor er betasheets hydrogenbindinger?
Mellem strenge, der ligger ved siden af hinanden (men ikke nødvendigvis er tæt på hinanden i aminosyreskevensen, evt. i anden aa-kæde)
Hvor er R-grupperne placeret i betasheets?
Skiftevis pegende op og ned i forhold til foldebladet
Hvor lang er 1 periode (2 rester) i parallelt foldeblad?
6,5 Å
Hvor lang er 1 periode i antiparallelt foldeblad?
7 Å
Hvor findes betaturns og hvor mange aa-rester består de af?
Mellem antiparallelle betastrenge, består af 4 aa-rester
Hvordan er hydrogenbindingsmønstret i betaturns?
Den første aa-rests carbonylgruppe danner H-binding med aminogruppen i den fjerde rest
Hvor i proteinet findes betaturns ofte?
Nær overfladen, da aa-rest 2+3 kan H-binde med vand
Hvilke aa-rester findes ofte i betaturns og hvorfor?
Pro: Kan tage cis-konfiguration og give en favorabel drejning
Gly: Lille og fleksibel
Tegn et Ramachandran-plot og marker, hvor alfahelix (højrehåndet) og betasheets (parallelle+antiparallelle) befinder sig
Se s. 124 i Lehninger
Hvad undersøger man med circulær dichroisme-spektroskopi?
Forskellen i absorption mellem venstrehåndet og højrehåndet cirkulært polariseret lys.
Hvilket CD-spektrum har alfahelix?
Positivt bånd ved 192 nm
Negativt bånd ved 208 nm
Negativt bånd ved 222 nm
Hvilket CD-spektrum har beta-konformation?
Positivt bånd ved 195 nm
Negativt bånd ved 216 nm
Hvilket CD-spektrum har random coil?
Negativt bånd ved 197 nm
Positivt bånd ved 216 nm
Hvad absorberer UV-lyset i regionen 190nm - 250nm, som CD-spektroskopi forgår i?
Peptidbindingen
Hvad er tertiær struktur?
Det overordnede tredimensionelle arrangement af alle peptidkædens atomer.
Hvordan fastholdes tertiær struktur?
Svage interaktioner og svovlbroer
Hvad er kvaternær struktur?
Arrangementet af subunits
Hvad er hyppige funktioner af fibrøse proteiner?
Fx ydre beskyttelse og støtte
Hvad er hyppige funktioner af globulære proteiner?
Katalyse og regulation
Hvorfor er fibrøse proteiner uopløselige i vand?
Hydrofobe aminosyrer på overfladen.
Hvad er coiled coil?
To alfahelixes snoet sammen til en ventrehåndet helix
Hvilke aa-rester forekomme oftest i alfa-keratin - og hvorfor?
Ala, Val, Ile, Leu, Met og Phe - de er upolære og kan lave hydrofobe interaktioner og pakkes tæt
Hvordan sikres stabiliteten i alfakeratin
Via svovlbroer
Hvordan er collagen opbygget?
Tre venstrehåndssnoede alfakæder er snoet om hinanden til en højrehåndssnoet superhelix. Collagen er opbygget af Gly, Ala, Pro og 4-Hydroxyprolin. Disse er små nok og enten fleksible eller fastlåste nok til at give de rigtige knæk. Der kan være crosslinks med atypiske bindinger
Hvilke aa-rester findes i silkefibers betasheets og hvorfor?
Især Ala og Gly, da de er små nok til at betasheets kan blive pakket meget tæt
Hvad afgør et proteins opløselighed?
En blanding af temperatur, saltkoncentration og pH m.m.
Øget saltkoncentration får opløseligheden til at…?
Falde
Hvad bruges dialyse til under oprensning af proteiner?
Fx til at fjerne salte, der har været brugt til at udfælde proteiner
Hvad er bundet til cationbytteres stationære fase?
Anioniske grupper (negativt ladede)
Hvad er bundet til anionbytteres stationære fase?
Cationiske grupper
Hvad afgør et proteins affinitet for grupperne i den stationære fase i ionbytterchromatografi?
pH og koncentrationen af konkurrerence frie salte
Et negativt ladet protein vil bevæge sig hurtigt igennem en matrix med ____ ladede grupper.
Negativt
Hvor lang skal en søjle være?
