Enzimi Flashcards
Cosa sono gli enzimi?
Reazioni biochimiche vengono CATALIZZATE da CATALIZZATORI BIOLOGICI chiamati ENZIMI.
Gli enzimi sono PROTEINE con ATTIVITA’ CATALITICA che necessitano di IONI METALLICI o MOLECOLE ORGANICHE chiamate COFATTORI per essere ATTIVATE.
Cofattori organici: coenzimi (solo in via transitoria)
Oloenzima: enzima + cofattore
Apoenzima: enzima senza cofattore
Gruppo prostetico: cofattore permanentemente attaccato all’enzima
Caratteristiche
DENATURABILI con PERDITA DI ATTIVITA’
IMMUTATI dopo reazioni
ACCELERANO REAZIONI da 10⁶ a 10¹² volte
ELEVATA SPECIFICITA’ per substrati
ATTIVI a pH NEUTRI, T BASSE e P ATMOSFERICI
ATTIVITA’ REGOLABILE
NON INFLUENZANO EQUILIBRIO della reazione
Classificazione enzimi (in base ad attività catalitica)
OSSIDORIDUTTASI: TRASFERIMENTO di ELETTRONI (REDOX). Es. alcol deidrogenasi, NAD⁺
TRANSFERASI: TRASFERIMENTO di GRUPPI FUNZIONALI. Es. esochinasi, ATP
IDROLASI: reazioni di IDROLISI. Es. proteasi
LIASI: ELIMINAZIONE di GRUPPI per generare DOPPI LEGAMI. Es. enolasi
ISOMERASI: SPOSTAMENTO di GRUPPI FUNZIONALI da una posizione a un’altra per formare ISOMERI (isomerizzazione). Es. trioso fosfato isomerasi
LIGASI: formazione di LEGAMI ACCOPPIATA all’IDROLISI di ATP. Es. acetil CoA sintetasi
Diagramma dello stato di transizione
L’EQUILIBRIO di una reazione dipende dalla DIFFERENZA tra l’ENERGIA LIBERA dei DUE COMPOSTI allo STATO BASALE.
Grafico: energia libera rispetto alla coordinata di reazione.
ENERGIA DI ATTIVAZIONE ∆G‡ = E stato basale - E x‡
E stato basale P < E stato basale S quindi ∆G°’<0 e la reazione favorisce la formazione di P
La VELOCITA’ DI REAZIONE dipende dall’ENERGIA DI ATTIVAZIONE: ALTA ∆G‡ BASSA VELOCITA’ (no enzimi: velocità aumenta con alte T e P)
Catalisi enzimatica
Aggiungere ENZIMA alla reazione AUMENTA la VELOCITA’ DI REAZIONE.
Enzima si lega a substrato formando il COMPLESSO ATTIVATO ENZIMA-SUBSTRATO (ES), che entra nello STATO DI TRANSIZIONE che è più BASSO di quello della REAZIONE NON CATALIZZATA, per formare i prodotti.
Gli enzimi si legano al substrato in modo transiente e ne abbassano l’energia di attivazione (grafico).
La ROTTURA dei legami del COMPLESSO ES libera ENERGIA DI LEGAME che permette la formazione dei PRODOTTI.
Un CATALIZZATORE abbassa l’energia di attivazione della STESSA ENTITA’ sia per la REAZIONE DIRETTA che per quella INVERSA. La DIREZIONE della reazione dipende dai ∆G:
∆G<0 S→P
∆G>0 P→S
Modelli per l’interazione enzima-substrato
Enzima deve essere COMPLEMENTARE allo STATO DI TRANSIZIONE che il substrato deve raggiungere per poter essere convertito in prodotto.
