F12: Proteinlokalisering og modifikation

Question 1

Hvor findes signalsekvenser?

Answer 1

I N-terminus

Question 2

Hvad er karakteristisk for en signalsekvens?

Answer 2

Indeholder 13-36 aa-rester
Indeholder 10-15 hydrofobe rester
Har en positivt ladet rest inden de hydrofobe
Nær kløvningssitet er kort-sidekædede aa-rester

Question 3

Beskriv, hvordan eukaryote proteiner dirigeres til ER

Answer 3

På et frit ribosom starter syntesen af proteinet
Som en del heraf syntetiseres signalsekvensen
Signalsekvensen og ribosomet bindes til signal recognition protein, som binder til GTP og sætter proteinsyntesen på pause.
SRP dirigerer komplekset til SRP-receptorer (bundet til GTP) på cytosolsiden af ER. Ved binding til SRP-receptoren kan peptiden føres igennem membranen via peptidtranslokationskomplex der drives af ATP.
SRP dissocierer fra komplekset ved hydrolyse af GTP, og syntesen af peptid kan fortsætte ind i ER-lumen.
Signalsekvensen fjernes af signalpeptidase og ribosomet dissocierer bort, når syntesen er afsluttet.

Question 4

Hvad sker der i ER efter signalsekvensen er fjernet?

Answer 4

Foldning, svovlbroer, glykosylering mv.

Question 5

Hvordan påsættes og bindes oligosakkarider til glykoproteiner?

Answer 5

Påsættes efter opbygning på doclicholphosphat via transferase i ER-lumen. Herefter kan der ske modifikation af sukkersammensætningen
Bindes via Asn-rester gennem N-glukosylering

Question 6

Hvordan virker tunicamycin?

Answer 6

Stoffet efterligner strukturen af UDP-GlcNAc og får cellen til at secernere stoffer, der skulle have været dirigeret til lysosomet.

Question 7

Hvordan syntetiseres oligosakkarider til glykoproteiner?

Answer 7

Et molekyle dolicholphosphat sidder i ER-membranen og 2 UDP-GlcNAc overfører P og 2 GlcNAc. Herefter påsættes mannosemolekyler, og der sker translokation, så sukkerstofferne kommer ind i ER-lumen. Herefter kan sukkerstofsammensætningen ændres, inden der sker påsætning af sukkerstoffet til en Asn-rest og dolicholphosphat genbruges.

Question 8

Hvordan bearbejdes proteinerne, når de er færdige i ER?

Answer 8

I golgi kan de modificeres yderligere og sendes til destinationer, hvilket kan ske via signalpatch som fx et phoshoryleret sukkerstof. Derefter kan vesikler budde med proteinet og en genkendende receptor.

Question 9

Hvilken funktion har chaperoner i proteinlokalisering?

Answer 9

Transporterer precursorproteiner fra cytosol til fx mitochondria.

Question 10

Hvad er NLS?

Answer 10

Nuclear localization sequence: Sekvens på proteiner, der skal til kernen. Sekvensen fjernes ikke. 4-8 aa-rester med flere basiske rester.

Question 11

Hvad koder for PTM og hvad er funktionen af PTM

Answer 11

Generne. Kan være vigtige for foldning, signalering og lokalisering

Question 12

Hvilken sekvens får oligosaccharyltransferase (OST) til er sætte sukker på?
Hvordan er sukkerstoffets core?

Answer 12

Asn-Xaa-Ser/Thr

2 GlcNAc, 9 mannose, 3 glucose

Question 13

Hvilke karakteristika er der for N-glykaner?

Answer 13

Hydrofile og bulky,de støtter foldningen og øger stabilitet

Question 14

Hvad er karakteristisk for O-glykosylering?

Answer 14

Indeholder mellem 3 og 5 sukkerstoffer og har ikke kendt genkendelsessekvens.

Question 15

Hvilken virkning har DTT?

Answer 15

Hæmmer disulfidbrodannelse

Question 16

Hvilke af cellens kompartementer er oxiderende?
Hvilke er reducerende?
Hvorfor?

Answer 16

Ox: Lysosom, ER, Golgi,
Red: Fx cytosol
I cytosol findes fx glutathione, der sørger for at nedbryde ROS

Question 17

Hvilken funktion kan proteolyse have?

Hvor sker proteolytisk modifikation?

Answer 17

Amplifikation af signal, fx i blodkoagulationssystemet.

I Golgi, fx insulin.

Question 18

Hvad er et GPI-anker?

Answer 18

En C-terminal lipidmodifikation, der muliggør at sekretoriske proteiner kan sidde i membranen.

Question 19

Giv eksempler på PTM

Answer 19

Disulfidbindinger 
Signal peptiders kløvning
Zymogenaktivering
Lipidmodifikationer
Phosphorylering
Glykosylering

Question 20

Hvordan kan man se svovlbroer i SDS-PAGE?

Answer 20

Kompakte molekyler med svovlbroer bevæger sig hurtigere end de delvist udfoldede. Man kan derfor lave to SDS-PAGE-undersøgelser i hhv. oxidativt og reduktivt miljø.

Question 21

Hvordan kan man undersøge glykosylering i SDS-PAGE?

Answer 21

Proteinerne får større masse, når de er glykosyleret.

Question 22

Hvordan kan man få isoleret sit målprotein fra en hel masse andre proteiner?

Answer 22

1. Protein i organisme, der danner antistoffer.

2. Udtag serum og analyser med immunoprecipitation/immunoblots/affinitetskromatografi

Question 23

Hvordan fungerer Western-blot/immunoblot?

Answer 23

Kør proteinblanding på en gel og få vha. en spænding proteinerne over på en membran, og brug specifikke antistoffer til at finde målproteinet. Brug antiantistof, dder giver farve eller lign. signal.

Question 24

Hvordan fungerer immunoprecipitation?

Answer 24

Antistof til målprotein tilsættes, og der tilsættes anti-antistof, der gør komplekset uopløseligt. Supernatanten fjernes og målproteinet kan analyseres.

Question 25

Hvad kan pulsmærkning bruges til?

Answer 25

At mærke proteiner syntetiseret i et bestemt tidsinterval og derefter følge deres modifikationer over tid.

Question 26

Hvordan udføres et pulsmærkningsforsøg?

Answer 26

Radioaktive aa tilsættes og inkorporeres i proteiner, indtil der tilsættes stort overskud af umættede aa. Man kan fx mærke i 15 minutter, og herefter starter chase-tiden.
Herefter udtages der prøver til forskellige tider, efter at metabolismen stoppes. Cellen ødelægges, og det relevante protein udfældes med immunoprecipitation og køres på SDS-PAGE for at blive adskilt efter størrelse.

Question 27

Hvad kan TiO2 bruges til?

Answer 27

Binder phosphatgrupper i søjlechromatografi

Question 28

Giv et eksempel på hvordan proteinanalyseproces kan foregå

Answer 28

Ødelæg celler–>SDS-PAGE–>Trypsinkløvning i gel–>TiO2–>MS/MS –>databasesøgnign