Lang nok til at skille båndene ad, men ikke lang nok til at hvert bånd bliver for spredt.
Kommer det største eller mindste protein først ud af søjlen i gelfiltrering/size-exclusion chormatography?Hvorfor?
Det størst kommer først ud, da de små proteiner tager en labyrint-agtig vej gennem polymerkugler i søjlen.
Hvad er princippet i affinitetschromatografi?
Søjlematerialet har ligander bundet, så proteiner, der kan interagere med liganden forsinkes gennem gelen. De vaskes bagefter ud med fx en saltopløsning
Hvad afgør, hvor hurtigt, et protein vandrer ved elektroforese?
Form og ladning-til-masse-forhold
Mobiliteten µ i gelelektroforese er givet ved…?
V/E (hastighed over elektrisk potential) eller Z/f (f=friktionskoefficient og nettoladningen =Z)
Hvad giver proteinet dets ladning til gelelektroforese?
SDS giver negativ ladning, der tilnærmelsesvis er proportional med massen
Hvilken størrelse proteiner vandrer hurtigst i SDS-gel?
Små proteiner
Adskilles subunits af SDS?
Ja
Hvad betyder et tag i affinitetskromatografi?
Hvad bruges det til?
Et protein, der sættes på det analyserede protein via genteknologi. Hvis man analyserer et protein, der ikke binder nogen kendt ligand, kan man i stedet bruge et tag, der binder en bestemt ligand, der så påsættes søjlen. Tagget kan senere fjernes med en protease - der kan dog sidde lidt tilbage, der kan påvirke analysen.
Hvad er enheden på x-aksen i massespektroskopi?
m/z
Hvad er fordelene ved massespektroskopi?
Kræver lille prøvemængde
Giver præcist resultat for massen
Det går hurtigt
Muliggør undersøgelse af ligandbinding, når massen er kendt
Hvordan gøres en prøve klar til massespektroskopi?
Der påsættes protoner
Hvad bruges tandem MS til?
Hvordan sker det?
Bruges til sekvensering af korte polypeptider
Det foregår ved at peptider kløves og får påsat en ladning, enten +1 eller +2. I et kollisionskammer spaltes en peptidtype fra kammer 1 forskellige steder (oftest ved peptidbindingen). Disse fragmenter analyseres i kammer 2, og ved at se på masseforskellen mellem peaks i spektret kan man identificere aminosyresekvensen.
Hvad er problemet med Ile og Leu i MS?
De har samme masse og kan derfor ikke bestemmes
Hvor findes alfahelix ofte i proteinet?
På ydersiden med en hydrofil og en hydrofob del (N-cap og C-cap sidder begge i hydrofob del.
Hvordan stabiliseres yderstrenge i betafoldeblade?
Hydrogenbinding til solvent og polære sidekæder
Hvad er et mixed betasheet?
Når to yderstrenge fra forskellige subunits’ betasheet binder i interface
Hvad er supersekundærstruktur?
= motiv, karakteristisk foldningsmønster af flere sekundærstrukturer og deres forbindelser. Genkendeligt arrangement.
Nævn eksempler på supersekundærstruktur
Fx helix-loop-helix, greek key, beta hairpin.
Små motiver kan være en del af større motiver
Hvad skal man overveje, inden man påbegynder oprensning af protein?
Formål (fx renhed eller strukturbestemmelse), kilde (naturligt eller rekombinant), tilgængelige metoder (herunder pris i forhold til udbytte)
Nævn en metode, der er stor kapacitet, men lille resolution og en der har lille kapacitet, men stor resolution
1: Behandling med salt, fx ammoniumsulfat, for at udfælde protein
2: Fx kromatografi eller gelelektroforese
Hvilke egenskaber kan man lave karakterisering og oprensning på baggrund af?
pI, masse, ladning og ladningsfordeling, størrelse og form, opløselighed, hydrofobicitet og ligandbinding
Hvad kan det anvendes til, at alfa-helix, betasheet og random coil har forskellige spektre i CD spektroskopi?
Det kan give et estimat af fraktionen af de to sekundærstrukturer i et protein, dvs. om der er høj/lav forekomst af alfa-helix og beta-sheets.
Man kan desuden undersøge udfoldning af proteinet eller konformationelle ændringer ved at sammenligne spektre af proteinet under forskellige forhold.