ADATTAMENTO INDOTTO: dopo la formazione di ES l’ENZIMA CAMBIA FORMA e il SITO ATTIVO assume una FORMA COMPLEMENTARE al SUBSTRATO. In questo modo i gruppi funzionali specifici dell’enzima si trovano in posizione corretta per la catalisi
CHIAVE-SERRATURA: l’ENZIMA è una SERRATURA che ha bisogno di una CHIAVE SPECIFICA rappresentata da UNA SOLA molecola di SUBSTRATO che ha la FORMA GIUSTA per entrare nel sito attivo e far avvenire la reazione
Siti attivi
Regioni a forma di FESSURA o TASCA che instaurano LEGAMI con il SUBSTRATO. Sono costituiti da pochi aa che hanno una CONFIGURAZIONE COMPLEMENTARE a quella del SUBSTRATO. Sono presenti:
1. Catene laterali di aa idrofobici (ambiente privo di acqua ideale per reazione)
2. Catene laterali di aa polari (legami deboli con substrato che si posiziona nel sito attivo)
3. Catene laterali di aa polari cariche (funzione di reattività catalitica)
Cinetica enzimatica
Studia la VELOCITA’ DI REAZIONE e il MECCANISMO DI REAZIONE.
VELOCITA’ DI REAZIONE: quantità di SOSTANZA CONSUMATA o PRODOTTA nell’unità di tempo.
Grafico: quando è presente tutto il substrato la velocità ha un ANDAMENTO RETTILINEO. A mano a mano che il substrato viene consumato la VELOCITA’ RALLENTA fino ad arrivare ad un PLATEAU quando tutto il substrato è stato convertito in prodotto (la [S] varia durante il corso di una reazione)
Cinetica di saturazione
Condizione in cui TUTTO l’ENZIMA è SATURATO con il substrato e altre aggiunte di SUBSTRATO NON VARIANO la VELOCITA’.
Grafico: [S] in funzione di Vo rappresenta una CURVA IPERBOLICA. Nel primo TRATTO RETTILINEO della curva Vo è DIRETTAMENTE PROPORZIONALE a [S], la [S] è BASSA e la maggior parte dell’ENZIMA è LIBERO.
AUMENTANDO la [S] AUMENTA la quantità di ENZIMA che si lega al SUBSTRATO nel complesso ES.
Quando TUTTO l’E si trova nel complesso ES (saturato) la VELOCITA’ raggiunge un VALORE MASSIMO (Vmax) e rimane COSTANTE
Cinetica di Michaelis-Menten
Descrive l’andamento della VELOCITA’ di una reazione catalizzata da ENZIMI al VARIARE della [S].
All’aumentare di [S] la velocità della reazione aumenta fino a raggiungere un massimo (Vmax).
La velocità viene misurata solo nei primi minuti in modo da poter trascurare la reazione inversa.
La trasformazione di ES in E+P è la TAPPA LIMITANTE quindi la VELOCITA’ DI CATALISI dipende dalla VELOCITA’ DI TRASFORMAZIONE di ES in E+P secondo k3: v=k3[ES].
Formule km e vo: equazione di Michaelis-Menten.
Km corrisponde alla [S] alla quale la VELOCITA’ è UGUALE a 1/2 Vmax.
Km esprime l’AFFINITA’ che l’ENZIMA ha per il SUBSTRATO
Km BASSA: piccola [S] per saturare metà dell’enzima. ALTA AFFINITA’
Km ALTA: alta [S] per saturare metà dell’enzima. BASSA AFFINITA’
Km è la [S] alla quale la META’ dei SITI per il SUBSTRATO sono SATURATI.
Vmax consente di calcolare il NUMERO DI MOLECOLE di S CONVERTITE in P nell’unità di tempo da una molecole di E quando l’ENZIMA è tutto SATURATO.
Formule.
K3: COSTANTE CATALITICA Kcat. Esprime il NUMERO di TURNOVER dell’ENZIMA.
Kcat/Km COSTANTE DI SPECIFICITA’
Efficienza con cui vengono trasformati substrati diversi
Tiene conto di Kcat e Km
Efficienza catalitica dell’enzima (valori compresi tra 10⁸ e 10⁹ M⁻¹ s⁻¹)
Elaborazione di Lineweaver-Burk
Grafico per CALCOLARE Vmax e Km che permette anche di determinare il meccanismo d’azione degli INIBITORI enzimatici.
Permette di LINEARIZZARE l’EQUAZIONE della VELOCITA’ tramite il calcolo dei DOPPI RECIPROCI
Formule e grafici
Concentrazione enzima
Vo è direttamente proporzionale alla [E]. Si può misurare l’attività di un enzima misurando la Vmax e utilizzando una [S] saturante monitorando i primi minuti quando tutto il substrato è disponibile
Attività: concentrazione espresso come unità per volume i g di peso fresco o secco
Unità enzimatica: quantità di enzima che trasforma 1 mole di S in 1 minuto a 25°C
pH
Enzimi hanno un pH ottimale a cui la loro attività è massima. Valori estremi di pH possono denaturare l’enzima
Temperatura
Enzimi hanno una T ottimale a cui esprimono massima attività che si ha in un intervallo intorno ai 40°C. A T superiori si ha la denaturazione dell’enzima.
(velocità cresce al crescere della T, raggiunge un massimo e poi diminuisce)
Inibitori
Molecole o ioni che competono con il substrato per legarsi all’enzima e inibirne l’attività. L’inibizione può essere reversibile o irreversibile
Inibitori reversibili
Consentono all’enzima di RECUPERARE la FUNZIONALITA’ BIOLOGICA.
Possono essere COMPETITIVI, NON COMPETITIVI e INCOMPETITIVI o ACOMPETITIVI
Inibizione competitiva
Un inibitore competitivo COMPETE con il SUBSTRATO per il LEGAME con l’enzima: quando I si lega al sito attivo dell’E IMPEDISCE il LEGAME di S quindi la catalisi.
Schema
I è strutturalmente simile a S e si combina con l’E formando complessi EI che NON danno luogo alla CATALISI.
Equazione di M-M in presenza di un inibitore competitivo.
α: fattore di inibizione è proporzionale a [I] quindi più [I] è presente maggiore sarà l’inibizione quindi α.
Se la Ki (costante di inibizione) è alta il rapporto [I]/Ki sarà più basso quindi il valore di α si approssima a 1 e non c’è inibizione.
Dal momento che l’inibitore è reversibile, aumentando la [S] si può superare l’inibizione poiché se [S]>[I] la probabilità che I si leghi a E diminuisce e la reazione raggiunge Vmax.
Aumentando la quantità di I aumenta l’inibizione.
Grafici.
Apparentemente ci vuole più S per raggiungere la Vmax ma è solo una Km apparente dovuta alla presenza dell’I in quanto parte dell’E è saturato dall’I (non è una questione di affinità fra E e S)
Siccome la Vmax rimane INALTERATA anche 1/2Vmax sarà uguale ma CAMBIA la Km che è AUMENTATA di un fattore α.
Se α=1 NON c’è INIBIZIONE perché [I]=0, quindi [I]/Ki=0 e α=1: REAZIONE ENZIMATICA NON INIBITA
Se α=2,3,4 ecc. c’è INIBIZIONE, la curva si APPIATTISCE e ci vuole più [S] per arriva a 1/2Vmax quindi AUMENTA la Km APPARENTE (Km maggiore: maggiore pendenza della curva, minore affinità tra E e S)
Inibizione non competitiva (mista)
Si ha quando l’I si lega REVERSIBILMENTE a residui amminoacidici dell’E in un SITO DIVERSO dal SITO ATTIVO. Questo causa una DEFORMAZIONE del SITO ATTIVO che può ancora ricevere S ma NON è più in grado di TRASFORMARLO in P.
L’enzima presenta DUE SITI che possono legare il substrato e l’inibitore.
Quindi E lega S formando ES ma può legare anche I in un sito adiacente formando EI. Questo determina una modifica parziale del sito del substrato che comunque si lega e si forma ESI che è INATTIVO.
Quindi solo la quota di E che ha legato S (ES) può andare avanti e formare P.
Equazione inibizione mista.
Quando c’è l’inibitore si abbassa la quantità di E funzionale che è quello che si lega a S per continuare la catalisi.
INIBIZIONE NON COMPETITIVA PURA: E e il complesso ES legano I con la STESSA AFFINITA’ quindi Ki=Ki’ e α=α’.
Quindi Km è INALTERATA perché ci sono due siti diversi a cui si legano S e I: la CAPACITA’ DI LEGAME NON ne RISENTE ma la CATALISI SI.
Vmax DIMINUISCE perché c’è MENO ES PRODUTTIVO: sottraendo ES non si arriva a Vmax.
Grafici e formule
Inibizione incompetitiva o acompetitiva
L’enzima non ha un sito pronto per legare I però quando E lega S genera un SITO che è RICONOSCIBILE da I. In questo modo l’I si lega e si forma ESI che NON è ATTIVO.
Equazione.
Vmax DIMINUISCE perché il complesso ES è BLOCCATO.
Km DIMINUISCE.
All’inizio della reazione quando c’è libero, S e I, la prima cosa che succede è la formazione di ES poi inizia l’effetto dell’I.
Grafici e formule
Inibitori irreversibili
Si legano con un LEGAME COVALENTE ad un residuo di aa nel SITO ATTIVO dell’enzima MODIFICANDOLO in modo IRREVERSIBILE a ANNULLANDONE l’ATTIVITA’.
Sono anche detti INIBITORI SUICIDI: sono in grado di legare solamente l’enzima formando il complesso EI però siccome il legame è covalente la [S] non è in grado di recuperare l’inibizione.
Se [I]<[Etot]
Vmax DIMINUISCE: si forma meno ES produttivo (meno E disponibile)
Km INVARIATA: E che resta attivo non è inibito
Allosteria
Enzima con più subunità.
L’enzima ha due subunità: una catalitica C e una regolatoria R. Quando le due subunità sono LEGATE tra loro l’ENZIMA NON è MOLTO ATTIVO. Per la COMPLETA ATTIVITA’ bisogna che venga LEGATO il SUBSTRATO e un MODULATORE o EFFETTORE che AUMENTA l’ATTIVITA’ ENZIMATICA.
In presenza del MODULATORE, questo si lega alla SUBUNITA’ R e quando la SUBUNITA’ C lega il SUBSTRATO si forma il complesso ES che è ATTIVO. Il modulatore va a regolare l’attività dell’enzima.
Negli enzimi multimerici non basta il legame del substrato ma l’attività deve essere regolata dall’esterno da effettori o modulatori allosterici.
In alcuni casi il modulatore provoca una maggiore attività dell’enzima mentre in altri casi provoca inibizione se il modulatore altera il sito attivo non rendendo l’enzima funzionante.
Gli EFFETTORI ALLOSTERICI sono REVERSIBILI perché i legami tra l’effettore e l’enzima sono deboli
Modulazione covalente/allosterica
Consiste nella MODIFICAZIONE dell’ENZIMA con la formazione di un LEGAME COVALENTE fra un GRUPPO ALCOLICO OH della catena laterale di un aa e un REAGENTE (cambio conformazionale di tipo allosterico. Es. fosforilazione, defosforilazione)
Vie metaboliche
Insieme di reazioni catalizzate da enzimi che si susseguono. Sono regolate da
INIBIZIONE DA PRODOTTO: feedback negativo. Il prodotto E va a inibire l’attività dell’enzima che va da A a B. Se la [E] è sufficiente a soddisfare il fabbisogno sarà proprio E ad andare ad inibire il primo enzima che ne regola la produzione. In questo modo si evita che si producano i composti intermedi e gli enzimi
ATTIVAZIONE DA SUBSTRATO: il substrato A si comporta da effettore allosterico per l’enzima che porta da C a d producendo un’attivazione. Serve ad accelerare la via metabolica
